Name: Avaliação de colágeno e elastina Microarchitectures dependente de pressão nas artérias de resistência humana, ao vivo por microscopia de fluorescência etiqueta livre (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a imaginar artérias de resistência humana vivas sem marcação para analisar a relação entre microarquitetura da matriz extracelular e mecânica vascular. Este método permite quantificar elastina e colágeno sob diferentes pressões.

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Os autores agradecer o dinamarquês Molecular Biomedical Imaging Center da faculdade de ciências naturais, Universidade do Sul da Dinamarca, o uso de laboratórios e microscópios. Kristoffer Rosenstand e Ulla Melchior são reconhecidos pela excelente assistência técnica, com a pressão miografia e da imagem latente.

Os autores não têm nada para divulgar.

Este trabalho representa a nossa sugestão para uma padronizada combinada imaging e pressão miografia abordagem, valiosa para a avaliação simultânea das propriedades mecânicas de resistência das artérias e alterações relacionadas à pressão na estrutura da arterial parede ao longo de uma faixa de pressão de 0 a 100 mmHg. A abordagem apresentada foi desenvolvida utilizando equipamento construído personalizado, no entanto, pode ser usado qualquer myograph de pressão que caiba em um microscópio de fluorescência de excitação d...

A contribuição patogénica e efeitos de resistência artéria remodelação estão documentados na hipertensão essencial, diabetes e síndrome metabólica1,2,3,4,5. Decifrar a relação entre as propriedades mecânicas e microarquitetura de parede microvascular é essencial para o desenvolvimento de modelos matemáticos desta associação. Tais modelos irão melhorar a compreensão do processo de remodelação e apoiarão o desenvolvimento de modelos de silico útil para testar estratégias farmacológicas direcionamento doença relacionada a remodelação da parede arterial.
Estudos prévios focada na compreensão de como a microarquitetura da parede arterial refere-se à mecânica da parede arterial, incorporando medidas mecânicas e a microarquitetura da matriz extracelular (ECM) são executadas quase que exclusivamente em grandes , artérias elásticas conduíte de ratos ou suína6,7,8,9,10,11. Imagens das microestruturas de parede geralmente é executada usando técnicas de ópticas não-lineares, aproveitando a autofluorescência de elastina e segunda geração harmônica por colágeno. Isso permite que a imagem spatiotemporal dos dois principais componentes da matriz extracelular, elastina e colágeno, sem a necessidade de coloração. Imagem latente da parede arterial em toda a sua espessura é um desafio em artérias grandes conduit devido à dispersão da luz na mídia grossa túnica. No entanto, para determinar como a microarquitetura dos componentes estruturais da parede arterial se relacionam com as propriedades mecânicas observadas, a informação tridimensional deve ser obtida durante o teste mecânico. Para as grandes artérias como a aorta humana, isso requer montagem biaxial, testes mecânicos e imagem de regiões de interesse em pedaços de2 1-2 cm da parede arterial7,9,10, 12. apenas uma parte da parede pode ser fotografada e testada mecanicamente.
Para artérias menores de qualquer espécie (por exemplo, subcutâneo15 artérias, rato artérias mesentéricas16,17,18, , pulmonar14 e pericárdica humano13 19 , 20, rato cremaster, mesentérica, cerebral, femoral e artérias carótidas21,22,23,24,25,26, imagem de 27) da espessura da parede inteira é possível e pode ser combinada com o teste mecânico. Isto permite a gravação simultânea de propriedades mecânicas e os arranjos estruturais dentro da parede. No entanto, uma modelagem matemática direta da relação entre as alterações observadas na estrutura tridimensional da ECM e alterado as propriedades mecânicas da parede arterial de resistência, o melhor de nosso conhecimento apenas relatou em cima recentemente, na resistência humana artérias13,15.
Neste trabalho, é descrito um método ex vivo para testes mecânicos passiva e simultânea de imagem tridimensional de microarquitetura de elastina e colágeno na parede arterial das artérias de resistência humana isolada. O protocolo de imagem pode ser aplicado para as artérias de resistência de qualquer espécie de interesse. Análises de imagem são descritas para a obtenção de medidas de ângulos de ramificação de lâmina elástica interna e de retidão de colágeno adventícia13 usando Fiji28. Densidades de volume de colágeno e elastina são determinadas usando o software de Ilastik29 , e finalmente, a inclusão dos dados mecânicos e da imagem latente em modelos matemáticos da mecânica da parede arterial é discutida.
O objetivo de descrever as imagem e imagem análises técnicas em combinação com a modelagem matemática é proporcionar a investigadores uma abordagem sistemática para descrever e compreender observadas mudanças de pressão induzida em ECM das artérias de resistência. O método descrito é focado em quantificar as alterações em ECM em um navio durante a pressurização, comparando a estrutura de ECM em 20, 40 e 100 mmHg. Essas pressões foram escolhidas para determinar a estrutura da parede arterial em sua mais compatível (20 mmHg), stiff (100 mmHg) e estado intermediário (40 mmHg), respectivamente. No entanto, qualquer processo na parede vascular das artérias ao vivo, incluindo alterações induzidas por componentes vasoativas, histerese e fluxo, pode ser quantificado, dependendo a hipótese de investigação em questão pelo investigador.
O uso da microscopia de fluorescência de excitação de dois fotões (TPEM) em combinação com um myograph de pressão para mudanças de pressão (ou outro) induziu a estudar em ECM das artérias ao vivo é enfatizado. Primeiro, porque isso permite a aquisição simultânea da estrutura global tridimensional da parede arterial (espessura de diâmetro e parede), juntamente com a aquisição de etiqueta livre tridimensional de alta qualidade, detalhadas imagens de colágeno e elastina microarchitectures como descrito13 , aproveitando a autofluorescência de elastina e colágeno segunda geração harmônica sinal (SHG)30. Em segundo lugar, TPEM permite uso de luz de baixa energia infravermelha excitação, minimizando Fotodano do tecido e assim, imagens repetidas em exatamente na mesma posição dentro da parede vascular é permitido, permitindo análises de medições repetidas do observado alterações.
O uso de uma abordagem alternativa, usando a imagem latente confocal de pressão fixada artérias é discutido para permitir que usuários sem acesso ao TPEM a oportunidade de usar o método descrito também. Informações sobre densidades de ECM estrutura e volume também podem ser obtidas de análises bidimensionais de tecidos seccionados em série, por exemplo, como descrito por31,32. No entanto, devido à falta de possibilidade para recuperar informações estruturais tridimensionais sobre as escalas de comprimento da artéria, bem como durante a mudança de condições usando este método, é que não recomendo usar essa abordagem para investigações de pressão e tratamento induzido por alterações tridimensionais em ECM.
O requisito mínimo para o investigador aplicar o método descrito neste documento é o acesso a uma instalação para canulação e pressurização das artérias em combinação com um microscópio de fluorescência confocal ou dois fotões de excitação. A configuração descrita no seguinte protocolo é um myograph de pressão Custom-Built com um transdutor de força longitudinal, construído para caber em um microscópio de fluorescência personalizado construído invertido dois fotões da excitação.

