Name: Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Aprenda a detectar ativação do inflamassoma NLRP3 em macrófagos derivados de medula óssea murina usando microscopia de fluorescência e ensaio de liberação de LDH. Este método permite analisar a piroptose em nível de célula única.

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Microscopia de todos foi feito no W. M. Keck microscopia Center com suporte de Nathaniel Peters e com apoio do prêmio NIH S10OD016240. S.L.F. é suportado pelo NIH K08AI119142 e R21AI130281. Agradecemos o Dr. Richard Flavell e o Dr. Brad Cookson para camundongos deficientes de caspase-1/11 e o Dr. Brad Cookson para a partilha de equipamentos e instalações laboratoriais.

Todos os procedimentos de animais foram aprovados e conduzidos em Universidade das orientações do Comité de uso e cuidado Animal institucional do Washington.
1. colheita de medula óssea
<ol><li>Assepticamente, remover o fêmur e tíbia de um rato e limpar os ossos usando instrumentos esterilizados. Coloque os ossos limpos em meio de Eagle modificado Dulbecco (DMEM) 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM 2-Mercaptoetanol + sulfato de gentamicina 50 mg/mL + 10.000 U/mL penicilina/estreptomicina + 10% soro fetal bovino (FBS, DMEM-10 completa) e incubar a tubo no gelo por 15 min.</li>
	<li>Remova as articulações proximal e distal da bola com uma tesoura. Inserir uma agulha 25g ligada a uma seringa de 10ml cheia de médio a caverna dos ossos. Medula óssea usando DMEM-10 completa o jogo. Resuspenda qualquer touceiras pipetando meio de cima e para baixo suavemente.</li>
	<li>Centrifugar as células durante 10 minutos a 300 x g... e contar o número de células usando um hemocytometer. Neste ponto, ou congelar as células usando 90% FBS + 10% dimetilsulfóxido (DMSO) ou as células em uma placa de Petri para diferenciar os macrófagos usando meio de L929 condicionado (passo 2.1) de 15cm da placa.</li>
</ol>2. diferenciação de macrófagos derivados de medula óssea
<ol><li>Usando o meio de diferenciação pré-aquecido (21 mL de DMEM-10 completa e 9 mL do meio de celular condicionado de L929 como descrito por Swanson et al . 18), colocar células da medula óssea em 15 cm de uma cultura de não-tecidos tratados de Petri (1.2-1.5 x 107 células). Incube a placa a 37 ° C e 5% de CO2 por 7 dias. Adicione um adicional 30 mL de meio de diferenciação na placa no dia 3 ou 4. Nota: É importante não utilizar placas de cultura de tecidos tratada, como macrófagos será difícil separar e colheita.</li>
	<li>Para coletar os macrófagos, lavar a placa com tampão fosfato salino (PBS) e adicionar 20 mL de PBS frio + ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Incubar a placa a 4 ° C por 10 min. colheita das células pipetando o PBS + EDTA sobre as células e lavar a placa com 10 mL de PBS. Combine as duas lavagens em dois tubos de 15ml cónico.</li>
	<li>Centrifugar as células em 300 x g durante 10 minutos e ressuspender as células em 10 mL de vermelho de fenol livre DMEM 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM 2-Mercaptoetanol + 5% FBS (DMEM-5) e contar as células usando um hemocytometer ou um contador de Coulter. Manter as células no gelo durante a contagem.</li>
	<li>Propagar os macrófagos em placas de cultura de tecidos revestida a 2 x 105 células/mL. Para experimentos de microscopia, 1 mL de células em lamelas em 24 placas bem as sementes. Para ensaios de liberação LDH, semente 100 µ l de células em um prato bem 96. Para o ensaio LDH, sementes 9 poços (3 poços não tratada, 3 poços com controles 100% Lise e 3 poços para o estímulo experimental).</li>
	<li>Centrifugue a placa bem 96 durante 5 min à 300 g x para se certificar de que as células são distribuídas igualmente entre o poço.</li>
	<li>Incube a placa durante a noite a 37 ° C + 5% CO2 antes de iniciar o processo de preparação.</li>
</ol>3. escorva
<ol><li>Substitua o medium com meio fresco (DMEM-5), contendo 100 ng/mL LPS (500 μL a 24 bem placa ou 50 μL para o 96 bem da placa). Nota: Há uma variedade de variações estruturais em LPS, que afetam a capacidade de estimular a escorva mediada por TLR419. LPS de minnesota de Salmonella R595 (Re) está disponível a partir de vários fornecedores e é recomendado.</li>
