Name: De Novo Geração de células-tronco somáticas por YAP/TAZ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Aprenda a reprogramar células diferenciadas em células progenitoras usando o fator de transcrição YAP. Este método permite gerar células-tronco somáticas para aplicações em medicina regenerativa e estudos de plasticidade celular.

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Agradecemos o dom da tetO-YAPS127A ratos; F. Camargo R26-rtTAM2 ratos (estoque #006965) foram adquiridos a partir do laboratório de Jackson. Agradecemos a Chiara Frasson e Giuseppe Basso para ajuda com procedimentos de FACS. Este trabalho é apoiado pela AIRC especial programa Molecular oncologia clínica ' 5 milésimas ' e um AIRC PI-Grant a Samira e pelo projecto emblemático de Epigenetics CNR-Miur concede ao S.P. Este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação (CEI), no âmbito da União Europeia Horizonte 2020 programa de investigação e inovação (conceder o acordo DENOVOSTEM no. 670126).

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<li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
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<li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li>
<li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li>
<li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li>
<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
<li>Lentiviral production and infection. , 
 <a target="_blank" href="http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf">http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf</a> (2016).</li>
</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Aqui apresentamos os protocolos para reprogramar ex vivo terminalmente diferenciadas células epiteliais dos diferentes tecidos em suas células progenitoras do tecido-específica correspondentes (ou ySCs) pela expressão transiente de YAP, como relatado anteriormente1. Temos detalhados dois procedimentos: um permitindo a reprogramação de células FACS-purificado através de Lentivirus vetores e um segundo, o que evita a infecção viral e aproveita-se da expressão de YAP transgénico. Cada protocolo apresenta uma estratégia eficiente de isolar e células diferenciadas primário de cultura e uma estratégia para forçar exógena YAP expressão do gene em células diferenciadas, gerando de novo somática tecido-específica expansível células-tronco (veja esquemas em Figuras 1A e 2A).
Temos demonstrado que as estratégias de isolamento aqui apresentadas efetivamente isolar uma população pura de células diferenciadas, como demonstrado pelo fato de que nós nunca detectado qualquer consequência de amostras de controlo negativo (figuras 1 e 2-C).
Os vetores de Lentivirus usados neste estudo para a reprogramação de células primárias de LD mamárias são doxiciclina inducible, oferecendo a possibilidade de um controlo apertado da expressão do transgene; Isto permite ligar e fora YAP exógena expressão na vontade. Especial atenção deve ser colocada em evitar o uso de uma excessiva concentração viral, como isso pode ser prejudicial em termos de eficiência de reprogramação. No caso de células acinares primárias, nós mudamos para uma abordagem totalmente transgênica para obter uma reprogramação de YAP-dependente com mínima manipulação. Esta última estratégia também é particularmente apropriada para primários ácinos pancreáticos, como clusters acinares isoladas são dificilmente passível de Lentivirus infecção e muito frágil. A estratégia transgénica empregada oferece a mesma vantagem de vetores de Lentivirus doxiciclina-dependente para o controle apertado de expressão gênica. Além disso, a estratégia de transgénica explorada com ácinos pancreáticos principais tem a vantagem adicional de uma eficiência muito maior reprogramação comparada ao viral induzida a reprogramação de células mamárias de LD. Além a plasticidade intrínseca diferente associada às células derivadas de tecidos diferentes, a maior taxa de reprogramação do pâncreas pode ser derivada a maior eficiência de expressão associada à expressão de YAP autônomo e uniforme em toda a células explantadas. Notavelmente, demonstrámos que YAP exógena não é mais necessária após a geração de ySCs (colônias de yMaSC e yDucts), sem afetar sua capacidade de auto-renovação. Isso ocorre porque ySCs reativar YAP/TAZ endógena e usá-los de auto-renovação quando YAP exógena é desligado1.
Nós validado a noção de que ySCs fato emergem de células diferenciadas, controlando a célula de origem de nossos experimentos reprogramação através de de validações de linhagem de rastreamento genético1.
Caracterização de extensade ySCs mostra que induzida por YAP reprogramação gera normal somática SCs1 como eu) a nível transcriptomic, ySCs exibir sobreposições maciças com SCs nativos; II) ySCs exibir o potencial de diferenciação e pode gerar uma descendência multilineage sempre restringida à identidade dos seus tecidos de origem; III) ySCs são não-transformada e não-oncogenicidade quando transplantadas em vivo.
Aqui nós também descrevem os procedimentos para manter e expandir na cultura tanto yMaSCs e yDucts como organoids incorporado na membrana basal de 100% matriz de hidrogel. Estas condições permitem a auto-organização de ySCs em organoids tridimensional que garantem a manutenção de propriedades de stemness a longo prazo em cultura, permitindo expandir estas populações à vontade para jusante análises e aplicações-tronco. Por razões desconhecidas, falha ao obter yMaSC organoids colocando infectados células LD diretamente nas condições de cultura de organoides 7 dias após o tratamento de doxiciclina em placa de cultura de tecido plástico; em outras palavras, a etapa intermediária de crescimento em condições de colônia mamária é essencial. Em nossas mãos, mesmo nativos MaSCs exigem condições de colônia mamária antes de passagem na cultura de organoides. Além disso, a consequência de organoides mais eficiente é obtida quando podemos evitar dissociando as principais colônias em células individuais, mas prefiro transferir as colônias intactas em condições de cultura organoides.
As condições de cultura organoides também têm a vantagem de dar a possibilidade de cryopreserve ySCs, desde que os organoids sejam recuperadas de suas matrizes, evitando a dissociação de células antes da criopreservação em banho de nitrogênio.
O YAP reprogramação procedimento apresentado pode converter tipos de célula diferenciada distintos derivados de diferentes tecidos adultos em suas células-tronco tecido-específica correspondentes (nós testamos usando células mamárias, pancreáticas e neuronais)1. A diferença de iPSCs ou outros esforços de reprogramação, SCs YAP/induzida podem manter as memórias de seu tecido de origem. Digno de nota, a diferenciação de células somáticas em células dotados de propriedades de haste-como é a única forma de plasticidade de célula destino e reprogramação observados in vivo, por exemplo após o dano tecidual e para oferecer suporte a5,17 de cicatrização de feridas , 18 , 19 , 20. é digno de nota que o YAP e TAZ são em grande parte dispensável para homeostase normal, mas crucial para o reparo de tecido em vários tecidos11,21. Consistentemente com uma função fisiológica das etapas reprogramação aqui descrito, YAP/TAZ recentemente demonstraram ser exigido em regeneração intestinal em modelos do rato de pacientes de colite ulcerativa, causando uma conversão de células intestinais adultas em um epitélio reparação que exibe características do intestino fetal19. YAP reprogramação assim expande as estratégias atuais de plasticidade celular induzida, fornecendo um meio de gerar células-tronco somáticas, um estado que tem sido até agora um desafio para capturar em vitro. Esta abordagem, se estendeu também para humanos-derivado de células, pode ter relevância ampla de aplicações da medicina regenerativa para o estudo do estado stemness somática e para expansão de somática tronco células em vitro.