<table><tbody><tr><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15401-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11251-23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>761028</td><td>para fins</td><td></td>de dissecação</tr><tr><td>Vitrex Medical A/S, Herlev, Dinamarca</td><td>1.63, 2.13, 210mm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smiths medical Intl, Reino Unido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethicon</td><td>Ethilon 11-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Número de patente DK personalizado 201200167, Universidade do Sul da Dinamarca, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt</td><td></td>Mettler toledo <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>B3259</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>A7030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>C5670</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>G7021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>E3889</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merck Millipore, Hellerup, Dinamarca</td><td>1.00496.9010</td><td>Tamponamento fosfato (pH 6.9) Solução de formaldeído a 4%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>H3784</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>P9666</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>P5655</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>M2643</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>S2002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>S5886</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>S5761</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>1.06462</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>10010015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>PHR1423</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dinamarca.</td><td>Z370525</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido</td><td>538944</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra Physics, Mountain View, CA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>CFI Plan Fluor 20XMI (multi-imersão) NA 0.75</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu, Ballerup, Dinamarca</td><td>H7422P-40</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A AHF analysentechnik AG (T&uuml; bingen, Alemanha).</td><td>ChromaET 460 nm dichroic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml; bingen, Alemanha).</td><td>Semrock FF01-520/35-25 Filtro</td><td></td><td></td>BrightLine</tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml; bingen, Alemanha).</td><td>Chroma ET402/15X&nbsp;</td><td></td><td></td></tr> A espessura da lamínula <tr><td>Scotch TM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>deve corresponder à objetiva usada no microscópio (# 1 ou # 1,5), alternativamente, defina o colar de ajuste para combinar com a lamínula</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação de colágeno e elastina microarchitectures dependente de pressão nas artérias de resistência humana, ao vivo por microscopia de fluorescência etiqueta livre