	<li>Incube a placa por 3 h a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
</ol>4. activação do Inflammasome NLRP3 com Nigericin e rótulos com FAM-YVAD-FMK
<ol><li>Remover o meio e substituí-lo com 290 μL de DMEM-5 contendo 5 μM nigericin e glicina de 5 mM. A glicina é adicionada para reduzir a quantidade de lise celular que ocorre durante a ativação de caspase-15. Incube durante 60 minutos a 37 ° C e 5% de CO2. Use ambos o tipo selvagem e o caspase-1 macrófagos deficientes para assegurar que a rotulagem observada é específica para caspase-1.</li>
	<li>Durante o último 45 min, adicionar 10 μL de 30 x FAM-YVAD-FMK, preparado de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Após 60 min, retire o meio e lave as células três vezes por 5 min cada com 1 mL de PBS frio.</li>
	<li>Adicionar 250 μL de paraformaldeído 2% a cada poço e incubar no gelo coberto com papel alumínio por 30 min.</li>
	<li>Durante o último 5 min, adicione 4 μL de mancha de far-red do ácido nucleico fluorescente de 0,2 mM para rotular os núcleos. 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ou outros corantes também podem ser usado para rótulo de DNA.</li>
	<li>Lavar as células três vezes com 1 mL de PBS frio e montar as lamelas em corrediças do microscópio usando 7 meio de montagem antidesbotamento μL. Deixe o meio de montagem endurecer durante a noite antes de selar a lamela para o slide de microscópio usando esmalte.</li>
	<li>Os macrófagos da imagem pela microscopia confocal. Ex / Em para FAM-YVAD-FMK é 492/520nm e 642/661 por corante fluorescente far-red do ácido nucleico. Certifique-se de configurar o microscópio, tal que as células não tratadas não mostram qualquer fundo de coloração no canal 488. Caso contrário, coloração de fundo FAM-YVAD-FMK será detectado e não real ativa a caspase-1. Nota: A configuração do microscópio é descrita na secção 6.</li>
</ol>5. anticorpos
Nota: Para rotular as células com anticorpos para detectar ASC, semente, prime e expor as células de nigericin idêntico da seção anterior. O processamento depois é como segue:
<ol><li>Lave as células três vezes por 5 min cada com 1 mL de PBS frio. Adicione 250 μL de solução de fixação e permeabilização. Incubar as células no gelo e coberto por 30 min.</li>
	<li>Lave os macrófagos três vezes por 5 min cada com 1 mL de tampão de lavagem.</li>
	<li>Adicionar 250 μL do anticorpo primário contra ASC diluída a 1: 500 em tampão de lavagem e incubar durante 1 h no gelo. Incluem uma lamela que não recebe qualquer anticorpo primário, mas só vai receber o secundário. Esta lamela será usada para definir o deslocamento correto durante a instalação do microscópio.</li>
	<li>Lave as células três vezes por 5 min cada com 1 mL de tampão de lavagem.</li>
	<li>Adicione 250 μL do anticorpo secundário (tintura fluorescente conjugado cabra-anti-mouse) diluído a 1: 500 em tampão de lavagem e incubar durante 1 h no gelo. Adicione 4 μL de mancha de far-red fluorescente de ácidos nucleicos de 0,2 mM para o último 5 min desta incubação aos núcleos de rótulo.</li>
	<li>Lavar as células 3 x com 1 mL de tampão de lavagem fria e monte as lamínulas para microscópio slides usando 7 meio de montagem antidesbotamento μL. Deixe endurecer durante a noite antes de selar a lamela para o slide de microscópio usando esmaltes claros-o meio de montagem.</li>
	<li>Macrófagos de imagem por microscopia confocal. Ex / Em para o anticorpo secundário é 555/580 nm e 642/661 far-red fluorescente do ácido nucleico mancham (como descrito abaixo). Nota: Etiquetando com FAM-YVAD-FMK e rotulação de anticorpos pode ser combinado para mostrar a localização co de caspase-1 ativo e ASC. Para isso, siga as condições para a rotulagem de FAM-YVAD-FMK e alterne para o anticorpo protocolo para processamento adicional.</li>
</ol>6. imagens de macrófagos rotuladas por microscopia Confocal
Nota: As células coradas podem ser exibidas após as lamínulas foram autorizadas a curar durante a noite e foram selados para a lâmina de microscópio com esmalte. Aqui, a imagem usar um microscópio confocal é descrito. As células também podem ser vistas por microscopia de fluorescência padrão.
