Name: Mouse e humanos derivada de cultura de monocamada epitelial gástrica primária para o estudo da regeneração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprenda a estabelecer culturas de monocamada epitelial gástrica primária derivadas de camundongos e humanos para estudos de regeneração e cicatrização de feridas. Este método permite investigar mecanismos de migração celular em escala.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 conceder (YZ).

Para evitar contaminação, realize o protocolo na sua totalidade dentro de um capuz de cultura de tecido estéril. Tecido humano gástrica foi coletado de pacientes submetidos à gastrectomia de manga de acordo com o protocolo aprovado da Universidade de Cincinnati IRB (número de protocolo do IRB: 2015-4869). Todos os estudos de rato foram aprovados pela Universidade de Cincinnati institucional cuidados com animais e uso Comité (IACUC) que mantém uma associação americana de avaliação e acreditação do laboratório Animal conta (AAALAC) facilidade.
1. estabelecer Organoids gástrica gástrico 3D humanos-derivado
Nota: Este protocolo é baseado em pesquisa publicada anteriormente neste laboratório8.
<ol><li>Prepare a mídia de organoides 3D que consiste de mídia de R-spondin condicionado condicionado Wnt e 20% 50%.<ol>
<li>Preparar a mídia Wnt condicionado, cultura de células em meio de crescimento de Wnt L (Dulbecco modificada do Eagle médio (DMEM), 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina/estreptomicina) por 7 dias, colha o médio e filtrar usando um filtro de 0,22 µm.</li>
		<li>Prepare a mídia R-spondin condicionado. Crescer uma modificado HEK-293T R-spondin secretando linha celular em meio de crescimento R-spondin (Dulbecco modificada do Eagle médio (DMEM), 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina/estreptomicina). Em cima do acessório após 2 h, alterar o meio destas células para crescimento OPTIMEM médio, 1% penicilina/estreptomicina. Cultura das células durante 7 dias. Em seguida, colher os meios de comunicação de R-spondin condicionado e filtrar usando um filtro de 0,22 µm. Nota: Este protocolo tem sido publicado anteriormente e por um protocolo mais detalhado consulte a 6,7,8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Descongelar o fator de crescimento reduzido, vermelho de fenol-livre da membrana basal matrix para 16 h no gelo a 4 ° C. Coletar o tecido em que o gelo frio de Ca2 +/ mg2 +-free DBPS em um grande recipiente de plástico. Armazenar no gelo até o passo de início 1.4. Nota: O tecido é coletado de pacientes submetidos à gastrectomia de manga.</li>
	<li>Usando fórceps, lave o tecido vigorosamente num copo estéril contendo 100ml Ca2 +/ mg2 +-livre fosfato Buffered Saline (DPBS de Dulbecco). Lave por aproximadamente 30 s ou até os detritos e o sangue foi removido. Em seguida, usando gaze estéril, limpe a camada mucosa do epitélio.</li>
	<li>Usando grandes pinças, firmemente agarrar a camada muscular do tecido e com força, raspar o epitélio usando a pinça hemostática curva grande. Colete os fragmentos epiteliais raspados em uma placa de Petri estéril, poliestireno.</li>
	<li>Picar o tecido epitelial em aproximadamente 2.0 x 2.0 mm2 tamanho fragmentos usando lâminas de barbear para otimizar a digestão do tecido. Lave os fragmentos de tecido com Ca2 +/ mg2 + -free DBPS suplementadas com antibióticos (Ca2 +/ mg2 + -livre DPBS, 1% penicilina/estreptomicina, 0,25 mg/mL de anfotericina B 10 mg/mL de gentamicina, canamicina de 50 mg/mL), até a lavagem é livre de sangue. Execute múltiplas lavagens, se necessário. Descarte fora a lavagem filtrando cuidadosamente a lavagem através de uma gaze estéril para um copo de resíduos.</li>
