Avaliação de colágeno e elastina Microarchitectures dependente de pressão nas artérias de resistência humana, ao vivo por microscopia de fluorescência etiqueta livre

O objetivo geral desta metodologia é fornecer um procedimento padronizado para a obtenção de imagens de artérias de resistência humanas vivas para análise da relação entre a microarquitetura da matriz extracelular e a mecânica da parede arterial. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia e mecânica vascular, como a forma como a pressão induz mudanças na geometria geral, bem como na microarquitetura da parede vascular. A principal vantagem da técnica é que você não precisa rotular sua amostra para a imagem.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a mecânica das artérias de resistência, uma versão modificada do protocolo pode ser aplicada a outros órgãos semelhantes a tubos, como os brônquios ou a tiras da bexiga humana ou da parede intestinal. Para começar, colete amostras de tecido de interesse imediatamente após sua excisão durante a cirurgia e prepare os vasos conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Pressurize uma artéria canulada a cinco milímetros de mercúrio.

Em seguida, configure o caminho óptico para a imagem ativando o laser de dois fótons e definindo o comprimento de onda de excitação para 820 nanômetros. Insira um espelho dicróico de passagem longa de 460 nanômetros para dividir a luz de emissão entre os fotomultiplicadores e coletar a emissão simultaneamente em dois canais. Use filtros passa-banda de 30 a 60 nanômetros de largura centrados em 520 nanômetros para coletar a autofluorescência da elastina e outro centrado em 410 nanômetros para coletar o sinal de geração do segundo harmônico de colágeno.

Agora defina o tempo de permanência do laser e o pixel para 10 microssegundos. Defina a resolução para 512 por 512 pixels para 100% do campo de visão. Ative a varredura contínua e use o mínimo possível de potência de luz de excitação e tempo de permanência de pixel para evitar que a foto danifique a artéria ativa.

Em seguida, escaneie manualmente a artéria para encontrar o plano com o diâmetro máximo. Em seguida, escolha uma fatia retangular cobrindo o diâmetro mais largo da artéria e escaneie um único quadro com um tamanho de pixel de 300 nanômetros por pixel ou menos. Salve esta imagem para análise posterior.

Para determinar o diâmetro do lúmen e a espessura da parede no diâmetro máximo da artéria, primeiro carregue a imagem em Fiji. Defina a escala clicando no menu principal e depois vá para analisar seguido de definir escala. Aqui, insira o micrômetro por pixel e a proporção de pixels.

Em seguida, escolha a ferramenta de linha Fiji e desenhe uma linha entre as duas lâminas elásticas internas em cada lado do lúmen arterial. Em seguida, clique em Control M para relatar o comprimento na tabela de resultados. Continue desenhando mais linhas para medir a espessura de cada parede e salve a medição final.

Mude para uma objetiva de 60X com uma abertura numérica de um ou mais. Imagem da microarquitetura de colágeno e elastina a cinco milímetros de mercúrio, examinando toda a espessura da parede arterial. Em seguida, defina a profundidade inicial e final da pilha Z e o espaçamento da etapa Z e a densidade de pixels.

Ao projetar suas pilhas Z, certifique-se de que sua região de interesse seja pequena o suficiente para evitar qualquer inferência de curvatura em sua análise subsequente. Quando terminar, defina cada canal a ser salvo separadamente. Por fim, encontre de uma a três regiões diferentes de interesse e obtenha pilhas de imagens 3D de boa qualidade.

Se a sua autofluorescência de elastina estiver branqueando, você está usando uma potência de luz de excitação muito alta. Isso deve ser evitado. Para terminar seu experimento em andamento, você pode adicionar uma concentração diluída de eosina para aumentar a autofluorescência da elastina.

Quando terminar, repita todo o processo em pressões que variam até 100 milímetros de mercúrio, substituindo o tampão na câmara do miógrafo por HBS fresco de 37 graus Celsius após cada etapa de pressão. Para iniciar a análise de imagens, abra a pilha de imagens de elastina em Fiji. Em seguida, vá para a imagem, clique em pilhas e selecione o projeto Z para escolher as imagens com as quais trabalhar e escolha a intensidade máxima para o tipo de projeção.

Salve a projeção de intensidade máxima como uma imagem TIFF. Em seguida, escolha o maior número possível de pontos de ramificação de fibra de lâmina elástica interna e meça-os usando a ferramenta de ângulo. Trabalhe sistematicamente em cada imagem e, quando terminar, salve a folha de resultados de Fiji.

Para medir a ondulação do colágeno adventício, abra a pilha de imagens de colágeno em Fiji. Em seguida, vá para a imagem até as pilhas e selecione o projeto Z para escolher as imagens com as quais trabalhar e definir a projeção de intensidade máxima. Agora altere o tipo de imagem para uma imagem TIFF de oito bits clicando em imagem, digite e, em seguida, em oito bits.

Salve a projeção de intensidade máxima como uma imagem TIFF. Abra o plug-in Neuron J clicando em Fiji e selecionando Neuron J em plug-ins. Em seguida, abra o arquivo TIFF de oito bits no Neuron J.Uma vez aberto, clique em adicionar traçados e selecione as fibras a serem analisadas clicando no início e no final de cada fibra.

Em seguida, vá para medir traçados e escolha exibir traçado e medidas de vértice na caixa de diálogo. Para calcular a retidão da fibra de colagem, primeiro copie os valores na janela de traçados de Fiji para o Excel. Os valores de comprimento na janela de traçados são medidas dos comprimentos completos das fibras de colágeno analisadas Lf.Segundo, cópia para cada feixe de fibras de colágeno analisou a primeira e a última coordenadas XY da janela de vértices de Fiji para o Excel.

Em seguida, calcule o comprimento da linha reta que conecta cada extremidade da fibra colágena L0 analisada usando o Teorema de Pitágoras. A retidão da fibra de colágeno é finalmente calculada como L0 / Lf. Seguindo o protocolo que acabamos de mostrar, a parte mais larga da artéria foi identificada e, neste ponto, a artéria foi escaneada usando microscopia de fluorescência sem marcação para medir o diâmetro máximo do vaso e a espessura da parede do vaso.

Utilizando uma ampliação maior para objetiva de alta abertura numérica, não apenas o diâmetro do vaso e a espessura da parede podem ser medidos, mas também as microarquiteturas de colágeno e elastina. As microarquiteturas dos ângulos de ramificação da fibra de elastina e da retidão do colágeno podem ser determinadas em seções consecutivas de imagem usando o software de análise de imagem apropriado. Isso permite uma análise direta da relação entre as mudanças induzidas pela pressão nas microarquiteturas de colágeno e elastina e o módulo de elasticidade incremental em diferentes pressões.

Seguindo este procedimento, outras informações também podem ser extraídas das imagens. Podem ser os anjos de orientação do colágeno adventício ao longo do eixo longitudinal do vaso ou pode ser a microarquitetura da matriz extracelular na túnica média. As medidas quantitativas extraídas das imagens usando este método podem ser alimentadas em modelos matemáticos para elucidar como a circulação humana saudável e falecida responde a diferentes condições.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão completa sobre como projetar seus experimentos de imagem e subsequente análise de imagem para extrair informações sobre como a pressão induz mudanças na microarquitetura da parede da artéria de resistência. Lembre-se de que você deve evitar qualquer exposição à luz visível e invisível ao trabalhar com microscopia de fluorescência de excitação de dois fótons.