<ol><li>Coloque o slide com as células controle não tratados na fase de microscópio e concentrar o microscópio nas células.</li>
	<li>Usando o microscópio, olhe a tabela (LUT) configurações, ajuste o deslocamento tal que não há nenhuma mancha de FAM-YVAD-FMK positiva nas células não tratadas. Esse processo também pode ser realizado usando os macrófagos deficientes de caspase-1. Nota: O deslocamento deve ser ajustado para cada canal utilizado no experimento, mas definir o deslocamento correto é mais crítico para o canal de FAM-YVAD-FMK e canais de anticorpos fluorescentes. O deslocamento para o canal de DNA é menos crítico. Assim que tiver sido definido o deslocamento, não ajuste essa configuração para o resto do experimento.</li>
	<li>Mude o slide para a amostra de nigericin Tratado. Encontre um campo que contém ambas as células que são positivos e negativos para a FAM-YVAD-FMK coloração. Ajuste o plano da imagem latente do canal FAM-YVAD-FMK para o avião que tem a maior intensidade de coloração positiva. Normalmente, este será o avião onde o centro do foco inflammasome é fotografado.</li>
	<li>Ajuste o ganho tal que focos estão visíveis em células com núcleos condensados. Depois de definir o ganho e o deslocamento, embora essas configurações para o resto da sessão de imagens. Nota: Uma maneira fácil de determinar se uma célula é pyroptotic é olhando com morfologia nuclear. Células com ativa a caspase-1 tem arredondado e núcleos condensados, enquanto nucléolos são visíveis nas células sem ativação de caspase-1 e a morfologia nuclear é semelhante aos de células não tratadas.</li>
	<li>Recolha imagens dos 5 campos selecionados aleatoriamente em 100 X ampliação total. Normalmente, isso resultará em cerca de 40 células por imagem. Repita este processo para cada amostra.</li>
	<li>Conte o número de células em cada imagem usando software de análise de imagem. Em seguida, conte o número de células que possuem coloração positiva do FAM-YVAD-FMK. Representam o nível de ativação de caspase-1 como a porcentagem de células positivas FAM-YVAD-FMK.</li>
</ol>7. ensaio de liberação LDH
Nota: Para o ensaio de liberação LDH, semente e prime, que as células, exceto conforme descrito na seção anterior, usam um prato bem 96. Não remova o meio após a escorva.
<ol><li>Adicionar 50 μL de DMEM-5 contendo 10 μM nigericin aos poços experimentais e 50 μL DMEM-5 para os poços de controle lise espontâneos e 100%. Não adicione glicina neste experimento, desde que o objetivo é medir a lise celular. Incube durante 60 minutos a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Depois de 30 min, adicionar 10 μL de tampão de Lise 10 x nos poços de controle de lise de 100% e adicionar 10 μL de DMEM-5 para os outros poços. Durante esta incubação, 1 frasco de mistura de substrato (1,5 mL de substrato liofilizado) e 1 alíquota de buffer de ensaio (~ 12 mL) Retire do congelador e deixá-los descongelar protegido da luz, à temperatura ambiente. Nota: A mistura de substrato contém um sal de tetrazólio (iodonitro-tetrazólio violeta), que é convertido em um produto formazan vermelho.</li>
	<li>Após a incubação total de 60 min, centrifugar a placa durante 5 min à 500 x g a 10 ° C. Transferi 50 μL do sobrenadante para um prato fundo plano claro. Durante este tempo, adicione 12 mL de tampão de ensaio para o frasco de mistura de substrato e incubar a temperatura ambiente por 5 min antes de usar.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de substrato a cada poço e incube por 30 min no escuro. Incluem poços apenas médios, para valores em branco. Verifique a placa depois de 15 min para certificar-se de que o sinal não excederá o limite de detecção do leitor de placa.</li>
	<li>Depois de 30 min, adicione 50 μL de solução de paragem (1 M de ácido acético) e medir OD490 usando um leitor de placa.</li>
	<li>Calcule a porcentagem de lise celular usando a seguinte fórmula: Citotoxicidade % = ((Experimental-Spontaneous) / (máximo-espontânea)) × 100 Experimental: células nigericin Tratado; espontânea: não tratada células; máxima: células expostas a Lise</li>
</ol>

