Protocolo experimental para o uso de drosófila como um sistema modelo invertebrados para testes de toxicidade em laboratório

Este protocolo pode ser usado para entender o impacto dos tóxicos na aptidão em diferentes estágios de desenvolvimento e examinar o efeito da exposição a poluentes ao longo das gerações. Demonstrando o procedimento estarão dois alunos de graduação em meu laboratório de pesquisa que fazem parte das comunidades para construir um envolvimento ativo de tronco na Colorado State University Pueblo, Hugh Long e Tyler Harvey. Para começar a trabalhar com um contaminante ambiental de interesse, primeiro determine a dose letal de 50% do composto Drosophilia.

Use métodos estabelecidos para criar uma curva de resposta à dose. Em seguida, prepare o meio de crescimento com o composto na concentração desejada. Por exemplo, adicione o composto na alíquota de água ao fazer meio instantâneo.

Paralelamente, faça o meio de controle sem o composto adicionado. Para estabelecer a cultura da qual coletar animais experimentais, transfira os adultos reprodutivos para o meio de crescimento usando métodos padrão. Padronize o número de moscas por frasco e evite superlotar os adultos.

Em seguida, incube as moscas em condições padrão por um a quatro dias. Após a incubação, descarte os adultos, deixando para trás os ovos fertilizados para amadurecer para o teste. Em seguida, devolva os frascos na incubadora.

A exposição pode ser configurada em qualquer estágio de desenvolvimento. Além disso, os sujeitos experimentais podem ser coletados em qualquer estágio de desenvolvimento, dependendo dos objetivos experimentais. Verifique os animais em desenvolvimento diariamente para identificar o primeiro sinal do estágio de interesse, como larvas de terceiro ínstar errantes.

Para testar os efeitos da exposição no estágio de larvas errantes do terceiro ínstar, colete as larvas dentro de uma hora após o acendimento das luzes, quando elas começam a emergir do substrato alimentar. Em seguida, despeje a água e mova as larvas para um tecido de laboratório para remover suavemente o excesso de água. Depois de secas, transfira as larvas para os tubos apropriados para coleta.

Para testar os efeitos da exposição em adultos, recolha os adultos recém-fechados; A anestesia com dióxido de carbono está bem. Certifique-se de coletar as moscas antes que elas estejam reprodutivamente maduras e comecem a acasalar. Divida as moscas em grupos específicos do sexo e transfira-as para frascos carregados com o meio de controle ou contaminado experimentalmente para corresponder à exposição pré-existente.

Mais tarde, 24 horas antes de medir os contaminantes nas moscas adultas, transfira os adultos em meio de controle e contaminado para um frasco carregado com meio de controle para permitir que os adultos retirem o excesso de meio de seus corpos. Após 24 horas de preparação, as moscas podem ser testadas usando o método apropriado. Por exemplo, mudanças comportamentais podem ser testadas usando um ensaio de escolha de acasalamento.

Usando esses métodos, os estudos dos efeitos transgeracionais da exposição a contaminantes são muito fáceis. Basta configurar cruzamentos entre adultos expostos no meio de controle e estudar os efeitos da exposição ao Fnot em sua progênie. Este protocolo foi utilizado para avaliar o acúmulo, eliminação e sequestro de chumbo dentro de uma mesma geração de descendentes.

A drosófila acumulou chumbo prontamente em diferentes doses, estágios de desenvolvimento e escalas evolutivas. Usando uma exposição multigeracional, verificou-se que a exposição dos pais não é transmitida à primeira geração de filhos adultos. Portanto, utilizando este protocolo, é possível testar respostas adaptativas em diferentes escalas evolutivas, bem como efeitos transgeracionais Fnot de exposição.

Em seguida, as moscas foram criadas desde o estágio de ovo até a idade adulta em meio controle ou chumbo e testadas após 24 horas de depuração, a preferência de parceiro foi testada. As fêmeas criadas em meio com chumbo, preferencialmente acasaladas com machos expostos ao chumbo em vez de machos expostos ao controle. Por outro lado, os homens não apresentaram o mesmo viés.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar e coletar Drosophila para responder a várias perguntas e toxicologia. Uma vez dominado, este protocolo pode ser feito em um a dois meses se for executado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear suavemente as moscas, para não induzir estresse desnecessário.

Após este procedimento, outras questões como questões comportamentais, genéticas e neurológicas podem ser testadas. Não se esqueça de que trabalhar com contaminantes pode ser extremamente perigoso e precauções, como usar equipamentos de proteção individual e preparar contaminantes em um exaustor, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.