	<li>Lavado recolher fragmentos em um vidro de 125 mL redonda balão de fundo com uma barra de agitação de 25 mm e incubação pré-aquecido media (mídia basal suplementada com 2 mM L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina, 10 mM de tampão HEPES, 1 mg/mL colagenase tipo 1, cultura de células de 2 mg/mL grau de albumina de soro bovino). Sele o balão de fundo redondo com septos de borracha.</li>
	<li>Inserir uma agulha espinhal 20g os septos e conectá-lo a um tanque de oxigênio com mangueira de borracha. Para filtrar contaminantes, inserir papel de tecido para o tubo para criar um filtro. Ligue a saída de oxigênio na baixa. Inserir agulhas de saída de 10-15 os septos para evitar a ruptura dos septos.</li>
	<li>Fixar o conjunto acima para uma posição de anel usando grampos e colocá-lo num banho de água calibrado a 37 ° C, com uma placa de agitação por 30-45 min. Depois que o tecido tem sido incubando por 15 min, remova 50 µ l de mídia de incubação e verifique visualmente a glândulas dissociadas. Se as glândulas não são densas ou não tem separado do tecido, deixe para um adicional 5-10 min.</li>
	<li>Imediatamente após a incubação, adicionar 50 mL pré-aquecido DMEM/F12 para mídia de incubação usando uma pipeta estéril e serológica ou derramando diretamente na mistura de incubação.</li>
	<li>Filtre a mistura da glândula através de uma gaze estéril para quatro tubos de Erlenmeyer de 50 mL. Mantenha o filtrado no gelo por 15 min permitir glândulas extraídas resolver a parte inferior do tubo cónico. Tenha cuidado para não perturbar as glândulas resolvidas, remova e descarte do topo 40 mL do sobrenadante com uma pipeta sorológica. Resuspenda os restante 10 mL em 10 mL de DPBS suplementadas com antibióticos.</li>
	<li>Distribua a mistura uniformemente em tubos de ensaio de cultura de células de 5ml. Centrifugue por 5 min a 65 x g a 4 ° C e remover o sobrenadante cuidadosamente usando uma pipeta. Resuspenda o pellet de glândula na matriz descongeladas membrana basal usando uma pipeta ou uma ponta de pipeta ampla 200 µ l. Misture até homogênea. Nota: É fundamental para executar essa etapa no gelo e para evitar a polimerização da matriz da membrana basal, enquanto mistura. Além disso, é importante inspecionar visualmente a densidade da glândula por amostragem para 50 µ l. A densidade ideal é a confluência de ~ 70%.</li>
	<li>Em seguida, placa as glândulas em 50 µ l de membrana basal matriz usando uma pipeta de ponta larga. Evite produzir quaisquer bolhas enquanto chapeamento.</li>
	<li>Para permitir que a matriz da membrana basal polimerizar, incubar durante 10-15 min a 37 ° C. Se chapeamento em uma placa de cultura de 12 poços, adicionar 1 mL de mídia hFGO (modificado águia médio/F12 meio do Advanced Dulbecco suplementado com 2mM L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina, 0,25 mg/mL de anfotericina B 10 mg/mL de gentamicina, 50 mg/mL canamicina, 10 mM HEPES Tampão, n-Acteylcystine de 1 mM, 1 x 1 x B27, médio de Wnt-condicionados de 50%, 20% R-spondin-condicionado suplementado com 100 ng/mL de N2, osso inibidor de Proteína morfogenética, gastrina nM 1, 50 ng/mL, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento de fibroblastos de 200 ng/mL 10, 10 mM, nicotinamida e inibidor de Y-27632 ROCK 10 µM) por poço. Se não usando uma placa de cultura de 12 poços Adicionar suficiente mídia para submergir a bolha de matriz de membrana basal.</li>
	<li>Cultura das células a 37 ° C numa incubadora de cultura 5% CO2 célula umidificado. Mudar a mídia todos os dias 4-5.</li>
</ol>2. estabelecimento de Organoids gástrica gástrico 3D Mouse-derivado
Nota: Este protocolo tem sido publicado anteriormente 6. Descongelar a matriz da membrana basal no gelo e preparar todos os reagentes antes de começar.