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</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar

Neste manuscrito, apresentamos duas técnicas para examinar a ativação de inflammasome e a consequência da ativação de caspase-1 após estimulação NLRP3 em macrófagos murino derivadas da medula óssea. A primeira técnica permite que o pesquisador determinar o nível de ativação de caspase-1 em uma base celular usando o repórter fluorescente FAM-YVAD-FMK. Este repórter é altamente específico para a vinculação da caspase-1 família de enzimas, como visto pela ausência de coloração em macrófagos deficientes de caspase-1/11. Espe...

Inflamação mediada por Inflammasome é um componente crítico da defesa contra organismos patogénicos1, mas também está subjacente a etiologia de muitas doenças2. A resposta inflamatória a uma ampla gama de infecções é acionada através da detecção citosólica do patógeno associado padrões moleculares (PAMPs) ou danos associados a padrões moleculares (represas). Receptores de reconhecimento padrão (PRR), incluindo membros da família de NOD-like receptor (NLR), oligomerize na detecção destes PAMPs e represas. Isto provoca a formação de um complexo de proteína multi denominado o inflammasome, que contém o PRR, a adaptador da proteína associada a apoptose grão-como contendo um domínio C-terminal de caspase-recrutamento (cartão) (ASC) e a pro-forma de caspase-13,4. Este complexo permite induzida por proximidade autoativação de caspase-1. Ativa a caspase-1, em seguida, leva a um conjunto de eventos que são característicos da pyroptosis de caminho de morte celular inflamatória. Estes eventos incluem: a clivagem e liberação das citocinas IL-1 β e IL-18, exocitose lisossomo com lançamento de conteúdo lisossomal no espaço extracelular, condensação nuclear e gasdermin D clivagem. O domínio N-terminal lançado de gasdermin D insere-se na membrana plasmática, formando poros que causam a ruptura da membrana plasmática e liberação do conteúdo inflamatório, além de tirar um nicho protetor para patógeno replicação5, 6 , 7.
Aqui, focalizamos o inflammasome NLRP3 bem estudado. A ativação do inflammasome NLRP3 ocorre através de um processo de duas etapas8. O primeiro passo "escorva" ocorre através do reconhecimento por receptores do tipo Toll (TLR) de um produto microbiano. Isto é replicado no cenário de laboratório usando LPS para estimular TLR4. Esta estimulação upregulates NLRP3 e pro-IL-1 β através de sinalização do NF-kB. Escorva adicionalmente licenças NLRP3 através de mecanismos não-transcriptional induzindo sua deubiquitination9,10 e fosforilação ou desfosforilação de resíduos específicos de11,12.
O segundo sinal para ativação NLRP3 é pensado para envolver fatores mitocondriais, espécies reativas de oxigênio, efluxo de potássio e cálcio, sinalização, apesar de um mecanismo unificador para ativação NLRP3 permanece elusiva8. NLRP3 ativado oligomerizes através de interações entre seus domínios NACHT e recrutas ASC através da ligação dos domínios pyrin (PYD)13. Em cada célula, estes complexos macromoleculares formam um único foco microscopicamente visível. ASC foi originalmente identificada como uma proteína KDa 22 que forma uma "mancha" durante a apoptose de células de leucemia humana e chamada apoptose-grão, como proteína associada contendo um cartão14. Mais tarde foi determinado que o ASC recrutas pro-caspase-1 através da interação do cartão da ASC com o cartão de pro-caspase-1, formando a inflammasome15.
Nem todos os NLRs exigem a presença de ASC para induzir a ativação de caspase-1. Ao contrário de NLRP3, NLRC4 e NLRP1b têm cartão domínios e diretamente podem recrutar pro-caspase-1 através de interações de cartão-cartão para induzir a ativação de caspase-1. Na ausência de ASC, ativa a caspase-1 permanece difusa por todo o citosol e não forma um único foco. Este ativo difusa caspase-1 é suficiente para induzir a morte celular de pyroptotic, mas é incapaz de processar a pro-IL-1 β13,16.
Neste manuscrito, discutiremos duas maneiras de avaliar a ativação de inflammasome. O primeiro usa a atividade fluorescente sonda, FAM-YVAD-FMK, que vincula a caspase-1 família de proteases. Esta família inclui caspase-1, mas também do mouse caspase-11 e caspase-4 humano e caspase-5. Usando os macrófagos de camundongos deficientes de caspase-1/11 em todos os experimentos, será abordada a especificidade da sonda. Esse método pode ser combinado com anticorpo rotulagem de inflammasome componentes, que também descreveremos. Visualização microscópica permite a identificação de células individuais contendo ativa a caspase-1 e oligomerized ASC. Usando esse método, os pesquisadores poderão determinar onde na cascata da formação inflammasome suas manipulações da célula hospedeira ou o organismo patogénico em estudo tem um efeito. Por exemplo, pode-se distinguir se uma determinada intervenção impede que o recrutamento de ASC para o NLRP3 complexo ou metas a subsequente recrutamento e ativação de caspase-117. Examinar os resultados da ativação de caspase-1 como a secreção de IL-1 β não seria capaz de distinguir entre estas duas possibilidades. Além disso, a secreção de IL-1 β poderia ser alterada sem alterar a capacidade de células para ativar caspase-1 e submeter-se pyroptotic célula morte16.
O segundo método mede a liberação de lactato desidrogenase (LDH) na célula de sobrenadante, que ocorre durante a lise de macrófagos pyroptotic seguindo a ativação de caspase-1, conforme descrito acima. Este segundo método é uma abordagem baseada na população, como a liberação de LDH em todo o bem é medida. Esta abordagem simples permite a análise rápida (30 minutos de tempo de incubação) das amostras para determinar se há morte celular mediada por caspase-1 e pode ser executada em um formato de placa de 96 poços.
Esses métodos são complementares, cada um com diferentes vantagens e ambos são facilmente passível de modificações. Por exemplo, tratamento de macrófagos com compostos alvo peso molecular pequeno antes da estimulação inflammasome pode ser usado para investigar o papel de certo proteínas podem ter sobre como controlar respostas inflamatórias.

