Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Os objetivos gerais deste protocolo são examinar a ativação do inflamassoma no nível de uma única célula por meio de microscopia de fluorescência e medir a lise durante a piroptose por um ensaio de liberação de lactato desidrogenase ou LDH. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do inflamassoma, como como a ativação da Caspase-1 é regulada. A principal vantagem dessas técnicas é que elas permitem ao usuário examinar várias etapas das vias de ativação do inflamassoma e piroptose.

Demonstrando o procedimento estará Andreas den Hartigh, um cientista pesquisador do meu laboratório. Comece substituindo o meio de macrófagos derivados da medula óssea preparados com LPS semeados em lamínulas de vidro por 290 microlitros de meio DMEM 5, suplementado com cinco nigerina micromolar e cinco glicina milimolar, por poço. Retorne a placa de 24 poços para a incubadora de cultura de células por 60 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, adicionando 10 microlitros de 30X FAM-YVAD-FMK após os primeiros 15 minutos.

No final da incubação, lave as células com um mililitro de PBS frio por poço, três vezes por cinco minutos por lavagem e fixe as células com 250 microlitros de paraformaldeído a 2% por poço por 30 minutos em gelo protegido da luz, rotulando as células com um corante nuclear de fluorescência apropriado durante os últimos cinco minutos. No final da incubação, lave as células três vezes com PBS frio, conforme demonstrado, e carregue cada lâmina com sete microlitros de meio de montagem anti-desbotamento. Coloque uma lamínula em cada lâmina e deixe o meio de montagem endurecer durante a noite antes de selar as lamínulas com esmalte.

Para obter imagens das células por microscopia confocal de fluorescência, coloque a lâmina de controle não tratada no estágio do microscópio e concentre-se manualmente nas células. Usando as configurações da tabela de pesquisa do microscópio, ajuste o deslocamento até que nenhuma coloração positiva da sonda seja observada nas células não tratadas. Em seguida, usando uma amostra tratada com nigericina, localize um campo que contenha células positivas e negativas para a coloração da sonda e ajuste o plano de imagem do canal da sonda para o plano que tem a maior intensidade de coloração positiva.

Em seguida, ajuste o ganho até que os focos sejam visíveis nas células com núcleos condensados e obtenha imagens de cinco campos selecionados aleatoriamente por lâmina com uma ampliação total de 100X. Para análise imunofluoroquímica das células tratadas com nigericina, lave as células marcadas com prop como acabamos de demonstrar e incube as células em 250 microlitros de solução de fixação e permeabilização por poço por 30 minutos em gelo, protegidas da luz. Lave os macrófagos mais três vezes com tampão de lavagem fresco e rotule as células com 250 microlitros de anticorpo primário contra uma proteína semelhante a uma ptose associada à ptose contendo um domínio de recrutamento de caspase C-terminal, ou ASC, por poço, por uma hora no gelo.

Lave as células no final da incubação e rotule as amostras com 250 microlitros do anticorpo secundário conjugado com corante de fluorescência apropriado por mais uma hora no gelo, adicionando quatro microlitros de um corante de coloração nuclear de fluorescência apropriado durante os últimos cinco minutos. Depois de lavar as células três vezes em tampão de lavagem a frio, monte lamínulas nas lâminas com sete microlitros de meio de montagem anti-desbotamento, conforme demonstrado, e faça a imagem dos macrófagos por microscopia confocal de fluorescência. Para realizar um ensaio de liberação de LDH, adicione 50 microlitros de meio DMEM 5 suplementado com 10 nigerina micromolar em cada poço experimental e 50 microlitros de DMEM 5 nos poços de controle espontâneo e 100% de lise por 60 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Após 30 minutos, adicione 10 microlitros de tampão de lise 10X aos poços de controle de 100% de lise e adicione 10 microlitros de meio aos outros poços. No final da incubação, centrifugue a placa e transfira 50 microlitros de sobrenadante de cada poço para uma placa transparente de fundo plano. Em seguida, adicione 50 microlitros de substrato recém-descongelado e preparado a cada poço para uma incubação de 30 minutos no escuro, verificando a placa após 15 minutos para confirmar se o sinal não excederá o limite de detecção do leitor de placas.

No final da incubação, adicione 50 microlitros de solução de parada a cada poço e meça o OD490 em um leitor de placas apropriado para permitir o cálculo da porcentagem de lise celular por poço. Enquanto os macrófagos do tipo expostos à nigericina demonstram a formação de um foco ASC na região perinuclear que também contém Caspase-1 ativa, indicando que essas células estão sofrendo piroptose. Embora os macrófagos de camundongos deficientes em Caspase-111 também gerem um foco ASC, essas células não possuem nenhuma Caspase-1 ativa associada a esse foco, conforme indicado pela ausência de coloração FAM-YVAD-FMK.

Os núcleos dessas células também não estão condensados, indicando ausência de morte celular piroptótica. Além disso, uma grande porcentagem de macrófagos do tipo selvagem sofre morte celular após a exposição à nitericina, conforme medido pela análise de liberação de LDH de seus sobrenadantes de cultura, enquanto macrófagos deficientes em Caspase-1 não liberam LDH no sobrenadante, indicando que as células ainda estão intactas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar a formação de inflamassoma por microscopia de fluorescência e determinar o nível de lise celular medindo a liberação de LDH.

Este procedimento pode ser modificado para o uso de outros estímulos ou intervenções do inflamassoma que alterem a ativação do inflamassoma ou piroptose.