Digitalização de slides automatizado e segmentação em tecidos fluorescente-rotulado, usando um sistema de análise de Widefield alto teor
3 de maio de 2018
Aqui descrevemos um protocolo para a segmentação automática de tecidos fluorescente etiquetadas em slides utilizando um sistema de análise de alto teor widefield (WHCAS). Este protocolo tem aplicações abrangentes em qualquer campo que envolve a quantificação de marcadores fluorescentes em tecidos biológicos, incluindo as ciências biológicas, engenharia médica e Ciências da saúde.
O objetivo geral deste método de imagem e análise é gerar um fluxo de trabalho fácil de configurar para a segmentação automática de qualquer amostra de tecido montada em lâmina marcada com fluorescência. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das ciências biológicas sobre quanto de uma determinada proteína é encontrada em uma área específica de uma amostra de tecido de interesse. As principais vantagens dessa técnica são que os protocolos de otimização de tempo para segmentação automatizada podem ser economizados, permitindo que esse método seja aplicado a amostras de tecido montadas em lâminas marcadas com fluorescência subsequentes.
Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando precisávamos quantificar novas células no tecido cerebral em uma alta ampliação. Depois de importar os diários, abra a caixa de diálogo Configuração de aquisição de chapas e abra a guia Objetiva e câmera. Defina a Ampliação para quatro vezes, o Compartimento da câmera para um e o Ganho para dois.
Abra a guia Digitalização de lâminas de chapas e insira as configurações experimentais apropriadas. Na guia Sites to Visit, preencha os poços uniformemente com os locais e abra a guia Editar configurações do fundo da placa para inserir os valores experimentais apropriados. Depois de salvar essas configurações como Configuração A, abra a guia Objetivo e Câmera e defina a Ampliação para 40 vezes, o compartimento da câmera para um e o Ganho para dois.
Confirme se todas as configurações nas guias Digitalização de slides de placa e editar Configurações inferiores da placa são as mesmas inseridas para a Configuração A.E abra a guia Loop de aquisição. Insira o número de comprimentos de onda presentes na amostra e marque as opções Ativar foco baseado em laser e Ativar foco baseado em imagem. Em seguida, salve essas configurações como Configuração B.Em seguida, coloque até três slides, com a lamínula voltada para baixo com a etiqueta na lateral do entalhe no adaptador de slides.
E pressione F4 para abrir o menu principal. Selecione Digitalização de slides e clique em Open Door Eject Slide para inserir o adaptador de slides no sistema de análise de alto conteúdo de campo amplo. Em seguida, clique em Fechar Porta Carregar Slide.
Para começar, certifique-se de que o comprimento de onda apropriado esteja selecionado. Mova para locais diferentes dentro da imagem de feição ao vivo até que a região de interesse seja localizada. Foco na região.
Se não estiver em foco, use o botão Foco automático ou ajuste o tamanho do passo até que esteja. Use Ajustar para capturar a imagem, se ajustar manualmente o foco alterando o tamanho do passo. Para configurar uma verificação anterior, primeiro carregue a Configuração A e selecione Visualizar slides.
Indique o número de slides e selecione OK. Escolha quatro vezes como ampliação. Em seguida, selecione Coverslip down e continue a selecionar suas configurações básicas para verificação anterior. Certifique-se de que a configuração de aquisição e as calibrações estejam marcadas antes de selecionar Cancelar e pressione Continuar.
Na guia W1:DAPI, clique em Ao vivo e, em seguida, Exposição automática, seguido de Snap. Depois disso, pressione Fechar. Selecione o diretório e digite um nome de verificação anterior.
A caixa de diálogo Desenhar região aparecerá automaticamente. Use a ferramenta de região retangular para selecionar toda a região de verificação anterior e clique em Continuar. No final da verificação anterior, carregue a Configuração B e abra a guia Sites a serem visitados.
Para começar, certifique-se de que o comprimento de onda apropriado esteja selecionado. Mova para locais diferentes dentro da imagem de feição ao vivo até que a região de interesse seja localizada. Foco na região.
Se não estiver em foco, use o botão Foco automático ou ajuste o tamanho do passo até que esteja. Use Ajustar para capturar a imagem, se ajustar manualmente o foco alterando o tamanho do passo. Em seguida, na guia W1 DAPI, clique em Auto Expose e confirme se a imagem Plate Acquisitions Snap DAPI está nítida.