<table><tbody><tr><td>E-MEM</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Para células L929 em crescimento</td></tr><tr><td>NCRC clone 929 (L929)</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Fixação/Permeabilização</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Inclui solução de fixação e permeabilização e tampão de lavagem. Formulações proprietárias. Contém 4,2% de formaldeído</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Biorad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Cytotox96 Ensaio de citotoxicidade não radioativa</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-G1780</td><td>Inclui mistura de substrato e tampão de ensaio; Formulações proprietárias. A solução de parada é 1 M Ácido acético</td></tr><tr><td>FAM-YVAD-FMK</td><td>Immunocytochemistry Technologies</td><td>98</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, sem glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, sem glutamina, sem vermelho de fenol</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco, sem cálcio, sem magnésio</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal, qualificado, origem dos EUA</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Calor inativado a 55&deg; C por 50 min</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Invitrogen</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Mounting Medium</td><td>Invitrogen</td><td>p36934</td><td>Formulação proprietária. Meio de montagem de cura. Endurece ao índice refratário de 1,46</td></tr><tr><td>cabra anti-rato ALEXA555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Pure)</td> <td>Invitrogen</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>21051024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Iodeto</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>fluorescente vermelho distante coloração de ácido nucleico</td></tr><tr><td>C57BL/6J camundongo</td><td>Jackson Laboratoy</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>caspase-1/11-/- camundongo</td><td>Jackson Laboratory</td><td>016621</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8X Microscópio Confocal</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LPS de Salmonella minnesota R595 (Re)</td><td>List Biologicals</td><td>434</td><td></td></tr><tr><td>clone anti-ASC 2EI-7</td><td>Millipore-Sigma</td><td>04-417</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercapto-etanol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E5391</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax M3 leitor de placas</td><td>Molecular Devices</td><td>5000414</td><td></td></tr></tbody></table>