Células-tronco tecido-específicas somáticas (SCs) são vitais para a reparação e renovação de tecidos após lesão. A possibilidade de isolar facilmente e expandir ilimitadamente ex vivo somática SCs representa um problema crítico para potenciais terapias regenerativas, bem como para aplicações de SC em pesquisa básica e modelagem de doença. Progresso nesse sentido, no entanto, tem sido limitado pela dificuldade de captura do estado de SC de vários órgãos epiteliais em vitro. Com efeito, em vários tecidos adultos residentes SCs podem não existir, ou não estar prontamente disponíveis, ou o número e o potencial regenerativo podem ser corroídas por condições de envelhecimento ou a doença. Em 2016, começamos a preencher esta lacuna relatando essa expressão de um único coactivator transcriptional, YAP (proteína associada Sim) ou sua proteína intimamente relacionada TAZ (ativador transcricional com um motivo PDZ), em células terminalmente diferenciadas eficientemente cria populações de células autólogas funcional, expansível, não-oncogenicidade que são operacionalmente e molecularmente indistinguíveis de seus correspondentes de SCs de tecido-específica1. Um pulso de sustentado YAP ou atividade TAZ por alguns dias é suficiente para induzir o aparecimento de auto renovação SCs somáticas. Esta é uma condição estável que já não é dependente da expressão do transgene contínua, como pode ser transmitido através de gerações de células sem mais expressão ectópica YAP/TAZ1. O protocolo aqui apresentados detalhes o procedimento usado para gerar de novo tronco/progenitoras epiteliais células da glândula mamária e pâncreas, a partir de células diferenciadas desses tecidos. Esse procedimento preenche uma caixa preta, na arena de reprogramação/transdiferenciação celular atual. Principais esforços nestes sentidos de fato até agora têm-se centrado na transição de célula a um estado de (iPSC) células-tronco pluripotentes induzidas, seguido pela conversão destes embrionárias e SCs pluripotentes em células mais diferenciadas. No entanto, iPSCs são oncogenicidade uma vez introduzido em tecidos adultos, aumentando a necessidade de desenvolver protocolos para sua completa e eficiente de diferenciação2. No entanto, nesta etapa de diferenciação, mesmo quando possível, tem o preço de longo prazo potenciais de repovoamento de expansibilidade, auto-organização e órgão. Estes são atributos essenciais para a regeneração de órgãos que na verdade são típicos apenas de SCs endógenas de tecido-específica e os SCs actualmente descritos induzida por YAP (ySCs). Da mesma forma, transdiferenciação celular direto do tipo de uma célula para outra por meio de coquetéis de transcrição vários fatores também geram células que falta essencial proliferativa e stemness potencial3diferenciadas.
O procedimento descrito aqui também aproveita a tecnologia de organoides recentemente introduzida, pelo qual SCs endógenas podem ser expandidos e diferenciados ex vivo4. Induzida por YAP SCs podem gerar formadoras de organoides SCs mesmo em condições experimentais, de doença ou biológico SCs endógenas em que não estão presentes. Gostaríamos de observar que, para a diferença com outros procedimentos de reprogramação, o tipo de plasticidade celular transmitido por YAP pode corresponder a única forma da reversão para um status de SC, como ocorre em tecidos vivos. Reaquisição dos traços de SC, como tem sido associada a reparação tecidual ou ativação oncogênica5. Embora dispensável para a homeostase de vários tecidos adultos, YAP e/ou TAZ é absolutamente essencial para a regeneração, o crescimento do tumor e expansão de SCs somáticas em vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12

