Name: Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprenda a técnica de hibridização in situ de RNA para visualizar moléculas únicas de RNA no núcleo accumbens de roedores. Este método inovador permite investigar a expressão do receptor de dopamina D1-alfa e suas diferenças sexuais em doenças do sistema nervoso central.

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As obras presentes foram apoiadas pelo Instituto Nacional de bolsas de saúde (NIH), HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624. Fundo parcial foi fornecido por uma concessão de treinamento de NIH T32 na ciência biomédica-comportamental.

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) na Universidade da Carolina do Sul e cuidado Animal (número de garantia federal: A3049-01).
1. preparação das seções do cérebro congelado fresco
<ol><li>Usar a cepa de ratos de F344/N: três ratos de cada sexo, 13 meses de idade, peso cerca de 320 g de corpo.</li>
	<li>Ajuste a concentração de sevoflurano para 5% (overdose de sevoflurano). Continue o sevoflurano exposição após a respiração para por um minuto adicional.</li>
	<li>Decapitar o rato e remover o cérebro.</li>
	<li>Submergir o cérebro de rato em nitrogênio líquido por 15 s dentro de 5 min de colheita de tecidos.</li>
	<li>Equilibrar o cérebro a-20 ° C em um criostato por 1h.</li>
	<li>30 µm de seções de corte e transferir para slides (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Escolha as seções da região núcleo accumbens, aproximadamente 2,76 mm a 2,28 mm anterior Bregma14.</li>
	<li>Continuamente uma fatia do cérebro do rato do bulbo olfactório através da região do núcleo accumbens de acordo com a estrutura cerebral estereotáxica do rato.</li>
	<li>Monte as amostras sobre as guias. Manter as secções a-20 ° C por 10 min secar.</li>
	<li>Mergulhe imediatamente slides no pre-refrigerados paraformaldeído 4% para 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Coloque os slides em um gradiente crescente de etanol à temperatura ambiente (RT): 50% EtOH por 5 min; 70% EtOH por 5 min; e 100% EtOH por 5 min.</li>
	<li>Repetir com fresco 100% EtOH.</li>
	<li>Coloque slides em papel absorvente e secar ao ar.</li>
	<li>Desenhar uma barreira em torno de cada seção com uma caneta de barreira (ver Tabela de materiais). Deixa a barreira secar completamente durante 1 min.</li>
</ol>2. pré-tratamento de seções do cérebro
<ol><li>Ligue o forno e regule a temperatura para 40 ° C.</li>
	<li>Adicione 3 gotas (90 µ l) de reagente 4 pré-tratamento (ver Tabela de materiais) em cada seção do cérebro (uma seção por slide).</li>
	<li>Incubar as seções durante 30 min à RT</li>
	<li>Mergulhe os slides em 1X PBS durante 1 min no RT. Repeat com frescos 1X PBS. Nota: Slides não devem ficar em PBS 1x por mais de 15 min.</li>
</ol>3. o RNA In Situ da hibridação fluorescente Multiplex ensaio
<ol><li>Aquecer a sonda alvo por 10 min a 40 ° C em banho-maria e em seguida, refresque a RT</li>
	<li>Coloque o reagente de RNA (por exemplo, o Amp FL 1-4) em RT</li>
	<li>Remover o excesso de líquido das laminas com papel absorvente e coloque de volta na prateleira corrediça (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Adicione 3 gotas (90 µ l) da sonda Drd1α (C1) sobre a fatia de amostra. Incubar durante 2 h a 40 ° C.</li>
	<li>Mergulhe slides em 1x tampão de lavagem por 2 minutos em RT. Repeat com frescos 1x tampão de lavagem.</li>
	<li>Retire o excesso de líquido os slides com papel absorvente e coloque de volta sobre o porta-lâminas (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Adicione 3 gotas (90 µ l) de Amp 1-FL sobre a fatia de amostra. Incubar durante 30 min a 40 ° C.</li>
	<li>Mergulhe slides em tampão de 1 lavagem por 2 min em RT. Repeat com buffer de 1wash fresco.</li>
	<li>Retire o excesso de líquido os slides com papel absorvente e coloque de volta sobre o porta-lâminas (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Adicione 3 gotas (90 µ l) de Amp 2-FL sobre a fatia de amostra. Incube por 15 min a 40 ° C.</li>
	<li>Mergulhe slides em 1x tampão de lavagem por 2 minutos em RT. Repeat com frescos 1x tampão de lavagem.</li>
	<li>Retire o excesso de líquido os slides com papel absorvente e coloque de volta sobre o porta-lâminas (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Adicione 3 gotas (90 µ l) de Amp 3-FL sobre a fatia de amostra. Incubar durante 30 min a 40 ° C.</li>
	<li>Mergulhe os slides em 1x tampão de lavagem por 2 min em RT. Repeat com frescos 1x tampão de lavagem.</li>
	<li>Retire o excesso de líquido os slides com papel absorvente e coloque de volta sobre o porta-lâminas (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Adicione 3 gotas (90 µ l) de Amp 4-FL-Alt A sobre a fatia de amostra. Incube por 15 min a 40 ° C.</li>
	<li>Mergulhe slides em 1x tampão de lavagem por 2 minutos em RT. Repeat com frescos 1x tampão de lavagem.</li>
