Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis
15 de março de 2018
Neste artigo, discutimos três cérebro as preparações para a gravação de grampo celular patch para estudar o circuito retinotectal de girinos de Xenopus laevis . Cada preparação, com suas próprias vantagens específicas, contribui para a rastreabilidade experimental da larva Xenopus como um modelo para estudar a função do circuito neural.
O objetivo geral deste procedimento é obter registros eletrofisiológicos de células inteiras de neurônios do tectum óptico do girino, a fim de aprender sobre seu padrão de conectividade durante o desenvolvimento e, finalmente, entender como os circuitos neurais se formam e funcionam. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento neural, como como os neurônios mudam ao longo do desenvolvimento e como os circuitos funcionam para dar origem ao comportamento. A principal vantagem dessas preparações é que elas permitem o registro eletrofisiológico dos neurônios do tectum óptico para fornecer informações sobre a função dos circuitos neurais em desenvolvimento.
Demonstrando o procedimento estará Zhenyu Lui, um estudante de pós-graduação em meu laboratório. Usando uma pipeta de transferência de descarte, mova o girino anestesiado para um prato de registro de dissecção contendo solução de registro externo. Prenda o girino anestesiado a um bloco de silicone submerso no chão do prato de gravação de dissecação.
Para uma visão clara do cérebro, remova a pele que cobre o cérebro fazendo uma incisão superficial ao longo da linha média usando uma agulha estéril de calibre 25. Retire o cérebro ao longo do mesmo eixo da linha média, inserindo a agulha no tubo neural e puxando suavemente para cima, de modo que a porção dorsal do tubo seja cortada de forma limpa, deixando a placa do piso intacta. Para isolar o cérebro, primeiro use uma agulha de calibre 25 para cortar o rombencéfalo.
Em seguida, passe suavemente a agulha por baixo do cérebro na direção caudal a rostral para cortar todo o tecido conjuntivo lateral e ventral e as fibras nervosas. Em seguida, prenda o cérebro a um bloco de elastômero de silicone, colocando um pino em um dos bulbos olfatórios e outro pino no rombencéfalo. Esta é a configuração ideal para gravação de neurônios tectais.
Em seguida, mova o prato contendo a preparação cerebral inteira fixada do escopo de dissecação para o equipamento de eletrofisiologia. Remova a membrana ventricular usando uma pipeta de vidro quebrado. Para ativar diretamente os axônios RGC, abaixe suavemente um eletrodo estimulante bipolar no quiasma óptico, de modo que um pequeno dente seja formado no tecido.
O eletrodo estimulante bipolar deve ser rostral e quase adjacente ao grande ventrículo médio onde o quiasma óptico está localizado. O eletrodo bipolar é acionado por um estimulador de pulso que permite que a força da estimulação seja controlada com precisão. Para preparar a fatia horizontal do cérebro, comece com toda a preparação do cérebro.
Em seguida, use uma lâmina de barbear para extirpar o quarto mais lateral de um lado de um tectum óptico. Este corte é feito paralelamente ao plano caudal rostral. Depois, prenda novamente o cérebro ao lado do elastômero de silicone com o lado fatiado voltado para cima para que o somata e o neurópilo possam ser acessados diretamente para registro e a superfície ventricular do cérebro voltada para longe do bloco de elastômero de silicone para que um eletrodo bipolar possa ser colocado no quiasma óptico.
Em seguida, execute o patch clamp de célula inteira ou o registro de potencial de campo local. Aqui está o esquema que mostra a configuração de uma preparação horizontal de fatia cerebral. Observe que, embora o eletrodo estimulante permaneça no quiasma óptico, a pipeta de registro agora está posicionada para acessar as células em todas as camadas tectais expostas pela preparação horizontal da fatia cerebral.
Esta é uma resposta evocada por RGC de um neurônio que reside na camada superficial do tectum. Nesta figura, os potenciais de campo registrados no neurópilo e as densidades de fonte de corrente convertidas são mostrados pelo gráfico de imagem. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 10 minutos e normalmente por até três ou quatro horas.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a preparação do cérebro inteiro e da fatia horizontal do cérebro para gravações de células inteiras, a fim de quantificar as propriedades elétricas dos neurônios tectais e sua conectividade.
