Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção

O objetivo geral deste novo ensaio de hibridização in-situ de RNA é visualizar moléculas únicas de RNA em uma área específica do cérebro que são críticas para esclarecer a disfunção dopaminérgica durante a doença do sistema nervoso central. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como anormalidades dopaminérgicas mediando respostas comportamentais e modulando a função da memória de trabalho. A principal vantagem deste método é que ele fornece uma nova técnica de hibridização in-situ para investigar a disfunção do sistema dopaminérgico durante a progressão de doenças do sistema nervoso central.

Embora esse método possa fornecer informações sobre os níveis gerais de expressão de um mRNA alvo em uma determinada região do cérebro, ele também pode ser aplicado para determinar como os transcritos de mRNA são distribuídos pelas células de uma determinada região. Para iniciar este procedimento, dentro de cinco minutos após a colheita de um cérebro de rato adulto, mergulhe-o em nitrogênio líquido por 15 segundos. Em seguida, equilibre o cérebro a menos 20 graus Celsius em um criostato por uma hora.

Após uma hora, corte seções de 30 mícrons contendo núcleo accumbens de 2,76 milímetros a 2,28 milímetros anteriores ao bregma e monte-as nas lâminas. Em seguida, seque as seções a menos 20 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, mergulhe as lâminas em paraformaldeído a 4% pré-resfriado por uma hora a quatro graus Celsius.

Em seguida, coloque as lâminas em um gradiente crescente de etanol à temperatura ambiente e transfira as lâminas para etanol 100% fresco por mais cinco minutos. Em seguida, coloque as lâminas no papel absorvente para deixar secar ao ar. Desenhe uma barreira ao redor de cada seção com uma caneta barreira.

Deixe a barreira secar completamente por um minuto. Para pré-tratar as seções cerebrais, ligue o forno e ajuste a temperatura para 40 graus Celsius. Adicione três gotas de reagente pré-tratamento em cada seção do cérebro.

Em seguida, incube as seções por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, mergulhe as lâminas em 1X PBS por um minuto em temperatura ambiente e transfira as lâminas para 1X PBS fresco por mais um minuto. Os slides não devem permanecer em 1X PBS por mais de 15 minutos.

Para executar o ensaio multiplex, aqueça a sonda alvo por 10 minutos a 40 graus Celsius em banho-maria e depois resfrie até a temperatura ambiente. Coloque o reagente de RNA à temperatura ambiente. Remova o excesso de líquido das lâminas com papel absorvente e coloque-as de volta no suporte de lâminas.

Em seguida, adicione três gotas do Drd1alfa como sonda em cada fatia de amostra e incube as amostras por duas horas a 40 graus Celsius. Depois, lave as lâminas em tampão de lavagem 1X por dois minutos em temperatura ambiente duas vezes. Em seguida, remova o excesso de líquido das lâminas com papel absorvente e coloque-as de volta no suporte de lâminas.

Não deixe as seções cerebrais secarem entre as etapas de incubação. Adicione três gotas de AMP 1FL em cada fatia de amostra e incube as amostras por 30 minutos a 40 graus Celsius. Depois, lave as lâminas duas vezes em tampão de lavagem 1X por dois minutos de cada vez em temperatura ambiente.

Em seguida, remova o excesso de líquido das lâminas com papel absorvente e coloque-as de volta no suporte de lâminas. Em seguida, adicione três gotas de AMP 2FL em cada fatia de amostra. Incubar as amostras durante 15 minutos a 40 graus Celsius.

Em seguida, mergulhe as lâminas em tampão de lavagem 1X por dois minutos em temperatura ambiente duas vezes. Remova o excesso de líquido das lâminas com papel absorvente e coloque-as de volta no suporte de lâminas. Adicione três gotas de AMP 3FL em cada fatia de amostra e incube as amostras por 30 minutos a 40 graus Celsius.

Em seguida, lave as lâminas em tampão de lavagem 1X por dois minutos em temperatura ambiente duas vezes. Remova o excesso de líquido das lâminas com papel absorvente e coloque-as de volta no suporte de lâminas. Em seguida, adicione três gotas de AMP 4FL ALT A em cada fatia de amostra e incube as amostras por 15 minutos a 40 graus Celsius.

Lave a lâmina em tampão de lavagem 1X por dois minutos em temperatura ambiente duas vezes. Remova o excesso de líquido das lâminas e coloque imediatamente duas gotas de reagente de montagem em cada seção. Em seguida, coloque uma lamínula de 22 milímetros por 22 milímetros sobre cada seção do cérebro.

Em seguida, armazene as lâminas no escuro a dois a oito graus Celsius até secarem. Para imagens, ligue o microscópio confocal e mude para uma objetiva de 60X. Obtenha imagens da pilha Z e adquira imagens de células marcadas com Drd1alfa na região do núcleo accumbens.

Para imagens do núcleo accumbens que exibiram o padrão de coloração de pontos discretos, a faixa dinâmica de expressão foi avaliada usando uma análise semiquantitativa. Cada célula foi pontuada de zero a nove com base no número de pontos por célula. Este método de pontuação de sinal hibridizado pode, portanto, avaliar a extensão e a variabilidade da expressão de Drd1alfa em células individuais.

Aqui estão as imagens confocais representativas da expressão de Drd1alfa em ratos machos e fêmeas que têm o padrão de coloração de pontos discretos. Para contabilizar a estrutura de dados aninhada, os valores médios de contagem foram calculados para cada categoria e usados para análise estatística. Um teste U de Mann-Whitney foi realizado para avaliar as diferenças na contagem mediana de células em ratos machos e fêmeas.

A frequência das células em cada categoria é analisada usando frequência relativa e frequência cumulativa. As fêmeas apresentaram uma mudança significativa na distribuição com a maior frequência de células em categorias de ordem mais baixa em relação aos animais machos. No geral, os resultados sugerem diferenças sexuais claras na expressão de Drd1alfa no núcleo accumbens.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em sete horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar rapidamente, pois as mudanças de temperatura ou o ressecamento do tecido podem danificar o mRNA e prejudicar nossa capacidade de obter um sinal confiável. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a técnica de hibridização in-situ em tecidos corticais, transcritos de mRNA de sinal de imagem fluorescente em regiões cerebrais escolhidas e caracterizar a distribuição de transcritos de mRNA para análise estatística.