	<li>Remover o excesso de líquido de slides e imediatamente coloque 2 gotas de reagente de montagem (ver Tabela de materiais) para cada seção.</li>
	<li>Coloque uma lamela de 22 mm de 22 mm (ver Tabela de materiais) sobre cada seção do cérebro.</li>
	<li>Armazenar slides no escuro a 2-8 ° C até secar.</li>
	<li>Ligue o microscópio confocal e alternar para um objectivo X 60.</li>
	<li>Obter imagens de Z-pilha com um microscópio confocal. Veja o vídeo suplementar para um procedimento de detalhe da imagem latente confocal.</li>
	<li>Adquirir imagens de Drd1α rotulado de células na região de núcleo accumbens (excitação: 488 nm; Emissão: 515/30 nm). Nota: Não deixe o cérebro seções secam entre as etapas de incubação.</li>
</ol>4. análise de dados
<ol><li>Semi-quantitativamente analisar o padrão de coloração: "pontos discretos".<ol>
<li>Para identificar a célula individual da imagem, realize DAPI coloração como um marcador nuclear. No entanto, é ainda difícil de analisar determinadas partes do tecido cerebral, uma vez que tem vários tipos de células com forma irregular de núcleos e/ou células. Aqui, dois pesquisadores experientes atribuir separadamente cada célula de imagens para definir a região da célula.</li>
		<li>Visualmente, marca cada célula dentro as imagens confocal representativas baseado no número de pontos por célula, usando os critérios específicos (figura 1B).</li>
		<li>Determinar o número total de células em cada categoria e dividir pelo número total de células x100 para criar gráficos de frequência relativa que exibem a frequência percentual de células dentro de cada categoria para todas as seções do tecido (Figura 2A) e para os machos e fêmeas separadamente (Figura 2E).</li>
		<li>A soma das células dentro de todas as categorias anteriores, dividir pelo número total de células x100 para determinar a frequência cumulativa das células para todas as seções do tecido (Figura 2B) e para os machos e fêmeas separadamente (Figura 2F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise estatisticamente os "pontos discretos" coloração padrão (opcional).<ol>
<li>Examinar o número de pontos por celular para fornecer uma variável categórica ordinal na natureza (ou seja, o número de células que caem em cada categoria de classificação da menor expressão celular (1), a mais alta expressão da célula (9)) para mais análises estatísticas.</li>
		<li>Após análise das estatísticas descritivas, use três abordagens principais: uma estatística de Mantel-Haenszel, um teste de Mann-Whitney U e um teste de Kruskal-Wallis. Embora a abordagem estatística exata será dependente a questão experimental de design e pesquisa de interesse, uma árvore de decisão estatística (Figura 4) pode ajudar na tomada de decisões em relação a abordagem analítica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificar a intensidade de sinal na região de interesse (ROI) para coloração padrão: "clusters".<ol>
<li>Calcule a intensidade do sinal de cada imagem usando a seguinte equação: Intensidade do sinal = intensidade Total de imagem ROI - (fundo de média intensidade × imagem Total área)</li>
		<li>Conte o número total de células dentro de imagem ROI para calcular a expressão aproximada de sinal por célula. Grupo as diferenças na intensidade de sinal/imagem, bem como o número de células/imagem podem ser de interesse para considerar os mecanismos que podem contribuir para diferenças de grupo vistas na expressão de sinal/célula (Figura 3B-3D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise estatisticamente os "clusters" coloração padrão (opcional).<ol>
<li>Examine a expressão do sinal/celular para fornecer uma variável contínua para posterior análise estatística. Uso de duas abordagens, incluindo um teste t de amostras independentes e análise de variância (ANOVA), com base no número de fatores between-temas incluídas no projeto. Uma árvore de decisão estatística (Figura 4) pode ajudar na tomada de decisões em relação a abordagem estatística mais adequada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia%3A+insights+for+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li>
<li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology%2C+signaling%2C+and+pharmacology+of+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li>
<li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li>
<li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li>
<li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li>
<li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition%3A+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li>
<li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li>
<li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li>
<li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li>
<li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).</li>
</ol>

Não há nenhum conflito de interesses para declarar.