<ol><li>Sacrificar os ratos usando um método aprovado pela instituição de pesquisa onde a pesquisa está sendo executada. Remover o estômago do rato e dissecar de acordo com os protocolos anteriormente publicados 6. Lavar em 20 mL gelo frio Ca2 +/ mg2 +-livre DBPS. Nota: Camundongos C57BL/6, com idades entre 8-10 semanas, são utilizados para culturas de organoides gástrico gástrica. Os ratos foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical manual antes da remoção do estômago.</li>
	<li>Retirar a camada muscular do estômago e qualquer vasos sanguíneos visíveis como anteriormente publicado 6.</li>
	<li>Separe o fundo do antro e forestomach usando uma lâmina de barbear estéril. Corte fundo usando pequenas tesouras cirúrgicas em fragmentos aproximadamente 2.0 x 2.0 mm. usando fórceps, coletar os fragmentos em um tubo cônico de 15 mL contendo EDTA buffer de incubação (Ca2 +/ mg2 +-livre DPBS, 5 mM EDTA) e incube a 4 ° C por 2 h com leve agitação.</li>
	<li>Em uma capa de estéril, deixar o tubo cônico e fragmentos de gelo aproximadamente 5 min. usam uma pipeta para remover tanto tampão de incubação possível deixando fragmentos intocado. Adicionar 5 mL de tampão a tremer (1 g de D-Sorbitol, sacarose 1,47 g em 100 mL Ca2 +/ mg2 +-free DPBS) e apertar à mão com uma força de 2 min. permitir que os fragmentos grandes para se estabelecer e com pressa, usando uma pipeta de 1000P, remover os pequenos fragmentos que ainda têm de resolver na camada superior.</li>
	<li>Gire os fragmentos removidos por 5 min a 4 ° C a 65 x g.</li>
	<li>Evitando as bolhas de ar, remover o sobrenadante, resuspenda na matriz da membrana basal e misture até ficar homogêneo.</li>
	<li>Use uma pipeta de ponta ampla para a matriz de membrana basal em 50 µ l por alvéolo da placa e então incubar a 37 ° C por 20 min.</li>
	<li>Adicionar mídia de crescimento bastante mFGO (Advanced Dulbecco modificado suplementado com 2mM L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina, 10mm médio/F12 águia tampão HEPES, 1mm n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, meio de Wnt-condicionado 50%, 20% R-spondin-condicionado suplementado com inibidor da Proteína morfogenética óssea da 100 ng/mL, 10 gastrina nM, 50ng/mL de fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento de fibroblastos de ng/mL 10 10 e inibidor de Y-27632 ROCK 10 µM) para submergir a bolha.</li>
	<li>Cultura das células a 37 ° C, a incubadora cultura 5% CO2 célula umidificado. Altere os meios de comunicação a cada 4-5 dias.</li>
</ol>3. revestimento colágeno para transferência 2D
Nota: Execute todos os procedimentos em uma capa de cultura de tecido estéril, a menos que especificado de outra forma. Começa o revestimento 24h antes de transferir o organoids 3D para a monocamada de colágeno. Manter o colagénio de cauda de rato no gelo e protegido da luz. Placas revestida de colágeno são bons por até 2 semanas. Se não utilizar as placas revestidas imediatamente, embrulhe o prato no parafilm e loja a 4 ° C, até que seja necessário.
<ol><li>Dilua o colágeno de cauda de rato para 50 µ g/mL com 20 mM de ácido acético.</li>
	<li>Cobrir suficientemente a superfície do poço com colágeno diluído. Para um bem em uma placa padrão de 12, casaco com aproximadamente 1 mL de colágeno. Deixe durante a noite à temperatura ambiente em um capuz estéril.</li>
	<li>Lave duas vezes com 1 mL Ca2 +/ mg2 +-livre DPBS por alvéolo e deixar descobertos para 2 h à temperatura ambiente em um capuz estéril.</li>
</ol>4. membrana basal revestimento de matriz para transferência 2D
Nota: Execute todos os procedimentos em uma capa de cultura de tecido estéril, a menos que especificado de outra forma. Matriz de membrana basal revestimento 2 h antes de transferir o organoids 3D para a monocamada de começar. Manter a matriz da membrana basal no gelo. Placas revestidas devem ser usados imediatamente e não podem ser armazenadas por um período prolongado de tempo.