<table><tbody><tr><td>Seringas estéreis de 10 mL</td><td>Rays</td><td>10LC</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células de 100 mm</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos estéreis de 15 mL Placas</td><td>de</td><td></td> fixação ultra baixa de 24 poços Corning 430052 <td></td></tr><tr><td></td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células de 40 mm</td><td>Placas multipoços de</td> 48 poços Corning <td>352340</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tubos</td><td></td> cônicos estéreis Corning 353078 <td></td></tr><tr><td>50 mL Placas</td> multipoços de 6 poços <td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento</td><td></td> avançado de <td>353046</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase, tipo I</td><td>Sigma</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D4902&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>1705-041</td><td></td></tr><tr><td>Bisturis descartáveis</td><td>Swann-Morton</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DnaseI</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>doxiciclina hiclato</td><td>Sigma</td><td>D9891&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td> <td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS (com tampas de filtro)</td> <td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM)</td> <td>BioLegend</td><td>118208</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#19780&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-EGFP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84041</td><td>usado como controle negativo</td></tr><tr><td>FUW-tetO-MCS</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84008</td><td>usado como controle negativo</td></tr><tr><td>FUW-tetO-wtYAP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84009</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-YAPS94A</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84010</td><td>usado como controle negativo (mutante YAP transcricionalmente morto)</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>sal de heparina sódica</td><td>Sigma</td><td>H3149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>humano R-Spondin1 (His Tag)</td><td>Sino Biological</td><td>11083-H08H-5</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase de testículos bovinos</td><td>Sigma</td><td>H3506&nbsp;</td><td></td></tr><tr>Anticorpo <td>51500056</td><td></td> <td>K-14 ITS-X</td><td>Gibco</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Life Technologies Ab7800&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo K-8</td><td>Life Technologies</td><td>Ab14053&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>25030081</tr><tr><td>Lin (aloficocianina [APC] coquetel de anticorpos de linhagem de camundongo)</td><td>BD Biosciences</td><td>51-9003632</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&reg; Matriz de Membrana Basal Reduzida por Fator de Crescimento, Fenol Vermelho Corning</td><td></td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetilcisteína</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T.Baker</td><td>0402</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma</td><td>72340</td><td></td></tr><tr><td>adesivo não celular pratos de 10 cm (placa de Petri de polistirol estéril e oslash; 94)</td><td>ROLL</td><td>18248</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Euroclone</td><td>ECM4004XL</td><td></td></tr><tr><td>PE Hamster Anti-Mouse CD61</td><td>BD Biosciences</td><td>553347</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 Rato Anti-Humano CD49f</td><td>BD Biosciences</td><td>551129</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-camundongo/rato CD29 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rabo de Rato Colágeno I (revestimento)</td><td>Sigma</td><td>122-20</td><td></td></tr><tr><td>Rato Tail Collagen I para cultura 3D</td><td>Cultrex</td><td>3447-020-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>humano recombinante FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>humano recombinante Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>murino recombinante EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>murino recombinante FGF básico (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 meio</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>SBTI (inibidor de tripsina de Glycine max)</td><td>Sigma</td><td>T6522&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris BASE&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth médio</td><td>Gibco</td><td>31220023</td><td></td></tr></tbody></table>

de novo geração de células-tronco somáticas por yap/taz

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Aqui nós apresentamos protocolos para isolar células diferenciadas primárias e transformá-los em células tronco/progenitoras (SCs) da mesma linhagem pela expressão transiente do factor de transcrição YAP. Com este método, luminal células diferenciadas de (LD) da glândula mamária do mouse são convertidas em células que exibem propriedades moleculares e funcionais de mamária SCs. YAP também transforma totalmente diferenciadas exócrino células pancreáticas no pâncreas ducto-como progenitoras. Da mesma forma, a SCs endógenas, naturais, induzida por YAP tronco células ("ySCs") podem ser eventualmente expandidas como organoides culturas longo prazo in vitro, sem mais necessidade de YAP/TAZ ectópica, como ySCs são dotados de um estado de SC, como auto renovadora hereditário.
O processo de reprogramação apresentado aqui oferece a possibilidade de gerar e expandir em vitro células progenitoras de várias fontes de tecido a partir de células diferenciadas. A simples expansão de células somáticas ex vivo tem implicações para a medicina regenerativa, por mecanismos de compreensão da iniciação do tumor e, mais em geral, para celular e estudos de biologia do desenvolvimento.