Neste protocolo, descrevemos uma nova técnica de hibridação in situ por fatias de cérebro fresco congelado avaliar a expressão de receptores Drd1α no núcleo accumbens (NAc) e Tirosina Hidroxilase (TH) na região de substantia nigra (SNR). Nós também fornecemos métodos de análise de dados para diferentes padrões de coloração: "ponto discreto" ou "clusters".
Os passos críticos para um ensaio de sucesso fluorescência multiplex do RNA em situ da hibridação são incluídos. Uma vez q...

Disfunção do sistema de dopamina striatal está envolvida na progressão dos sintomas clínicos observados em várias doenças neurocognitivos. Receptores de dopamina D1 estão presentes no córtex pré-frontal (PFC) e regiões striatal do cérebro e fortemente influenciam processos cognitivos1, incluindo o trabalho de memória, processamento temporal e comportamento locomotiva2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. estudos anterior elucidado que alterações de receptores de dopamina D1 foram associadas com a progressão da atenção défice-Hiperatividade Transtorno (TDAH)8, os sintomas neurocognitivos em esquizofrenia9, 10 e stress susceptibilidade11. Especificamente, na esquizofrenia, estudos de tomografia por emissão de pósitrons (PET) indicaram que a capacidade de ligação dos receptores de dopamina D1 nos córtices pré-frontal foi altamente relacionada com déficits cognitivos e a presença de sintomas negativos11. O crescimento dendrítica de neurônios excitatórios no córtex pré-frontal, regulado pelo receptor de dopamina D1 alivia o stress susceptibilidade. Além disso, o nocaute do receptor D1 em neurônios corticais pré-frontal medial (mPFC) poderá reforçar a derrota social induzida por estresse evitação social12.
Aqui, apresentamos uma nova técnica de hibridação in situ RNA Visualizar moléculas de RNA única numa cela com amostras de tecido fresco congelado. A presente técnica tem várias vantagens sobre os métodos que existem dentro da literatura atual. Primeiro, o procedimento atual preserva o contexto espacial e morfológico do tecido e foi realizado em amostras de tecido fresco congelado, para que outros procedimentos que exigem fresco, tecidos não-incorporado podem ser combinados com os métodos atuais. Procedimentos semelhantes em tecidos fixados em formalina e parafina ilustraram que resolução única transcrição pode ser conseguida usando um RNA em situ da hibridação técnica13. Detecção de RNA no nível de simples transcrição fornece sensibilidade superior à expressão de número de cópia baixa, bem como a oportunidade de comparar a expressão do gene no nível de células individuais que não podem ser alcançados por outros métodos de detecção do ácido nucleico, tais como técnicas de reação em cadeia (PCR) de polimerase. Além disso, o método atual mantém imagens com uma alta relação sinal-ruído através de sondas de RNA altamente específicas que são hibridizadas de transcritos de RNA único alvo e sequencialmente limite com uma cascata de moléculas de amplificação de sinal na identificação sistema. Finalmente, a tecnologia atual oferece a oportunidade de avaliar vários sistemas biológicos com suas sondas proprietárias de destino específico, ao invés de limitar a nossa investigação a apenas uma classe de marcadores relacionados ao sistema, como a detecção de proteínas por métodos de imuno-histoquímica.
Em nosso estudo, usamos esta novela RNA em situ da hibridação para avaliar a expressão de receptores Drd1α no núcleo accumbens (NAc) e Tirosina Hidroxilase (TH) na substância negra (SNR) de ratos de F344/N tanto masculinos como femininos. A inovador RNA em situ hibridação permitiu-nos investigar mecanismos influenciando DA fixação e DA liberação, simultaneamente, melhorar a nossa compreensão das complexidades do sistema striatal DA. Aqui, descrevemos o procedimento para o cérebro fresco congelado fatias e fornecer métodos de análise de dados para diferentes padrões de coloração: "ponto discreto" ou "clusters".