deteção de ativação de inflammasome e morte celular de pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes são as plataformas sinalização imunes inatas que são necessários para o controle bem sucedido de muitos organismos patogénicos, mas também promovem inflamatória e doenças autoinflamatória. Inflammasomes são ativadas por receptores de reconhecimento padrão citosólica, incluindo membros da família do receptor (NLR) NOD-like. Estes receptores oligomerize na detecção de estímulos microbianas ou associada a danos. Recrutamento subsequente da proteína do adaptador ASC forma um complexo, de inflammasome microscopicamente visível que ativa a caspase-1 através da autoativação induzida por proximidade. Após a ativação, caspase-1 cliva pro-IL-1 β e pro-IL-18, levando à ativação e secreção dessas citocinas pró-inflamatórias. Caspase-1 também atua como mediador inflamatória forma de morte celular denominado pyroptosis, que apresenta a perda da lise de integridade e de célula de membrana. Caspase-1 fende gasdermin D, liberando o fragmento N-terminal que forma poros da membrana plasmática, levando a Lise osmótica.
In vitro, a ativação de caspase-1 pode ser determinado através da marcação de macrófagos derivados da medula óssea com a sonda de caspase-1 atividade FAM-YVAD-FMK e através da marcação das células com anticorpos contra a proteína do adaptador ASC. Esta técnica permite a identificação de inflammasome formação e ativação de caspase-1 em células individuais usando microscopia de fluorescência. Morte celular de Pyroptotic pode ser detectada medindo-se o lançamento do citosol lactato desidrogenase no meio de. Este procedimento é simples, custo-eficaz e realizado em um formato de placa de 96 poços, que permita a adaptação para a seleção. Neste manuscrito, mostramos que a ativação do inflammasome NLRP3 por nigericin leva à co localização da proteína do adaptador ASC e ativa a caspase-1, levando a pyroptosis.

Para detectar a ativação de caspase-1 após a exposição de nigericin, as células foram processadas conforme descrito na seção de protocolo. Nós combinamos ambos FAM-YVAD-FMK e ASC anticorpo rotulando a fim de mostrar que ASC e ativa a caspase-1 co localizar após ativação mediada por NLRP3 inflammasome. Figura 1A mostra que o tipo selvagem macrófagos expostos a 5 μM nigericin têm formação de um foco ASC na região perinuclear. Estes focos contenham também ativa ...

Descrevemos a detecção de ativação de inflammasome NLRP3 em bases celulares usando microscopia de fluorescência e mancha para ativa a caspase-1 e o adaptador, ASC. Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase é apresentado para detectar pyroptotic lise em uma base de população. Estas técnicas podem ser adaptadas para estudar muitos aspectos da biologia de inflammasome.

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Os objetivos gerais deste protocolo são examinar a ativação do inflamassoma no nível de uma única célula por meio de microscopia de fluorescência e medir a lise durante a piroptose por um ensaio de liberação de lactato desidrogenase ou LDH. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do inflamassoma, como como a ativação da Caspase-1 é regulada. A principal vantagem dessas técnicas é que elas permitem ao usuário examinar várias etapas das vias de ativação do inflamassoma e piroptose.Demonstrando o procedimento estará Andreas den Hartigh, um cientista pesquisador do meu laboratório. Comece substituindo o meio de macrófagos derivados da medula óssea preparados com LPS semeados em lamínulas de vidro por 290 microlitros de meio DMEM 5, suplementado com cinco nigerina micromolar e cinco glicina milimolar, por poço. Retorne a placa de 24 poços para a incubadora de cultura de células por 60 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, adicionando 10 microlitros de 30X FAM-YVAD-FMK após os primeiros 15 minutos.No final da incubação, lave as células com um mililitro de PBS frio por poço, três vezes por cinco minutos por lavagem e fixe as células com 250 microlitr

detection-inflammasome-activation-pyroptotic-cell-death-murine-bone

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um método para detectar a ativação do inflamassoma NLRP3 em macrófagos usando sondas repórteres fluorescentes. As células são tratadas com ionóforos de potássio e glicina para induzir a montagem do inflamassoma e a ativação da caspase-1. As sondas repórteres fluorescentes visualizam a caspase-1 ativada e as células são coradas com um corante fluorescente para visualização dos núcleos.