<ol><li>Diluir a matriz da membrana basal em um tubo cônico de 15 mL, com uma água de grau de cultura de célula em uma 01:10 proporção. Dilua no gelo.</li>
	<li>Usando uma pipeta adicionar 100 µ l de matriz diluídos membrana basal a cada poço de uma placa padrão de 12. Com uma espátula de célula, distribua uniformemente a matriz diluídos da membrana basal em todo o poço para um casaco mesmo.</li>
	<li>Incube a 37 ° C, durante 1 h.</li>
	<li>Remover a água residual com uma pipeta e secar à temperatura ambiente durante 1 h antes de transferir o organoids 3D.</li>
</ol>5. transferência de m/hFGOs 3D para 2D monocamadas de células epiteliais gástricas
<ol><li>Depois 3D mouse ou humanos derivada de que fgos têm sido cultivadas por 6-7 dias, iniciar a transferência de organoids 3D para a 2D monocamada. Nota: Para cada poço de uma monocamada exigido é recomendável usar 300 organoids intactas ou única células derivadas de 300 organoids. Em uma robusta cultura espera-se obter aproximadamente 150 organoides/poço dentro de uma placa de cultura bem 12.</li>
	<li>Certifique-se de que as placas são revestidas antes da transferência. Nota: As placas de matriz revestido de membrana basal tem uma camada de gel transparente, no entanto, placas de colágeno revestida não terá qualquer indicação óbvia do revestimento.</li>
	<li>Deslocar a bolha de matriz 3D da membrana basal da placa pipetando diretamente 1ml estéril Ca2 +/ mg2 +-free DBPS para o centro da bolha.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta, recolha a mistura de matrix e organoides membrana basal em tubos de ensaio de cultura de células. Recolha a uma proporção de 2 bolhas de matriz de membrana basal por tubo. Centrifugue por 5 min em 40 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Usando um sistema de vácuo, remover o sobrenadante e quanto muito matriz de membrana basal quanto possível. Resuspenda em 4 mL de Ca2 +/ mg2 +-livre DBPS, remover o sobrenadante e repita 2 - 3 vezes. Para o protocolo de transferência de organoides inteiro, vá para a etapa 5.10. Vá para a etapa 5.7 para o protocolo de suspensão de célula única.</li>
	<li>Pré-aquecer a solução de desprendimento celular a 37 ° C e adicionar 1 mL de cada tubo de ensaio. Misture suavemente por inversão de tubos ou pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C.</li>
	<li>Adicionar 2 mL de Ca2 +/ mg2 +-livre DBPS diretamente para cada tubo de ensaio.</li>
	<li>Use uma agulha 26G e seringa de mistura de 2 - 3 vezes. Verifique visualmente para células individuais. Seringa de 1-2 vezes mais se ainda houver organoids ou aglomerados de células.</li>
	<li>Centrifugar 40 x g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet em 2D mídia FGO (meio de crescimento do mouse 2D FGO: meio de médio/F12 Eagle modificado do Dulbecco avançado suplementado com 2mM L-glutamina, 10 mM penicilina/estreptomicina, 10% soro Fetal do bezerro, 10mm tampão HEPES, 1 x N2, 1 x B27, suplementado com 10 gastrina nM, fator de crescimento epidérmico de 50 ng/mL, 1 inibidor de TGF-β µM e inibidor de Y-27632 ROCK 10 µM. 2D meio de crescimento humano FGO: Meio de médio/F12 Eagle modificado de Dulbecco avançada suplementado com 2mM L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina, 10mm tampão HEPES, 10% soro Fetal do bezerro, 10mm nicotinamida, 1 x N2, 1 x B27, suplementado com 50mg/mL canamicina, 50 ng/mL crescimento epidérmico Fator e inibidor de Y-27632 ROCK 10 µM, 1 µM TGF-β inibidor).</li>
	<li>A ressuspensão em placas revestidas de chapa. Incubar as placas a 37 ° C. Substitua a mídia cada 4 dias ou mais cedo se a mídia fica amarela. Monocamada requer aproximadamente 4 dias para o formulário.</li>
</ol>6. Raspe ferida ensaio usando monocamadas de células epiteliais gástricas 2D
<ol><li>Usando uma lâmina de barbear, arranhe a monocamada, quando a cultura chegou a confluência de 100%.</li>
	<li>Corrigi monocamadas usando formol 3,7% durante 15 minutos à temperatura ambiente. Permeabilize com detergente não-iônico 0,5% / PBS por 20 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Em seguida, bloquear monocamadas com soro de burro de 2% por 1h à temperatura ambiente e incubar com diluição de 1: 1000 de H+, K+-ATPase anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, lavar com detergente não-iônico de 0.1% / PBS e incubar com diluição de 1: 100 de burro anticorpo secundário anti-rato 488 e 10μg/mL de núcleos de células de Hoechst mancham por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Para identificar as células de superfície mucosa poço em culturas 2D monocamada gástrico humano-derivado, mancha de células com 20 μg /mL de conjugado FITC Ulex europaeus (UEAI). Monocamadas de imagem em um microscópio confocal.</li>
	<li>Com imagens da ferida cada poucos h. zero será re-epithelialize entre 24-48 h, dependendo da qualidade da monocamada e variação entre os pacientes.</li>
</ol>

<ol><li>Nagy, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+regulates+cellular+migration+and+apoptosis+by+activation+of+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling.</a> J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O atual protocolo detalha a criação de monocamadas de epitelial gástrica humanos e rato-derivados que podem ser usados para ensaios de zero-ferida. O protocolo depende do conceito de células-tronco residentes tecidos de isolamento de humanos primários (ou mouse) e é um protocolo modificado publicado pela primeira vez por Schlaermann et al.7. Em particular, temos otimizado o protocolo aqui para estabelecer uma confluente e polarizada gástrica monocamada epitelial que expressa o major celul...