<table><tbody><tr><td>Sistema de Forno HybEZ</td><td>Diagnóstico Avançado de Células&nbsp;</td><td>Sonda RNAscope 310010</td><td></td></tr><tr><td>- Rn-Drd1a</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>317031</td><td>Canal de cor 1,</td></tr><tr><td>Sonda RNAscope Verde - Rn-Th-C2</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>314651-C2</td><td>Canal de cor 2,</td></tr><tr><td>Laranja RNAscope Kit de Reagentes Multiplex Fluorescentes</td><td>Diagnóstico Celular Avançado&nbsp;</td><td>320850</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Caneta de Barreira Hidrofóbica</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% de paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek rack de 24 slides vertical</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9837976</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek prato de coloração</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0731403</td><td></td></tr><tr><td>Precision Banhos de Uso Geral</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSGP28</td><td></td></tr><tr><td>Pré-tratamento 4</td><td>Diagnóstico Celular Avançado&nbsp;</td><td>320850</td><td>peças de kits</td></tr><tr><td>ProLong Gold reagente anti-desbotamento</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Amp 1-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>peças de kits</td></tr><tr><td>Amp 2-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>peças de kits</td></tr><tr><td>Amp 3-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>peças de kits</td></tr><tr><td>Amp 4-FL-Alt A</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>peças de kits</td></tr><tr><td>Pacote de software EZ-C1</td> Nikon <td>Instruments</td><td></td><td>versão 3.81b</td></tr><tr><td>Software SAS/STAT</td><td>SAS Institute, Inc.,</td><td></td><td>versão 9.4</td></tr></tbody></table>

identificação de receptor de dopamina d1-alfa dentro roedores núcleo accumbens por uma inovador rna in situ tecnologia da deteção

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

No sistema nervoso central, os receptores do subtipo de D1-alfa (Drd1α) é o mais abundante receptor de dopamina (DA), que desempenha um papel vital na regulação de desenvolvimento e crescimento neuronal. No entanto, os mecanismos subjacentes a anormalidades do receptor de Drd1α mediando respostas comportamentais e modulando a função de memória de trabalho são ainda pouco claras. Usando um romance RNA em situ da hibridação do ensaio, o atual estudo identificou dopamina Drd1α receptor Tirosina Hidroxilase (TH) RNA expressão e do circuito DA relacionados na área de núcleo accumbens (NAc) e região de substantia nigra (SNR), respectivamente. Drd1α expressão no NAc mostra um "ponto discreto" padrão de coloração. Observaram-se diferenças de sexo claro na expressão de Drd1α. Em contraste, o TH mostra um padrão de coloração "cluster". Em relação a expressão TH, ratos fêmeas exibida uma maior expressão de sinal por célula em relação a animais machos. Os métodos aqui apresentados fornecem uma novela em situ técnica de hibridização para investigar alterações na disfunção do sistema de dopamina durante a progressão de doenças do sistema nervoso central.

O atual estudo observou um "pontos discretos" padrão para a expressão de RNA nos receptores de dopamina D1-alfa (Drd1α) de coloração do CCN em ratos F344/N (figura 1A). Sinais de fluorescência individuais foram identificados facilmente e podem ser vistos como único "pontos", cada um deles representa um único transcrito de RNA dentro da célula. Para imagens de NAc que exibem os "pontos discretos" padrão de coloração, avaliamos a gama dinâmica de expressão usan...

Identificação de receptor de dopamina D1-alfa no núcleo accumbens é fundamental para esclarecer a disfunção do receptor D1 durante uma doença do sistema nervoso central. Realizamos um novela RNA em situ da hibridação do ensaio para visualizar moléculas de RNA única em uma área específica do cérebro.

Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

O objetivo geral deste novo ensaio de hibridização in-situ de RNA é visualizar moléculas únicas de RNA em uma área específica do cérebro que são críticas para esclarecer a disfunção dopaminérgica durante a doença do sistema nervoso central. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como anormalidades dopaminérgicas mediando respostas comportamentais e modulando a função da memória de trabalho. A principal vantagem deste método é que ele fornece uma nova técnica de hibridização in-situ para investigar a disfunção do sistema dopaminérgico durante a progressão de doenças do sistema nervoso central.Embora esse método possa fornecer informações sobre os níveis gerais de expressão de um mRNA alvo em uma determinada região do cérebro, ele também pode ser aplicado para determinar como os transcritos de mRNA são distribuídos pelas células de uma determinada região. Para iniciar este procedimento, dentro de cinco minutos após a colheita de um cérebro de rato adulto, mergulhe-o em nitrogênio líquido por 15 segundos. Em seguida, equilibre o cérebro a menos 20 graus Celsius em um criostato por uma hora.Após uma hora, corte seções de 30 mícrons contendo núcle

identification-dopamine-d1-alpha-receptor-within-rodent-nucleus

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Este vídeo demonstra o implante de eletrodos e cânulas em um rato anestesiado para medir a liberação de dopamina no núcleo accumbens usando um potenciostato e a infusão de drogas para modular a atividade dopaminérgica na área tegmental ventral.