Geração de yMaSCs Uma visão geral da estratégia experimental para reprogramar células primárias de LD mamárias pela expressão transiente de YAP é apresentada na figura 1A. Principais células epiteliais mamárias de LD são purificadas por fluorescentes-ativado da pilha classificação13. Figura 1B representa um procedimento típico de classificação para obter três subpopulações distintas: células basais (EpCAMbaixaCD49faltaCD61–), as células progenitoras Luminal (LP) (EpCAMaltaCD49fbaixaCD61+ ) e células de LD (EpCAMaltaCD49fbaixaCD61–). Cuidado gating das três subpopulações é essencial para isolar uma pura preparação de células de LD, que são totalmente diferenciadas e completamente crescimento preso quando semeado na glândula mamária formadoras de condições (ver Figura 1, deixou o painel). Por outro lado, quando induzido a express YAP exógeno, LD células começam se proliferando para formar colônias de epiteliais densas facilmente reconhecíveis em culturas de suspensão de matriz de membrana basal de 5% (Figura 1). A eficiência de reprogramação, atestada por volta de 3% para um típico experimento, pode ser marcado por contagem do número de colônias sobre o número de células únicas originalmente semeado em culturas de suspensão de matriz de membrana basal (Figura 1). Células reprogramadas de luminal (yMaSCs) podem então ser a passagem para 100% da membrana basal matriz organoides cultura condições (ver esquema na figura 1A), auto-organização nas complexas estruturas organoides, como que se desenvolvem em torno de múltiplos lúmens e Exibir notável capacidade de auto-renovação, mesmo na ausência de doxiciclina (ou seja, na ausência de expressão de YAP transgénico) (Figura 1E). Histologicamente, derivado de yMaSC organoids exibir uma camada basal (K14 positivo), enfrentando a matriz da membrana basal reconstituído ECM e uma camada luminal (K8 positivo), enfrentando as lúmen como cavidades dentro os organoides (Figura 1F). Essa arquitetura é indistinguível da organoids formada por nativos MaSCs (Figura 1F).
Geração de yDucts Uma visão geral da estratégia experimental para reprogramar primários ácinos pancreáticos pela expressão transiente de YAP é apresentada na Figura 2A. Toda acinares clusters são a maior parte do tecido pancreático isolados por uma combinação de dissociação suave e exclusão de tamanho através de filtração. Uma preparação típica é apresentada na Figura 2B. Após o isolamento, os clusters de células acinares devem aparecer como uma suspensão de exócrinas acinares unidades de tamanho homogêneo, com nenhuma contaminação por endócrino ilhotas de Langerhans ou fragmentos da árvore ductal pancreática e dissociação mínima de células únicas. Contaminação por ilhotas endócrinas ou fragmentos Ductais é uma indicação da filtragem seletiva deficiente (etapa 2.1.10), possivelmente devido a manipulação áspera; dissociação indesejada de clusters acinares para células individuais pode ser devido ao tratamento de colagenase excessiva ou sem buffer atividade de enzimas proteolíticas, lançado pelo tecido, que pode ser controlado pelo tratamento adicional SBTI.
Um experimento de reprogramação acinares típico é apresentado na Figura 2; dentro de 5-7 dias de cultura em 3D colágeno-baseei hidrogel na presença de doxiciclina, ácinos pancreáticos derivados R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A ratos prontamente transformar o duto, como aglomerados (que nomeamos yDucts), composto por uma fina monocamada de células epiteliais que proliferam em torno de uma cavidade central em expansão. A eficiência da reprogramação, que é de cerca de 70% para uma experiência típica, pode ser facilmente medida, marcando o número de clusters de duto, como sobre o número total de ácinos semeados (Figura 2D). Células de controlo negativo, ou seja R26-rtTAM2 / + nas células ou R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A esquerda sem doxiciclina, invariavelmente permanecem como pós mitóticas clusters acinares nestas condições de cultura, como anteriormente relatado1 de14, ,15. YDucts reprogramadas pode então ser passado no nível da célula única em organoides Matrigel-baseado cultura condições16 (ver esquema na Figura 2A), exibindo notável capacidade de auto-renovação, mesmo na ausência de doxiciclina (ou seja, na ausência de expressão de YAP transgénico) (Figura 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Figura 1: Isolamento de LD mamária primária de células e indução de glândulas mamárias de células-tronco. (A) representação esquemática do procedimento experimental adotado para reprogramar células primárias de LD mamárias. (B) representante FACS-plots ilustrando um procedimento típico de classificação para purificar as células LD. i) dissociadas células são dependentes de acordo com a dispersão para a frente e lateral para células vivas (P1 azul); II) população P1 então é ainda mais fechada de acordo com seu perfil de Lin: a subpopulação de células linhagem negativa (P2; cinzento) está selecionada, excluindo células hematopoiéticas Lineage-positivo; III) população P2 então é separada em um EpCAMalta (P3; amarelo + verde) e um EpCAM subpopulações debaixo (P6; vermelho); IV) P3 e P6 são então mais fechado de acordo com seu perfil CD61/CD49f em três subpopulações: EpCAMbaixaCD49faltaCD61 células basais de– (P7; vermelho), EpCAMaltaCD49fbaixaCD61+ LP células (P8; amarelo) e EpCAMaltaCD49fbaixaCD61 células de LD– (P9; verde). (C) as imagens são ilustrativas da capacidade das células de LD, infectado com as construções indicadas, para formar colônias mamárias 15 dias após a semeadura em meio de colônia mamária. Só YAP-expressando células transforme formadoras células, Considerando que o controlo negativo células (EGFP infectados) permanecem como células únicas de crescimento-preso. Barra de escala = 50 μm. (D) a quantificação da colônia formando a capacidade das células indicadas, como em (C). Dados são apresentados como média + s.d. e representante de cinco experimentos independentes, cada uma com seis repetições de técnicas. (E) imagem representativa de YAP-reprogramado mamárias células-tronco-células (yMaSCs) depois de 12 dias em condições de cultura de organoides em fresco tridimensional 100% da membrana basal matriz hidrogel na ausência de doxiciclina. Barra de escala = 100 μm. (F) imagens de imunofluorescência representativo para o marcador basal K14 (verde) e o marcador luminal K8 (vermelho) de organoids derivem de células indicadas, depois de 12 dias em condições de cultura organoides. Barra de escala = 10 μm. Esta figura é reproduzida de Panciera et al, 20161. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Figura 2 : Isolamento de células acinares pancreáticas primárias e indução de progenitoras pancreáticas. (A) representação esquemática do procedimento experimental adotado para reprogramar células acinares exócrinas pancreáticas primárias. (B) imagem representativa dos ácinos pancreáticos primários logo após o procedimento de isolamento (etapa 2.1.14). A preparação acinares deve aparecer como uma suspensão homogênea de clusters acinares, com presença mínima de células únicas. Barra de escala = 400 μm. (C) imagens representativas de ácinos pancreáticos principais derivado R26-rtTAM2 (painéis superiores)ou R26-rtTAM2; tetO-YAPS127A (mais baixo painéis) ratos e cultivadas em 3-d colágeno eu-com base de hidrogel durante 5 dias, com ou sem Doxiciclina (doxy), conforme indicado. Só YAP-expressando primário acinar converter células crescendo como quisto-como organoides após adição de doxiciclina. Escala de barras = 70 μm. (D) a quantificação da capacidade de ácinos pancreáticos para formar organoids ductal sobre transgênico superexpressão de YAP, como em (C). Dados são apresentados como média + s.d. e representante de cinco experimentos independentes, realizados com quatro repetições de técnicas. (E) imagem representativa de YAP-reprogramada ductal células (yDucts) após três passagens em fresco tridimensional 100% da membrana basal matriz hidrogel na ausência de doxiciclina. Barra de escala = 130 μm. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolamento de células mamárias primários</td>
		</tr>
<tr>
<td>CA2 + quelantes solução</td>
			<td>Loja a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0,02% w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Colágeno que solução de revestimento</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ácido acético, 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Colágeno de cauda de rato (revestimento)</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução de Dispase</td>
			<td>Loja a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Meio de dissociação</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução-mãe de hialuronidase</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase solução eu</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hemolítica solução</td>
			<td>Loja a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl solução</td>
			<td>1 peças</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20,6 g/L</td>
			<td>9 partes</td>
		</tr>
<tr>
<td>ajustar o pH para 7,2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Loja a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução-mãe de hialuronidase</td>
			<td>Filtro de 0,2 µm, loja a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hialuronidase de testículos de bovinos (pó)</td>
			<td>2.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampão de fosfato de sódio 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl solução</td>
			<td>Guarde este medicamento em T. amb.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7,1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>ajustar o pH a 7,65</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução de classificação</td>
			<td>Filtro de 0,2 µm, loja a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PH HEPES 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Lave médio #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lave médio #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meio de cultura 2D mamário</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparina</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamina</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>bFGF murino</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murino</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Indução e Passaging de yMaSCs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Médio de colônia mamária</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparina</td>
			<td>4 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamina</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (adicionar imediatamente antes da semeadura)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>bFGF murino</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murino</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Médio de organoides mamária</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12 avançada</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparina</td>
			<td>4 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cabeça humana</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murino bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murino</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µ g/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: geração de yMaSCs. Composição de todos os diferentes meios de cultura e soluções necessárias para isolamento de células primárias de LD mamárias e indução de yMaSCs (seção 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolamento de ácinos pancreáticos principais</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Meio de cultura acinares</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dexametasona</td>
			<td>1 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>CONJUNTO.</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Médio do Waymouth</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Lavagem acinares médio</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meio RPMI</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>CONJUNTO.</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Médio de recuperação acinares</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meio de cultura acinares</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Colagenase solução A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lavagem acinares médio</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase solução eu</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Loja a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (tampão fosfato salino)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase solução eu</td>
			<td>Loja a-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase, tipo I (pó)</td>
			<td>6.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Passagem de organoids do pâncreas</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Colagenase solução B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase solução eu</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Médio de organoides pancreático</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12 avançado</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>gastrina</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF10 humana</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cabeça humana</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murino</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-acetilcisteína</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamida</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>CONJUNTO.</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: geração de yDucts. Composição de todos os diferentes meios de cultura e soluções necessárias para isolamento de células acinares primárias e indução e passagem de yDucts (secção 2).

