Montagem e purificação do protótipo vírus espumoso Intasomes

O objetivo geral deste procedimento é montar e purificar protótipos de intassomas de vírus espumosos que podem ser usados para estudos bioquímicos, estruturais e cinéticos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da retrovirologia, como a mecânica e a dinâmica da integração. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o isolamento de complexos de integração em vez de uma mistura heterogênea de espécies.

A demonstração visual deste método é benéfica, pois a recuperação e a solubilização de complexos de integração são críticas para garantir o rendimento ideal do intasasso. Para começar, combine o tampão 1XTEN, 10 oligo-1 micromolar e 10 oligo-2 micromolar em um volume final de 1,5 mililitros. Em seguida, alíquota de 25 microlitros da mistura em 60 tubos de reação de mudança de polimerase de 0,2 mililitro.

Recozer o DNA usando um termociclador com os tempos e temperaturas listados no protocolo de texto. Após a reação, combine as reações de recozimento de todos os 60 tubos. Em seguida, carregue 500 microlitros de duas unidades de concentração de filtro ultracentrífugo de corte de peso molecular de 0,5 mililitro e três quilodaltons.

Concentrar o ADN viral recozido por centrifugação numa microcentrífuga a 14 000 vezes g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Depois de descartar o fluxo, adicione 250 microlitros do DNA viral recozido restante a cada unidade de filtro. Repita a centrifugação até que restem aproximadamente 50 microlitros e descarte o fluxo.

Em seguida, troque a amostra em tampão TE lavando três vezes com 450 microlitros de TE. Após a troca do tampão, inverta a unidade de filtro e gire a 1000 vezes g por dois minutos em temperatura ambiente. O volume final retido para cada unidade de filtragem deve ser de aproximadamente 50 microlitros. Combine os retentados e transfira para um tubo com tampa de rosca de 1,5 mililitro.

Finalmente, meça a absorção ultravioleta de 260 nanômetros do DNA viral para calcular a concentração de DNA. Para montar os intassomos, combine 50 milimolares bis-tris propano pH 7,5, 500 milimolares de cloreto de sódio, 120 micromolares PFV integrase e 50 micromolares de DNA viral em um volume total de 150 microlitros. Limpe um pedaço de 10 centímetros de comprimento de 10 milímetros de diâmetro, tubo de diálise de corte de peso molecular de seis a oito quilodalton e os clipes associados com água destilada dupla ou água com a mais alta pureza disponível.

Prenda uma extremidade do tubo, enxágue o interior do tubo de diálise três vezes com um a dois milímetros de tampão de enxágue. Remova o máximo possível do tampão de enxágue com a pipeta e a ponta de carregamento de gel fino. Em seguida, transfira o conjunto do intassoma para o tubo de diálise com a pipeta e uma ponta fina de carregamento de gel.

Certifique-se de que o conjunto seja expelido diretamente na parte inferior do tubo de diálise. Prenda a extremidade aberta do tubo de diálise, minimizando a quantidade de ar introduzida dentro do tubo. Em seguida, coloque o tubo no tampão de diálise.

Dialise durante a noite com movimentos suaves para que o tubo gire, mas não fique em um vórtice. Certifique-se de que o tubo de diálise esteja submerso e móvel. Após aproximadamente uma hora, o precipitado deve estar visível dentro da tubulação.

Prepare duas pontas de pipeta de diâmetro largo removendo de dois a quatro mililitros da extremidade de uma ponta de 200 microlitros com uma nova lâmina de barbear ou bisturi em uma superfície limpa. Remova o tubo de diálise do tampão de diálise. Para evitar a diluição da amostra de intassoma com tampão de diálise que pode permanecer na extremidade do tubo perto do clipe, use uma micropipeta com uma pequena ponta de pipeta para remover qualquer excesso de tampão de diálise.

Remova o clipe desta extremidade do tubo de diálise. Ao recuperar o conjunto, é importante coletar o máximo possível da solução e precipitar. Use a ponta de propeto de furo largo para transferir a amostra, incluindo o precipitado, dentro do tubo de diálise, para um tubo de 1,5 mililitro no gelo.