Detecção de ativação do inflamassoma por microscopia de fluorescência

Este vídeo demonstra uma técnica para estudar a formação de inflamassoma contendo 3 (NLRP3) contendo domínio de pirina da família de receptores semelhantes a NOD em macrófagos primários por meio de imunofluorescência. Os macrófagos são primeiro preparados com lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) para regular positivamente a expressão da proteína NLRP3. A exposição dos macrófagos à nigericina - um ionóforo de potássio - leva à ativação do NLRP3 e à formação de inflamassomas, que são visualizados...

Uma técnica in vitro para estudar a formação de complexos inflamassoma em macrófagos

Este vídeo demonstra o ensaio de lactato desidrogenase para detectar a morte de macrófagos mediada por inflamassoma. Os macrófagos são expostos ao lipopolissacarídeo para priming, seguido pela exposição à nigericina para causar a morte celular induzida pelo inflamassoma, que é determinada pelo ensaio de lactato desidrogenase.

Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase para detectar a morte de macrófagos após a exposição à nigericina

Este vídeo demonstra a avaliação de múltiplas ativações de caspase em macrófagos derivados da medula óssea por meio da estimulação com o vírus influenza. Após a lise dos macrófagos, inativação do lisado pelo calor e centrifugação, as caspases intracelulares são coletadas para análise imunológica subsequente.

Avaliação da ativação de múltiplas caspases em macrófagos

O artigo descreve a adaptação prontamente...

Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

As células dendríticas (CDs) segregam IL-1β em resposta ao reconhecimento de purina TLR8 sintético, R848, seguido por activação inflammasome NLRP3 com nigericina, por conseguinte, a IL-1β pode ser utilizado para medir a actividade inflammasome NLRP3. Coloração intracelular de citocinas, immunoblotting e ELISA são usados ​​para medir com precisão NLRP3 inflammasome priming e ativação via expressão de IL-1β.

Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

Este protocolo apresenta um método eficaz e fiável para transfectar humanos THP-1, macrófagos com siRNA ou de ADN de plasmídeo por electroporação com alta eficiência de transfecção elevada, mantendo a vitalidade celular e capacidade total de diferenciação de macrófagos e de polarização.

A transfecção altamente eficiente de THP-1 por macrófagos humanos Nucleofection

Este protocolo fornece aos pesquisadores um método rápido e indireto de medição de atividade de fator de transcrição NF-кB/AP-1 dependente de TLR em uma linha de células de macrófagos de urina em resposta a uma variedade de superfícies poliméricas e camadas de proteína adsorbed que modelam o microambiente de implante biomaterial.

Um ensaio celular do repórter do macrófago para examinar a sinalização nf-kB/AP-1 mediada pelo receptor em macrófagos em camadas de proteína adsorbed em superfícies poliméricas

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para obter macrófagos derivados de monócitos (MDM) a partir de amostras de sangue humano, um método simples para introduzir eficientemente os repórteres de complementação de fluorescência bimolecular inflamatória (BiFC) em MDM humano sem comprometer a viabilidade e o comportamento celular, e uma abordagem baseada em imagens para medir a ativação inflamatória de caspase em células vivas.

Visualização de Caspases Inflamatórias Induzidas proximidade em macrófagos derivados de monócitos humanos

Este protocolo descreve um método abrangente para avaliar a ativação da caspase (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 e caspase-11) em resposta a modelos in vitro e in vivo (em camundongos) de infecção, insultos estéreis e câncer para determinar o início de vias de morte celular, como piroptose, apoptose, necroptose e PANoptose.

Avaliação da ativação da caspase para avaliar a morte de células imunes inatas

Este protocolo é baseado na morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Usamos citometria de fluxo para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-AAD para detectar morte celular, usando a célula inteira e empregando microscopia eletrônica de varredura para observar a morfologia da membrana celular.

Morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA e sua validação

Aprenda a detectar ativação do inflamassoma NLRP3 em macrófagos derivados de medula óssea murina usando microscopia de fluorescência e ensaio de liberação de LDH. Este método permite analisar a piroptose em nível de célula única.

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

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