Disponibilidade de SCs somáticas é crucial para a medicina regenerativa, modelagem de doença e para ganhar a introspecção em Propriedades de SC. Aqui nós apresentamos estratégias experimentais para reprogramar, em vitro, células adultas diferenciadas em suas células tronco/progenitoras expansível do tecido-específica correspondente pela expressão transiente do único ativador transcricional co YAP.

De Novo Geração de células-tronco somáticas por YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

O objetivo geral deste procedimento é transformar células primárias diferenciadas em células progenitoras da mesma linhagem por expressão transitória do fator de transcrição YAP. Este procedimento de reprogramação oferece a possibilidade de gerar in vitro células progenitoras ou estaminais de vários tecidos a partir das suas homólogas diferenciadas, mesmo quando as células estaminais endógenas são raras ou difíceis de identificar. A possibilidade aqui existente de expandir células somáticas ex vivo tem implicações para a medicina regenerativa, para a compreensão dos mecanismos de plasticidade celular que também são relevantes no câncer e para o tecido celular e no desenvolvimento de estudos biológicos.Este procedimento preenche uma caixa preta na arena de reprogramação atual, pois não pretendemos fazer células especializadas por meio da diferenciação de células-tronco embrionárias, mas células-tronco específicas do tecido a partir de células diferenciadas. Depois de sacrificar 10 camundongos fêmeas de acordo com o protocolo de texto, disseque as glândulas mamárias fazendo uma incisão em forma de Y ao longo da pele abdominal. Em seguida, use uma pinça de dumont para separar cuidadosamente as glândulas do peritônio, puxando suavemente.Coloque as glândulas dissecadas em um prato adesivo não celular com 10 mililitros de HBSS + PS gelado. Sob uma capa de cultura de tecidos, use 10 mililitros de HBSS + PS fresco para lavar cada glândula uma vez e coloque-os em um prato adesivo vazio sem células. Em seguida, use dois bisturis estéreis para picar finamente as glândulas em fragmentos de um milímetro cúbico.A picada adequada das glândulas é essencial para o isolamento celular eficiente. Junte 20 glândulas e tente executar esta etapa dentro de três a cinco minutos para obter a viabilidade celular ideal. Usando uma pipeta sorológica de 25 mililitros e 10 mililitros de meio de dissociação, recupere o tecido picado de cada prato e transfira a suspensão em um tubo cônico de 50 mililitros pipetando pelo menos cinco vezes para desagregar os aglomerados de tecido.Incube o tecido a 37 graus Celsius por uma hora com agitação vigorosa contínua. Em seguida, gire o tecido digerido a 400 vezes g em temperatura ambiente por cinco minutos. Depois de descartar o sobrenadante, use três mililitros de solução hemolítica para ressuspender o tecido e incubar no gelo por três minutos.Em seguida, com 10 mililitros de meio de lavagem número um, lave as células. Depois de girar o tecido digerido e descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet de tecido em 10 mililitros do meio de lavagem número dois e coloque as células em placas de cultura de tecidos de 10 centímetros. Em seguida, incube os pratos a 37 graus Celsius por uma hora.Recuperar a suspensão celular num tubo cónico de 50 mililitros e centrifugar o tubo a 400 vezes g durante cinco minutos. Em seguida, use 10 mililitros da solução quelante de cálcio para ressuspender o pellet. Após a centrifugação e após repetir a lavagem, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de 0,25% de tripsina-EDTA.Depois de incubar a amostra, adicione cinco mililitros de solução de dispase suplementada com um micrograma por mililitro de DNase um em cima da solução de tripsina. Para desagregar os aglomerados, use uma ponta de pipeta de um mililitro para pipetar para cima e para baixo pelo menos cinco vezes e incubar a amostra a 37 graus Celsius por 10 minutos, agitando a cada três minutos. Adicione 10 mililitros do meio de lavagem número dois e filtre a solução através de um filtro de célula de 40 micrômetros em um novo tubo cônico de 50 mililitros.Em seguida, gire para baixo a suspensão celular. Para realizar a purificação celular por FACS, use 200 microlitros do meio de lavagem número um para ressuspender cada pellet. Em seguida, adicione 44,5 microlitros de mistura de anticorpos, pipete bem e incube a amostra no escuro no gelo por 30 minutos.Dilua a suspensão celular em 10 mililitros do meio de lavagem número um e gire a amostra. Ressuspenda o pellet celular em dois mililitros de solução de classificação e filtre através de um tubo FACS de filtro de tampa antes de prosseguir para a separação FACS das populações de células. Use a solução de lavagem número um para lavar as células recuperadas do FACS.Depois de remover o sobrenadante, use meio de cultura 2D mamário para ressuspender o pellet celular e a placa 500 microlitros por poço em uma placa tratada com colágeno. Sete dias após a indução de doxiciclina de células LD primárias infectadas com lentivírus, adicione 150 microlitros por poço de 05% de tripsina-EDTA às células e incube-as a 37 graus Celsius por 10 minutos. Uma vez que as células tenham sido lavadas e contadas, use o meio de colônia de memória, suplementado com dois microgramas por mililitro de doxiciclina para ressuspendê-las.Em seguida, semeie 1.000 células por poço em 24 placas de fixação ultra baixa para cultura de YAP expressando colônias semelhantes a máscaras. Para subcultura y máscaras, colete cada amostra e adicione um volume de 10 a um de HBSS gelado, em seguida, incube as amostras no gelo por uma hora para solubilizar a matriz da membrana basal. Depois de girar as colônias, use HBSS gelado para lavar as células três vezes.Em seguida, adicione 05% de tripsina-EDTA às colônias e incube-as a 37 graus Celsius por 10 minutos. Passe as colônias por uma ponta de pipeta P1000 10 vezes para obter uma suspensão de célula única. Em seguida, conte e semeie novamente as células em meio de colônia mamária sem doxiciclina em 24 placas de fixação ultrabaixa de