Observe o volume total do material recuperado. O volume total é normalmente de aproximadamente 140 microlitros. A amostra com precipitado é de cloreto de sódio a 200 milimolares.

Aumentar o sal até uma concentração final de 320 milimolares de cloreto de sódio, adicionando o volume adequado de uma solução-mãe de cloreto de sódio de cinco molares. Transfira o balde de gelo com a amostra para uma câmara fria de quatro graus Celsius. Use a ponta da pipeta de furo largo para ressuspender e solubilizar o precipitado por pipetagem.

Repita a cada 20 minutos por pelo menos uma hora. A maior parte do precipitado deve entrar em solução. Para purificar o intasoma, equilibre uma cromatografia reticulada de exclusão de tamanho de agarose ou coluna SEC com tampão de execução SEC a uma taxa de fluxo de 0,4 mililitros por minuto.

Centrifugar a amostra de intassoma numa microcentrífuga a 14 000 vezes g durante 10 minutos a quatro graus Celsius para pulverizar qualquer precipitado restante. Depois de remover cuidadosamente o sobrenadante, coloque-o em um loop de injeção de 200 microlitros. Aplique o exemplo à coluna SEC.

Eluir com 25 mililitros de buffer de funcionamento SEC e coletar 95 frações de 270 microlitros. Observe que o cromatograma SEC exibe três picos A280 e A260. Combine dois microlitros de cada fração de pico do intassoma em 50 nanogramas de DNA de plasma super enrolado de três quilobases em tampão de reação em um volume de reação final de 15 microlitros.

Inclua também um controle negativo sem adição de intassoma de PFV. Incube a 37 graus Celsius por cinco minutos. Pare a reação com 0,75 microlitros de proteinase K e 0,75 microlitros de SDS.

Em seguida, incubar a amostra a 55 graus Celsius durante uma hora. Em seguida, adicione três microlitros de glicerol a 50% a cada reação de integração. Carregue todo o volume de reação em um por cento de peso por volume de gel de agarose.

Além disso, carregue um microlitro de marcador de tamanho de DNA de 10 quilobases nas pistas de cada lado das amostras. Em uma pista externa, carregue seis microlitros de corante laranja G. Execute o gel em tensão constante, 10 volts por centímetro, em temperatura ambiente por uma hora ou até que a frente do corante laranja G atinja o final do gel.

Visualize imediatamente o gel de agarose com um scanner fluorescente configurado para detectar brometo de etídio. Esta imagem deve mostrar a integração concertada como uma banda que corre fiel ao tamanho em três kilobases. Depois de quantificar as bandas em cada pista com o software de imagem, selecione as frações que têm a atividade de integração mais combinada.

Distribuir cada fracção em alíquotas de cinco microlitros. Finalmente, congele as alíquotas em nitrogênio líquido antes de armazená-las a 80 graus Celsius negativos. Um cromatograma representativo de uma purificação do conjunto de intassoma PFV é mostrado.

Três picos são visíveis. O pico central se correlaciona com os intassomos montados corretamente. A eficiência de integração como uma fração do pico da cromatografia central é mostrada.

Os intassomos foram testados quanto à atividade sem e com congelamento e descongelamento. O congelamento e o descongelamento não mostraram diferença no gel de agraose corado com brometo de etídio dos produtos da reação de integração. Aqui, são indicados plasbid superenrolado, produtos de integração combinados, produtos de integração de meia mira e DNA viral não reagido.

A quantificação da eficiência de integração da imagem do brometo de etídio também confirma que não há perda de atividade de integração após o congelamento e descongelamento. Isso permite armazenamento de longo prazo. A molécula e a posição do rótulo afetam a eficiência da montagem do intassoma PFV.

Intassomas não rotulados e uma etiqueta Cy5 interna exibem eficiência de montagem equivalente. No entanto, o rótulo final Cy5 ou a biotina reduzem a eficiência da montagem. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias se for executada corretamente.

Após este procedimento, outros métodos, como ensaios bioquímicos e de molécula única, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre integração, cinética e dinâmica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como montar, purificar e avaliar funcionalmente os intassomas do PFV.