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

A contribuição de patogenicidade de resistência artéria remodelação está documentada em hipertensão essencial, diabetes e síndrome metabólica. Investigações e desenvolvimento de modelos matemáticos microstructurally motivados para compreender as propriedades mecânicas das artérias de resistência humana na saúde e na doença têm o potencial para auxiliar a compreensão como doenças e tratamentos médicos afetam a microcirculação humana. Para desenvolver estes modelos matemáticos, é essencial para decifrar a relação entre as propriedades mecânicas e microarquitetura de parede microvascular. Neste trabalho, descrevemos um método ex vivo para testes mecânicos passiva e simultânea de imagem tridimensional livre de rótulo de microarquitetura de elastina e colágeno na parede arterial das artérias de resistência humana isolada. O protocolo de imagem pode ser aplicado para as artérias de resistência de qualquer espécie de interesse. Análises de imagem são descritas para quantificar alterações i) pressão induzida em ângulos ramificação lâmina elástica interna e retidão de colágeno adventícia usando Fiji e densidades de volume ii) colágeno e elastina determinadas utilizando o software Ilastik. De preferência todas as medidas de mecânicas e de imagem são executadas em artérias perfundidas, ao vivo, no entanto, uma abordagem alternativa usando pressão standard de vídeo-microscopia miografia em combinação com pós-fixação imagem de vasos re-pressurizados discutido. Este método alternativo fornece aos usuários com diferentes opções de abordagens de análise. A inclusão dos dados mecânicos e da imagem latente em modelos matemáticos da mecânica da parede arterial é discutida, e propõem-se desenvolvimento futuro e adições ao protocolo.

O myograph de pressão custom-built para a imagem latente usado neste trabalho é mostrado na Figura 1. Especial atenção para a concepção do myograph foi pago para i) a câmara com um pequeno volume (2ml) e ii) a possibilidade de posicionamento as cânulas perto de e em paralelo com o fundo de vidro (figura 1B). O fundo da câmara se encaixa um 50 × 24 mm #1.5 vidro lamela (substituíveis). O controlador de pressão foi construído a par...

Descrevemos teste mecânico simultânea e imagens 3D de parede arterial isolada, viver artérias de resistência humana e análises de imagem de Fiji e Ilastik para a quantificação de elastina e colágeno espacial organização e volume densidades. Discutimos a utilização desses dados em modelos matemáticos da mecânica da parede arterial.

Avaliação de colágeno e elastina Microarchitectures dependente de pressão nas artérias de resistência humana, ao vivo por microscopia de fluorescência etiqueta livre