O uso de ensaios de zero-ferida é um método popular para o estudo de reparo e regeneração1,2,3,4,5,6. A metodologia proposta pode ser usada para estudar especificamente a regeneração gástrica e a colonização de Helicobacter pylori . No passado, linhas de células de câncer gástrico têm sido usadas como um meio para estudar de1,de infecção de Helicobacter pylori (H. pylori)2 e até câncer gástrico recentemente linhas de células como as células AGS foram favorecidos1 ,2,3,4. Uma limitação das culturas de células de câncer gástrico é sua incapacidade de recapitular a diversidade celular do epitélio gástrico. Para tentar resolver essa limitação, demonstrado que aqui é a criação e transferência de primários humanos e rato derivada de 3-dimensional gástrica gástrica organoids (FGOs) para uma monocamada epitelial gástrica para ensaios de cura ferida com base em um método modificado primeiro descrita por Schlaermann et al. 7 Nós demonstramos que gástrico monocamadas epiteliais derivadas cisalhadas 3D FGOs gástricas ou FGO-derivado de células únicas retêm uma composição celular polarizada que representa perto de epitélio gástrico in vivo. Dado que linhas de células de câncer gástrico não demonstrar a composição da célula que exibe esta técnica, o protocolo atual tem uma vantagem sobre os métodos de ensaio alternativos de zero-ferida. Esta metodologia foi otimizada pelo qual monocamadas podem ser estabelecida de toda organoids ou de uma suspensão de célula única de organoids dissociada e chapeado usando uma matriz de membrana basal ou revestimento de colágeno. O objetivo geral do presente protocolo é estabelecer que um organoides derivado de culturas de monocamada epitelial gástrica para um ensaio de cura ferida novela.

<table><tbody><tr><td>Meio Eagle/F12 modificado pela Advanced Dulbecco (meio basal)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-glutamina)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B/Gentamicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>R01510</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>RO1510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>n-Acetilcistina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de BMP (Noggin)</td> <td>Pepro Tech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Pepro Tech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Inibidor de ROCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; Inibidor</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+ -free DPBS</td><td>Fisher</td><td>21-031CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>FBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22&micro; Filtro M</td><td>Fisher</td><td>099-720-004</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Banho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo 1</td><td>Worthington&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004214</tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes (papel de seda)</td><td>Fischer Scientific</td><td>06-666C</td><td></td></tr><tr><td>125 mL frasco</td><td></td><td></td><td></td>de fundo redondo</tr> 1 <tr><td>pol (25 mm) barra</td><td></td><td></td><td></td>de agitação</tr><tr><td>Septos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de Borracha Gaze Estéril</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td><td></td>de agitação</tr><tr><td>Suporte</td><td></td><td></td><td></td></tr> de anel <tr><td>Anel de suporte Braçadeiras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Placa <td></td><td></td><td></td>de<td>Petri estéril</td></tr><tr><td>18 G agulhas de 1,5 de comprimento</td><td>Thermo Fisher</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20 G agulhas espinhais de 3,5 de comprimento</td><td>Thermo Fisher</td><td>405182</td><td></td></tr><tr><td>placa tratada com cultura de células de 12 poços</td><td>Midwest Scientific</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Reduzido, Fenol Vermelho MatrigelTM (Matriz de membrana do porão)</td>Lâminas de Barbear Estéreis <td>Fisher</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de ponta larga Pinças</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>hemostáticas curvas</td></tr><tr><td>200 &micro; Pontas de pipeta L largas</td><td>Thermo Fisher</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensaio de cultura de células de 5 mL</td> Tanque de oxigênio <td>Fisher</td><td>14-956-3C</td><td></td></tr><tr><td>com mangueira de</td><td></td><td></td><td></td>borracha</tr><tr><td>1 g D-Sorbitol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher</td><td>SS-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td>de dissecação</tr><tr><td>Bandeja</td> <td>de dissecação</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa</td><td></td><td></td><td></td>de balanço</tr><tr><td>Rabo de Rato Colágeno Tipo 1</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Grau de cultura de células ácido acético glacial</td><td>Fisher</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau de cultura de células</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de câmara de 2 poços</td><td>Thermo Fisher</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>12 poços Transwell (inserções de membrana de poliéster)</td> <td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Corning</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (solução de desprendimento celular)</td> <td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>263/8 G seringa</td><td>Thermo Fisher</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>lâmina</td><td></td><td></td><td></td>de barbear</tr><tr><td>L Cells</td><td>As células L, uma linhagem celular produtora de Wnt3a, foram recebidas como um presente do Dr. Hans Clevers (Instituto Hubrecht de Biologia do Desenvolvimento e Pesquisa de Células-Tronco, Holanda). &nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T Células secretoras de rspondina</td><td>Uma linha celular secretora de R-espondina HEK-293T modificada foi obtida do Dr. Jeff Whitsett (Seção de Neonatologia, Biologia Perinatal e Pulmonar, Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati e Faculdade de Medicina da Universidade de Cincinnati, Cincinnati, EUA). &nbsp; &nbsp;</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>HK-ATPase Anticorpo primário</td><td>Invitrogen</td><td>SC-374094</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherinn</td><td>SantaCruz</td><td>sc-59778</td><td></td></tr><tr><td>UEA1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 488 anticorpo secundário (anticorpo secundário anti-rato burro 488)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37114</td><td></td></tr></tbody></table>

mouse e humanos derivada de cultura de monocamada epitelial gástrica primária para o estudo da regeneração

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Estudos in vitro de reparação da ferida gástrico normalmente envolve o uso de linhas de células de câncer gástrico em um ensaio de zero-ferida de migração e proliferação celular. Uma limitação crítica desses ensaios, no entanto, é sua variedade homogênea de tipos celulares. Reparo é um processo complexo, que exige a interação de vários tipos de células. Portanto estudar uma cultura desprovida de subtipos celulares, é uma preocupação que deve ser superada, se quisermos entender o processo de reparação. O modelo de organoides gástrica pode aliviar esse problema pelo qual a coleção heterogênea de tipos de células intimamente reflete de epitélio gástrico ou outros tecidos nativos em vivo. Demonstrado aqui é um romance, em vitro ensaio zero-ferida derivada de humanos ou rato organoids 3-dimensional que pode então ser transferidos para uma monocamada epitelial gástrica como qualquer organoids intacta ou como uma suspensão de célula única de dissociado organoids. O objetivo do protocolo é estabelecer monocamadas de epiteliais gástricas organoides-derivados que podem ser usadas em um sistema de romance ensaio de zero-ferida para estudar regeneração gástrica.

Organoids foram derivadas do corpo/corpo do ser humano ou do fundo dos tecidos estômago do rato (figura 1A). Depois da digestão de EDTA de humanos ou do mouse derivada de tecido de estômago ou colagenase respectivamente, glândulas são incorporadas em matriz da membrana basal e cultivadas por 6-7 dias (figura 1A). Figura 1B demonstra a formação de derivados humanos gástrica organoids (huFGOs) que em s...

Aqui descrevemos um protocolo para o estabelecimento e cultivo humano e rato derivada de 3-dimensional organoids gástrica (3D) e o método de transferência de organoids 3D para um monolayer 2-dimensional. O uso da monocamada epitelial gástrica como um romance ensaio de zero-ferida para estudos de regeneração também é descrito.