poços a uma densidade colonogênica de 1.000 células por poço.Antes da terceira passagem, transfira e mascare colônias em condições de cultura organoide, recuperando as colônias do meio da colônia mamária e use 100% de matriz de membrana basal reduzida pelo fator de crescimento para ressuspendê-las. Após a incubação, quando a matriz da membrana basal solidificou, cubra os géis com 500 microlitros do meio organoide mamário. Passe as culturas coletando cada amostra organoide e incubando-as em um volume excessivo de HBSS no gelo por uma hora.Em seguida, use HBSS gelado para lavar os organoides três vezes. Tripsinize os organoides conforme demonstrado anteriormente neste vídeo e semeie novamente as suspensões de células únicas em uma gota de 100% de matriz de membrana basal reduzida pelo fator de crescimento e, em seguida, use 500 microlitros de meio organoide mamário para revestir os géis. Depois de lavar o tecido pancreático digerido do camundongo de acordo com o protocolo de texto, use seis mililitros de meio de recuperação acinar para ressuspender cuidadosamente o tecido digerido e dividi-lo entre dois poços de uma placa de cultura de tecidos de seis poços.Sob um estereomicroscópio, avalie cuidadosamente a qualidade do isolamento acinar e remova quaisquer grandes aglomerados de tecido eventualmente presentes. Para semear ácinos pancreáticos primários, após incubar os cachos por duas horas para recuperação celular, coletar a suspensão de células acinares em um tubo cônico e centrifugar as amostras a 100 vezes g e 18 graus Celsius por cinco minutos. Após ressuspender os ácinos em meio de cultura acinar, diluir a suspensão com um volume igual de colágeno de cauda de rato neutralizado, uma solução, mantendo os tubos no gelo.Misture com cuidado e rapidez e semeie a suspensão celular em 16 poços em cima da almofada de colágeno. Para a semeadura ideal dos ácinos pancreáticos, é crucial manter todos os tubos no gelo antes do revestimento e prosseguir com rapidez, mas, ao mesmo tempo, a pipetagem cuidadosa para evitar a formação de bolhas de ar é essencial para criar uma matriz de colágeno homogênea. Incube as células a 37 graus Celsius por uma hora para permitir a formação de um hidrogel.Em seguida, para induzir organoides pancreáticos, cubra os hidrogéis de colágeno com 500 microlitros de meio de cultura acinar suplementado com doxiciclina. Para subcultivar os organoides, descarte o meio de cultura, extraia cuidadosamente os hidrogéis e transfira-os para tubos cônicos contendo quatro mililitros de solução B de colagenase I e, em seguida, incube os tubos a 37 graus Celsius com agitação vigorosa por 30 minutos antes de girar as células e remover o sobrenadante. Depois de tripsinizar as células e remover o sobrenadante PBS, use uma matriz de membrana basal gelada para ressuspender o pellet celular e semear a suspensão em placas de fixação ultrabaixas.Deixe o hidrogel da matriz da membrana basal solidificar incubando as placas a 37 graus Celsius por 40 minutos e, em seguida, sobrepondo com meio organoide pancreático. Os dutos crescerão como organoides semelhantes a cistos em sete a 10 dias. A passagem cuidadosa das células epiteliais LD mamárias primárias nas três subpopulações mostradas aqui é essencial para isolar uma preparação pura de células LD que são totalmente diferenciadas e completamente interrompidas quando semeadas em condições de formação de colônias de glândulas mamárias.Por outro lado, quando induzidas a expressar YAP exógeno, as células LD começam a proliferar para formar colônias epiteliais densas facilmente reconhecíveis em culturas de suspensão de matriz de membrana basal a 5%. Sob condições de cultura organoide da matriz da membrana basal, as células luminais reprogramadas se auto-organizam em estruturas organoides complexas que se desenvolvem em torno de vários lúmens e se auto-renovam mesmo na ausência de doxiciclina. Nos cinco a sete dias de cultivo em hidrogel à base de colágeno I 3D na presença de doxiciclina, os ácinos pancreáticos diferenciados prontamente se transformam em aglomerados semelhantes a dutos ou yDucts compostos por uma fina monocamada de células epiteliais que proliferam em torno de uma cavidade central em expansão.A eficiência de reprogramação pode ser facilmente medida pontuando o número de aglomerados semelhantes a dutos sobre o número total de ácinos semeados. Os yDucts reprogramados podem então ser passados no nível de célula única para condições de cultura organoide baseadas em matrigel, exibindo notável capacidade de auto-renovação, mesmo na ausência de expressão endógena de YAP. Detalhamos dois procedimentos.Um permitiu a reprogramação de células purificadas por FACS por meio de vetores lentivirais e um segundo que evita a infecção viral e aproveita a expressão transgênica de YAP. Ao tentar reprogramar as células mamárias, é importante evitar o uso excessivo de títulos virais, pois isso pode ser prejudicial para a eficiência da reprogramação. A estratégia totalmente transgênica é apropriada para ácinos pancreáticos primários, pois estes dificilmente são passíveis de infecção lentiviral.Também oferece a mesma vantagem dos vetores lentivirais dependentes de doxiciclina para o controle do tipo de expressão gênica. Além dos exemplos demonstrados aqui, este protocolo de reprogramação YAP provou ser bem-sucedido na conversão de neurônios diferenciados em neurônios em proliferação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como realizar uma reprogramação dependente de YAP para converter tipos de células diferenciadas de diferentes tecidos adultos em células-tronco específicas de tecido correspondentes.Este procedimento expande as estratégias atuais de reprogramação, fornecendo um meio de gerar células-tronco somáticas que podem ter relevância para a medicina regenerativa, para o estudo da estaminalidade somática e para a expansão de células-tronco somáticas in vitro. Considere que o manuseio da preparação lentiviral pode ser extremamente perigoso e, pelo nível de segurança, duas medidas devem sempre ser adotadas durante a execução deste procedimento.