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

O objetivo geral desta metodologia é fornecer um procedimento padronizado para a obtenção de imagens de artérias de resistência humanas vivas para análise da relação entre a microarquitetura da matriz extracelular e a mecânica da parede arterial. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia e mecânica vascular, como a forma como a pressão induz mudanças na geometria geral, bem como na microarquitetura da parede vascular. A principal vantagem da técnica é que você não precisa rotular sua amostra para a imagem.Embora esse método possa fornecer informações sobre a mecânica das artérias de resistência, uma versão modificada do protocolo pode ser aplicada a outros órgãos semelhantes a tubos, como os brônquios ou a tiras da bexiga humana ou da parede intestinal. Para começar, colete amostras de tecido de interesse imediatamente após sua excisão durante a cirurgia e prepare os vasos conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Pressurize uma artéria canulada a cinco milímetros de mercúrio.Em seguida, configure o caminho óptico para a imagem ativando o laser de dois fótons e definindo o comprimento de onda de excitação para 820 nanômetros. Insira um espelho dicróico de passagem longa de 460 nanômetros para dividir a luz de emissão entre os fotomultiplicadores e coletar a emissão simultaneamente em dois canais. Use filtros passa-banda de 30 a 60 nanômetros de largura centrados em 520 nanômetros para coletar a autofluorescência da elastina e outro centrado em 410 nanômetros para coletar o sinal de geração do segundo harmônico de colágeno.Agora defina o tempo de permanência do laser e o pixel para 10 microssegundos. Defina a resolução para 512 por 512 pixels para 100% do campo de visão. Ative a varredura contínua e use o mínimo possível de potência de luz de excitação e tempo de permanência de pixel para evitar que a foto danifique a artéria ativa.Em seguida, escaneie manualmente a artéria para encontrar o plano com o diâmetro máximo. Em seguida, escolha uma fatia retangular cobrindo o diâmetro mais largo da artéria e escaneie um único quadro com um tamanho de pixel de 300 nanômetros por pixel ou menos. Salve esta imagem para análise posterior.Para determinar o diâmetro do lúmen e a espessura da parede no diâmetro máximo da artéria, primeiro carregue a imagem em Fiji. Defina a escala clicando no menu principal e depois vá para analisar seguido de definir escala. Aqui, insira o micrômetro por pixel e a proporção de pixels.Em seguida, escolha a ferramenta de linha Fiji e desenhe uma linha entre as duas lâminas elásticas internas em cada lado do lúmen arterial. Em seguida, clique em Control M para relatar o comprimento na tabela de resultados. Continue desenhando mais linhas para medir a espessura de cada parede e salve a medição final.Mude para uma objetiva de 60X com uma abertura numérica de um ou mais. Imagem da microarquitetura de colágeno e elastina a cinco milímetros de mercúrio, examinando toda a espessura da parede arterial. Em seguida, defina a profundidade inicial e final da pilha Z e o espaçamento da etapa Z e a densidade de pixels.Ao projetar suas pilhas Z, certifique-se de que sua região de interesse seja pequena o suficiente para evitar qualquer inferência de curvatura em sua análise subsequente. Quando terminar, defina cada canal a ser salvo separadamente. Por fim, encontre de uma a três regiões diferentes de interesse e obtenha pilhas de imagens 3D de boa qualidade.Se a sua autofluorescência de elastina estiver branqueando, você está usando uma potência de luz de excitação muito alta. Isso deve ser evitado. Para terminar seu experimento em andamento, você pode adicionar uma concentração diluída de eosina para aumentar a autofluorescência da elastina.Quando terminar, repita todo o processo em pressões que variam até 100 milímetros de mercúrio, substituindo o tampão na câmara do miógrafo por HBS fresco de 37 graus Celsius após cada etapa de pressão. Para iniciar a análise de imagens, abra a pilha de imagens de elastina em Fiji. Em seguida, vá para a imagem, clique em pilhas e selecione o projeto Z para escolher as imagens com as quais trabalhar e escolha a intensidade máxima para o tipo de projeção.Salve a projeção de intensidade máxima como uma imagem TIFF. Em seguida, escolha o maior número possível de pontos de ramificação de fibra de lâmina elástica interna e meça-os usando a ferramenta de ângulo. Trabalhe sistematicamente em cada imagem e, quando terminar, salve a folha de resultados de Fiji.Para medir a ondulação do colágeno adventício, abra a pilha de imagens de colágeno em Fiji. Em seguida, vá para a imagem até as pilhas e selecione o projeto Z para escolher as imagens com as quais trabalhar e definir a projeção de intensidade máxima. Agora altere o tipo de imagem para uma imagem TIFF de oito bits clicando em imagem, digite e, em seguida, em oito bits.Salve a projeção de intensidade máxima como uma imagem TIFF. Abra o plug-in Neuron J clicando em Fiji e selecionando Neuron J em plug-ins. Em seguida, abra o arquivo TIFF de oito bits no Neuron J.Uma vez aberto, clique em adicionar traçados e selecione as fibras a serem analisadas clicando no início e no final de cada fibra.Em seguida, vá para medir traçados e escolha exibir traçado e medidas de vértice na caixa de diálogo. Para calcular a retidão da fibra de colagem, primeiro copie os valores na janela de traçados de Fiji para o Excel. Os valores de comprimento na janela de traçados são medidas dos comprimentos completos das fibras de colágeno analisadas Lf.Segundo, cópia para cada feixe de fibras de colágeno analisou a primeira e a última coordenadas XY da janela de vértices de Fiji para o Excel.Em seguida, calcule o comprimento da linha reta que conecta cada extremidade da fibra colágena L0 analisada usando o Teorema de Pitágoras. A retidão da fibra de colágeno é finalmente calculada como L0 / Lf. Seguindo o protocolo que acabamos de mostrar, a parte mais larga da artéria foi identificada e, neste ponto, a artéria foi escaneada usando microscopia de fluorescência sem marcação para medir o diâmetro máximo do vaso e a espessura da parede do vaso.Utilizando uma ampliação maior para objetiva de alta abertura numérica, não apenas o diâmetro do vaso e a espessura da parede podem ser medidos, mas também as microarquiteturas de colágeno e elastina. As microarquiteturas dos ângulos de ramificação da fibra de elastina e da retidão do colágeno podem ser determinadas em seções consecutivas de imagem usando o software de análise de imagem apropriado. Isso permite uma análise direta da relação entre as mudanças induzidas pela pressão nas microarquiteturas de colágeno e elastina e o módulo de elasticidade incremental em diferentes pressões.Seguindo este procedimento, outras informações também podem ser extraídas das imagens. Podem ser os anjos de orientação do colágeno adventício ao longo do eixo longitudinal do vaso ou pode ser a microarquitetura da matriz extracelular na túnica média. As medidas quantitativas extraídas das imagens usando este método podem ser alimentadas em modelos matemáticos para elucidar como a circulação humana saudável e falecida responde a diferentes condições.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão completa sobre como projetar seus experimentos de imagem e subsequente análise de imagem para extrair informações sobre como a pressão induz mudanças na microarquitetura da parede da artéria de resistência. Lembre-se de que você deve evitar qualquer exposição à luz visível e invisível ao trabalhar com microscopia de fluorescência de excitação de dois fótons.

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Bioengineering

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