No menu principal, clique em Diário e selecione Executar Diário no menu suspenso. Clique duas vezes no Diário de Configuração de Aquisição de Região de Slide para iniciar e clique em Continuar quando a caixa de diálogo Configurar Aquisição de Região de Slide for exibida. Quando instruído, selecione a digitalização DAPI para selecionar a imagem do slide de baixa ampliação e clique em OK. Quando solicitado o Snap de aquisição de placa, realce o Snap-DAPI de aquisição de placa e clique em OK. Quando a caixa Criar ou Carregar Regiões for exibida, use a ferramenta Região Retangular para selecionar as regiões de interesse na Varredura DAPI e clique em Continuar.
Usando a ferramenta de localização, realce a região de interesse e clique em Continuar, na caixa de diálogo Selecionar região. Quando a caixa Confirmar regiões for exibida, clique em Continuar e decida se a região precisa ser salva quando a caixa de diálogo Salvar regiões for exibida. Três caixas de diálogo aparecerão.
Clique em Continuar para fechar a caixa Configuração concluída. Para eliminar qualquer suposição de localização do site de amostra, certifique-se de que a opção Exibir imagens durante a aquisição na guia Configurações de exibição esteja marcada e abra a guia Resumo para clicar em Adquirir placa para posicionar o estágio da região de interesse pré-selecionada. Quando a câmera se move sobre um site que contém as células de interesse, clique em Cancelar para interromper a aquisição da imagem.
Não se assuste se a imagem estiver desfocada. Esta etapa é apenas para posicionar o estágio do primeiro site na região de interesse selecionada. Confirme se o estágio está localizado sobre a amostra e se você inseriu o número de sites corretamente.
Otimize as configurações de comprimento de onda para garantir que estejam focadas em uma imagem de alta faixa dinâmica seja obtida. Em seguida, abra a guia Resumo novamente e clique em Adquirir placa. No final da análise, selecione a guia Exibir.
No menu suspenso Sobreposição de imagem, selecione Mostrar informações do poço para exibir os números do site no canto superior esquerdo. Percorra os locais e exclua quaisquer locais que estejam fora de foco e/ou contenham dobras de tecido ou bolhas e rasgos no tecido. Nesta imagem representativa, miniaturas de alta ampliação de todos os locais dentro da região de interesse definida são mostradas.
Cada site deve ser revisado para identificar os sites que devem ser excluídos da análise. Por exemplo, neste experimento, o local 149 estava fora de foco, o local 219 tinha bolhas e o local 54 continha uma dobra. Todos os três locais foram excluídos da análise.
Aqui, as sobreposições correspondentes geradas pelo módulo de pontuação de células de vários comprimentos de onda demonstram os resultados da segmentação automatizada realizada no local 59, conforme personalizado de acordo com as especificações experimentais. Após a segmentação, os dados quantitativos da proporção de células que se coloriram positivamente para cada marcador, ambos os marcadores, nenhum marcador, área média corada e intensidade média de fluorescência podem ser obtidos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar seu sistema de análise de alto conteúdo de campo amplo para criar um fluxo de trabalho automatizado para a imagem e segmentação de uma amostra de tecido montada em lâmina.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para a segmentação automatizada de tecidos marcados com fluorescência utilizando um sistema automatizado de análise de alto conteúdo em campo amplo (WHCAS). Este método simplifica a quantificação de marcadores fluorescentes em tecidos biológicos, beneficiando diversas áreas, incluindo ciências biológicas e engenharia médica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Ciências Biológicas
- Engenharia Biomédica
- Ciências da Saúde
Antecedentes
- A segmentação automatizada aprimora a análise de tecidos marcados com fluorescência.
- Os sistemas de análise de alto conteúdo facilitam a obtenção de imagens detalhadas de amostras biológicas.
- A quantificação de proteínas em amostras de tecidos é fundamental para compreender os processos biológicos.
- Este método foi desenvolvido para enfrentar os desafios na quantificação de novas células em tecido cerebral.
Objetivo do Estudo
- Criar um fluxo de trabalho eficiente para a segmentação automática de amostras de tecidos.
- Aprimorar a precisão e a velocidade na quantificação de marcadores fluorescentes.
- Fornecer um protocolo padronizado aplicável a diversos tipos de tecidos.
Métodos Utilizados
- Configuração de um sistema de análise de alto conteúdo em campo amplo para aquisição de imagens.
- Configuração de parâmetros experimentais para imagem ideal.
- Uso de ferramentas de software para aquisição e análise de imagens.