Mouse e humanos derivada de cultura de monocamada epitelial gástrica primária para o estudo da regeneração

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

O objetivo geral deste sistema de cultura é gerar uma monocamada gástrica primária derivada de camundongos ou humanos para o estudo da regeneração em um ensaio de cicatrização de feridas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo gástrico, como o mecanismo de regeneração das células epiteliais gástricas em resposta a lesões. A principal vantagem desta técnica é, em primeiro lugar, o estudo da migração e regeneração celular em um ensaio de cicatrização de feridas, gerado a partir de células gástricas primárias de camundongos ou de origem humana, e a segunda geração de organoides gástricos de origem humana para experimentos em larga escala.Embora esse método possa fornecer informações sobre a regeneração do epitélio gástrico, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como infecção por helicobacter pylori e co-culturas de células imunes epiteliais. Demonstrando o procedimento estará Emma Teal, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, colete o tecido preparado em um grande recipiente de plástico cheio de DPBS livre de cálcio e magnésio.Deixe o recipiente de plástico no gelo até o uso. Em seguida, com a ajuda de uma pinça, lave o tecido vigorosamente em um béquer estéril contendo 100 mililitros de DPBS livre de cálcio e magnésio por cerca de 30 segundos. Em seguida, use uma gaze estéril para limpar a camada de muco do epitélio.Em seguida, use uma pinça grande para segurar a camada muscular do tecido com firmeza, depois use uma pinça hemostática curva grande e descarte o epitélio com força. Armazene o epitélio raspado em uma placa de Petri de poliestireno estéril. Para otimizar a digestão do tecido, pique o tecido epitelial em fragmentos.Em seguida, lave o tecido com DPBS livre de cálcio e magnésio suplementado com antibióticos. Lave várias vezes para remover o sangue. Descarte a lavagem em um copo de resíduos.Em seguida, recolher os fragmentos epiteliais lavados num balão de vidro de 125 ml de fundo redondo com uma barra de agitação de 25 milímetros e meio de incubação pré-aquecido. Após a coleta dos fragmentos de tecido, sele o frasco de fundo redondo com um septo. Em seguida, use grampos para prender a configuração a um suporte de anel.Em seguida, insira uma agulha espinhal de calibre 20 nos septos. Conecte os septos a um tanque de oxigênio com mangueira de borracha. Insira 10 a 15 agulhas de saída nos septos para evitar sua ruptura, o interruptor na saída de oxigênio em baixa.Depois disso, calibre o banho-maria a 37 graus Celsius em uma placa de agitação por 30 a 45 minutos. Depois de calibrado, coloque a configuração no banho-maria. Após 15 minutos de incubação, verifique se há glândulas dissociadas.Após o tempo de incubação desejado, adicione 15 mililitros de DMEMF12 pré-aquecido ao meio de incubação usando uma pipeta sorológica. Em seguida, filtre a mistura de glândulas obtida através de uma gaze estéril em quatro tubos cônicos de 15 mililitros. Em seguida, incubar o filtrado no gelo durante 15 minutos.Isso permitirá que a glândula se acomode no fundo do tubo cônico. Use uma pipeta sorológica para descartar 40 mililitros do sobrenadante do topo da suspensão da glândula. Ressuspenda os 10 mililitros restantes da mistura glad em 10 mililitros de DPBS suplementado com antibióticos.Em seguida, distribua toda a mistura em tubos de ensaio de cultura de células de cinco mililitros. Centrifugue os tubos a 65 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante.Dissolva o pellet glandular obtido com a matriz da membrana basal usando uma ponta larga de pipeta de 200 microlitros. Misture a suspensão até ficar homogênea. Em seguida, coloque as glândulas em 15 microlitros da matriz da membrana basal com a ajuda de uma pipeta de ponta larga.Para que a matriz da membrana basal polimerize, incube a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Em seguida, adicione um mililitro de meio hFGO em cada poço, se cultivado em uma placa de cultura de 12 poços. Em seguida, cultive as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de células umidificada.Troque o meio a cada 45 dias. Após seis a sete dias de cultura FGO derivada de camundongos ou humanos 3D, comece a transferir os organoides 3D para a monocamada 2D. Para fazer isso, adicione um mililitro de DPBS livre de cálcio e magnésio no centro da bolha para desalojar a bolha da membrana basal 3D da placa.Em seguida, colete a matriz da membrana