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Biologia

Este vídeo mostra o procedimento para gerar células-tronco pluripotentes induzidas usando lentivírus induzível que expressam Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4.

Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

Um método para gerar células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) através de expressão retrovírus mediada ectópica de Oct4, SOX2, KLF4 e MYC é descrito. Uma maneira prática de identificar humanos colônias de IPSC com base na expressão de GFP também é discutida.

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Este estudo demonstra a reprogramação de células somáticas para pluripotência in vivo sem a geração de teratomas. Usamos injeção hidrodinâmica de DNA plasmidial na veia da cauda que codifica os fatores de Yamanka para induzir a reprogramação in vivo de hepatócitos adultos em células de pluripotência aumentada.

In vivo Reprogramação de células adultas somáticas a pluripotência por superexpressão de Fatores de Yamanaka

Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte de tecidos específicos do paciente para aplicações clínicas e de pesquisa básica. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reprogramar células humanas mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados em iPSCs virais-livre usando não-integração plasmídeos epissomais.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

Este protocolo descreve um método detalhado para a geração eficiente de iPSCs livres de integração a partir de células sanguíneas periféricas adultas humanas. Com o uso de quatro vetores epissómicos baseados em oriP/EBNA para expressar os fatores de reprogramação, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 e SOX2, milhares de colônias de iPSC podem ser obtidas a partir de 1 mL de sangue periférico.

Geração de Integração-livres induzidas células-tronco pluripotentes a partir de células mononucleares de sangue periférico humano Usando epissï¿½ica Vectors

As células germinativas primordiais (PGCs) são precursores comuns de esperma e de ovos. PGCs embrionárias humanas são especificados de células do epiblasto pluripotentes através de interações de citocinas. Aqui, descrevemos um protocolo de 13 dias de induzir células humanas transcriptomally PGCs assemelhando-se à superfície dos órgãos do embryoid de células-tronco pluripotentes aprontado-pluripotência induzida.

Geração de células humanas de células germinativas, como Primordial na superfície dos órgãos do Embryoid de aprontado-pluripotência induzida por células estaminais pluripotentes

Esse protocolo foi gerado como um meio de produzir organoides cerebrais de forma simplificada e de baixo custo sem fatores de crescimento exógenos ou matriz de membrana do porão, mantendo a diversidade de tipos de células cerebrais e muitas características da organização celular.

Um método estática auto-direcionado para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco embrionárias humanas

Apresentamos aqui um método que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem para gerar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sem a necessidade de transfecção genética ou vetores retrovirais. Essa estratégia é, portanto, promissora para a medicina translacional e representa um notável avanço na tecnologia organoide de células-tronco.

Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

Este artigo descreve um procedimento para produzir iTenócitos gerando células estromais mesenquimais derivadas de iPSC com superexpressão combinada de Scleraxis usando um vetor lentiviral e estiramento uniaxial através de um biorreator 2D.

Geração de itenócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos via superexpressão combinada de escleraxis e tensão uniaxial 2D

Aprenda a reprogramar células diferenciadas em células progenitoras usando o fator de transcrição YAP. Este método permite gerar células-tronco somáticas para aplicações em medicina regenerativa e estudos de plasticidade celular.

De Novo Geração de células-tronco somáticas por YAP/TAZ

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