- Implementação de autofoco e técnicas baseadas em imagem para focalização.
Resultados Principais
- Obteve-se segmentação bem-sucedida de tecidos marcados com fluorescência.
- A imagem em alta ampliação forneceu vistas detalhadas das amostras de tecido.
- As regiões de interesse foram identificadas e analisadas com precisão.
- Foram estabelecidos critérios de exclusão para imagens desfocadas ou comprometidas.
Conclusões
- O protocolo de segmentação automatizada reduz significativamente o tempo de análise.
- Este método pode ser aplicado a uma ampla variedade de tecidos biológicos.
- Aplicações futuras podem aprimorar a pesquisa em diversas áreas científicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A digitalização e segmentação automatizadas de lâminas utilizando um sistema automatizado de análise de alto conteúdo em campo amplo (WHCAS) resolve o gargalo na quantificação de marcadores fluorescentes em grandes seções de tecido, permitindo análises reprodutíveis e de alto rendimento para validação de alvos e desenvolvimento de ensaios. Ao padronizar os fluxos de trabalho de aquisição de imagens e segmentação, este método reduz a variabilidade e acelera a avaliação pré-clínica de biomarcadores baseados em tecidos, apoiando decisões orientadas por dados de avançar/interromper no estágio inicial da descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de padrões de expressão proteica em tecidos relevantes para a doença.
- Valor Operacional: Reduz o tempo gasto na otimização de protocolos para experimentos individuais, permitindo aplicação rápida em múltiplos alvos marcados com fluorescência.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas por meio de leituras consistentes e quantitativas da localização e dos níveis de expressão de marcadores.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológ游戏副本licos validados para triagem subsequente, gerando imagens de tecidos padronizadas e segmentadas adequadas para ensaios de alto conteúdo.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio da seleção automatizada de regiões e exclusão de sítios comprometidos (por exemplo, tecidos fora de foco, dobrados ou com bolhas).
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em diferentes marcadores e tipos de tecidos por meio de módulos de software pré-configurados para localização proteica, proliferação, viabilidade, apoptose e angiogênese.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Mantém a consistência do descobrimento à validação pré-clínica, fornecendo dados quantitativos sobre as proporções de células positivas para marcadores, área média corada e intensidade de fluorescência.
- Avanço com Ajuste de Risco: Apoia a tomada de decisões pré-clínicas ao fornecer conjuntos de dados confiáveis, filtrados por exclusão, que refletem o sinal biológico real.
- Sistema Relevante para a Doença: Demonstra aplicabilidade na análise de tecidos de tumores cerebrais, com possibilidade de extensão a qualquer marcador nuclear ou citoplasmático marcado com fluorescência em lâminas montadas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta desde a Descoberta Inicial até a Identificação de Fármacos Promissores e a Pesquisa Pré-clínica, permitindo análise padronizada de tecidos em cada estágio.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao quantificar a expressão de marcadores em regiões específicas de tecidos de interesse.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de segmentação automatizada e resultados quantitativos que permitem avaliação confiável de compostos em diferentes locais.
- Análises: Gera leituras mensuráveis, incluindo proporção de células positivas, área média corada e intensidade média de fluorescência, possibilitando comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer dados quantitativos de tecidos alinhados a biomarcadores, adequados para estudos de validação.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável em diversos projetos, aproveitando módulos de software pré-construídos e configurações salvas (Configuração A e B) para digitalização de lâminas e segmentação consistentes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos, redução da ambiguidade mecanicista em ensaios baseados em tecidos.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de imageamento e análise de tecidos.
- Valor Estratégico: Decisões de avanço ou interrupção aprimoradas, eficiência de capital por meio da redução do tempo de otimização de protocolos e menor risco biológico em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em dados quantitativos de tecidos validados por exclusão.
Considerações de Implementação
- Exige experiência na operação de sistemas de análise de alto conteúdo em campo amplo e no manuseio do software associado.
- Depende de instrumentação capaz de digitalização de lâminas, aquisição em múltiplos comprimentos de onda e focagem baseada em laser e em imagem.
- Necessita padronização entre equipes dos parâmetros de aquisição (por exemplo, magnificação, binning, ganho) e dos protocolos de definição de regiões de interesse.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes tipos de tecidos, expressões de marcadores ou espessuras de lâminas.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de excluir manualmente locais com artefatos (por exemplo, imagens desfocadas, dobras no tecido, bolhas), apesar da aquisição automatizada.