basal e a mistura de organoides no tubo de cultura de células. Em seguida, centrifugue a 40 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, use um sistema de vácuo para remover o sobrenadante e o máximo possível da matriz da membrana basal.Em seguida, dissolva o pellet em quatro mililitros de DPBS livre de cálcio e magnésio. Certifique-se de remover o máximo possível da matriz do embasamento após a colheita dos organoides em preparação para a monocamada. Em seguida, adicione um mililitro de solução de descolamento de células pré-aquecida a 37 graus Celsius a cada tubo de ensaio.Em seguida, misture o conteúdo do tubo invertendo várias vezes. Finalmente, incube o tubo a 37 graus Celsius por 10 minutos. Para obter uma suspensão de célula única, adicione os dois mililitros de DPBS livre de cálcio e magnésio diretamente em cada um dos tubos de ensaio.Em seguida, use uma agulha de calibre 26 para misturar a suspensão duas a três vezes. Após a mistura, centrifugue a suspensão celular e, em seguida, dissolva o pellet celular em meio FGO 2D. Para obter todo o organoide, coloque a suspensão celular em placas revestidas.Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius por cerca de quatro dias. Mude o meio se a cor ficar amarela. Assim que a cultura atingir 100% de confluência, raspe a monocamada usando uma lâmina de barbear.Em seguida, fixe as monocamadas usando paraformaldeído a 3,7% em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, permeie as monocamadas com Triton X-100 por 20 minutos em temperatura ambiente. Após a permeablização, bloqueie as monocamadas com dois por cento de soro de burro por uma hora.Após uma hora de bloqueio, incubar a monocamada com solução de anticorpos primários a quatro graus Celsius durante a noite. Envolva a monocamada em parafilme para evitar a evaporação e o ressecamento da cultura durante a noite. No dia seguinte, lave com 0,1% de detergente não iônico em PBS.Em seguida, incube com anticorpo secundário e 10 microgramas por mililitro de corante de núcleos da célula hospedeira por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, core as células. Em seguida, identifique as células mucosas superficiais na cultura de monocamada gástrica 2D derivada de humanos sob o microscópio confocal.Finalmente, capture imagens da ferida a cada poucas horas. Essas imagens da análise de lapso de tempo mostram a formação de FGOs humanos. Esses organoides são transferidos para uma monocamada epitelial gástrica em lâminas de câmara codificadas por matriz de membrana basal.A monocamada epitelial gastral é analisada a cada oito horas durante um dia. A imagem mostra que a área da ferida continua diminuindo e desaparece completamente na cultura em apenas um dia. Esta coloração de florescência imunológica mostra a presença de monocamada positiva de E-caderina que consiste nas células mucosas superficiais.Isso indica a regeneração da monocamada epitelial gástrica. Os núcleos presentes são corados com hoechst. Em seguida, a análise de RTPCR é feita usando RNA extraído da monocamada epitelial gástrica humana para confirmar a expressão das células mucosas, principais e mucosas da superfície parietal.A presença de ATPa e PgC mostra a presença de células parietais e principais, respectivamente. A presença de MUC5AC e MUC6 mostra a presença de células mucosas superficiais e mucosas do pescoço, respectivamente. Nesta imagem de florescência imunológica, as células em proliferação na cultura de monocamada epitelial gástrica humana são mostradas pela pronta captação de EdU.Essas imagens de florescência imunol mostram a regeneração do epitélio gástrico e a expressão de células mucosas e parietais superficiais em zero, oito, 16 e 24 horas após a ferida por arranhão. Uma vez dominada, a transferência de 3D para 2D pode ser feita em uma hora se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de lavar o máximo possível da matriz da membrana basal dos organoides colhidos antes da transferência 2D.Após este procedimento, outros métodos, como infecção por helicobacter pylori em monocamadas e co-culturas de células imunes em monocamada, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como interações com patógenos hospedeiros. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de gastroenterologia explorarem doenças e regeneração no estômago. Não se esqueça de que trabalhar com tecido humano pode ser extremamente perigoso, e precauções como técnica estéril e medidas de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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