Monitorando a liberação de dopamina em um modelo de rato com manipulação do receptor de neurônio dopaminérgico VTA

Este vídeo demonstra a detecção da síntese de RNA do receptor de serotonina usando sondas de oligonucleotídeos no tecido cerebral de ratos afetado pela síndrome da serotonina. O protocolo inclui pré-tratamento de tecido, hibridização por sonda e detecção enzimática para visualizar e quantificar a expressão do RNA do receptor de serotonina ao microscópio.

Hibridização in situ usando sondas de oligonucleotídeos para estudar a expressão de RNA em seções cerebrais de ratos

O objetivo desta publicação é visualizar e discutir os passos operatórios de um protocolo de Northern Blot em RNA extraído de Drosophila melanogaster avançado embriões, células e tecidos. Este protocolo é particularmente útil para a detecção eficiente de espécies de ARN pequenas.

Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em Drosophila melanogaster

O isolamento de neurônios de dopamina individuais ou a área tegmental ventral com imunohistoquímica direta ou indireta é demonstrada usando captura a laser microdissection. São discutidos os parâmetros para o isolamento de tecido a partir de uma lâmina de vidro usando um laser de infravermelhos e a partir de lâminas de membrana usando a combinação de um laser infravermelho e ultravioleta.

Captura Laser Microdissection - uma demonstração do Isolamento de Pessoa dopamina Neurônios e região ventral tegmental Entire

A hibridização in situ (ISH) de RNA permite a visualização de RNAs em células e tecidos. Aqui, mostramos como a combinação de RNAscope ISH com imuno-histoquímica ou corantes histológicos pode ser usada com sucesso para detectar mRNAs localizados em axônios em seções de cérebros de camundongos e humanos.

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

Na doença de Parkinson (PD), substância negra (SNC) neurónios dopaminérgicos degenerar, conduzindo a disfunção motora. Aqui nós relatamos um protocolo para a cultura de neurônios do mesencéfalo ventral de um ratinho expressando eGFP impulsionado por uma sequência de promotor de tirosina hidroxilase (TH), a colheita neurônios fluorescentes individuais das culturas, e medir o seu transcriptoma usando RNA-seq.

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

Aqui, apresentamos um protocolo para a visualização, detecção, análise e rastreamento do tráfico endógeno de mRNA em câmara de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo usando balizas moleculares, microscopia confocal de disco giratório e análise de código aberto Software.

Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

Aqui apresentamos um método automatizado para determinação semi-quantitativa do número de neurônio dopaminérgico na substantia nigra pars compacta.

Determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na Substantia Nigra dos Modelos de Roedores usando análise automatizada de imagem

Multiplex in situ hibridização (ISH) foi empregado para visualizar simultaneamente as transcrições de dois receptores acoplados à proteína G e um fator de transcrição em todo o complexo gônico vagal do camundongo adulto. Este protocolo poderia ser usado para gerar mapas precisos dos perfis transcritivos de neurônios aferentes vagal.

Detecção de expressão receptora acoplada à proteína G em neurônios aferentes do mouse vagal usando multiplex in situ hibridização

Este estudo apresenta um método robusto para isolar mRNAs axonais usando inserções de membrana porosas, possibilitando a separação total de neurônios vs. neuritos e a purificação de RNA. Combinado com o RTddPCR, a abordagem permite a quantificação absoluta de transcritos de baixa cópia, facilitando estudos de transporte de mRNA e tradução local com alta sensibilidade, reprodutibilidade e ampla aplicabilidade experimental.

Isolamento e Quantificação de MRNAs Axonais Usando Inserções de Membrana Porosa e RTddPCR

Aprenda a técnica de hibridização in situ de RNA para visualizar moléculas únicas de RNA no núcleo accumbens de roedores. Este método inovador permite investigar a expressão do receptor de dopamina D1-alfa e suas diferenças sexuais em doenças do sistema nervoso central.

Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção (Vídeo) | JoVE Journal

Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção

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