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Visão Geral
Este estudo explora técnicas de gravação por microeletrodo de patch em células inteiras para investigar o circuito retinotectal em girinos de Xenopus laevis. Ao utilizar diferentes preparações cerebrais, a pesquisa tem como objetivo compreender os padrões de conectividade dos neurônios no tecto óptico dos girinos durante o desenvolvimento e a função geral dos circuitos neurais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Circuitaria Neural
Antecedentes
- Investigar como os circuitos neurais se formam e funcionam em organismos em desenvolvimento.
- O circuito retinotectal é crucial para o processamento visual em anfíbios.
- As larvas de Xenopus laevis servem como um modelo valioso para estudar a conectividade neural.
- Os registros de célula inteira fornecem informações detalhadas sobre a atividade neuronal.
Objetivo do Estudo
- Compreender os padrões de conectividade entre neurônios no tecto óptico.
- Analisar como os neurônios mudam ao longo do desenvolvimento.
- Explorar como os circuitos neurais contribuem para o comportamento.
Métodos Utilizados
- Os métodos de grampo de membrana em célula inteira foram utilizados para registros eletrofisiológicos.
- O modelo biológico envolveu cérebros de girinos dissecados para estudar neurônios do teto óptico.
- Nenhum fluxo de trabalho de multiômica foi mencionado.
- Os passos específicos incluíram imobilizar o girino, isolar o cérebro e realizar registros direcionados.
- Os métodos permitem registros dentro de um período crítico de 10 minutos, geralmente com duração de várias horas.
Resultados Principais
- Os preparos facilitaram com sucesso a gravação da atividade neuronal no teto.
- Foram observadas alterações eletrofisiológicas indicativas de conectividade neural.
- Os resultados provocaram discussões sobre as implicações funcionais do circuito retinotectal.
- Os achados contribuem para a compreensão da circuitaria neural em desenvolvimento.
Conclusões
- Esta pesquisa demonstra métodos eficazes para estudar a conectividade neural em cérebros de girinos em desenvolvimento.
- O estudo aprimora a compreensão da função dos circuitos neurais durante o desenvolvimento.
- Os resultados têm implicações mais amplas para examinar processos neurológicos e comportamentos em anfíbios.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O registro por fixação de membrana em células inteiras em girinos de Xenopus laevis permite a investigação de alta resolução da formação e função de circuitos neurais, fornecendo insights mecanicistas sobre a conectividade sináptica e a excitabilidade neuronal durante o desenvolvimento. Essa abordagem auxilia na validação de alvos em neurociência ao permitir a medição direta das respostas neuronais a estímulos definidos, como a atividade evocada por células ganglionares da retina no teto óptico. A adaptabilidade do método em preparações in vivo, cérebro inteiro e cortes horizontais aumenta a reprodutibilidade e escalabilidade para a redução de riscos pré-clínicos de alvos neurodesenvolvimentais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação das respostas neuronais a estímulos sensoriais, esclarecendo a conectividade funcional em circuitos em desenvolvimento.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio de leituras eletrofisiológicas diretas da atividade neuronal, reduzindo a ambiguidade no engajamento do alvo.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao associar perturbações genéticas ou farmacológicas a alterações mensuráveis na excitabilidade neuronal tectal e na integração sináptica.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos em etapas subsequentes, estabelecendo preparações neuronais estáveis e passíveis de registro, com propriedades definidas de estímulo-resposta.
- Saídas Quantitativas: Gera medidas eletrofisiológicas, como correntes pós-sinápticas e potenciais de campo, permitindo a análise de dose-resposta e a quantificação dos efeitos dos compostos.
- Reutilização da Plataforma: O preparo de fatias horizontais do cérebro permite registros em todas as camadas do teto, aumentando a produtividade e a consistência em sessões experimentais repetidas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela processos neurodesenvolvimentais relevantes para transtornos envolvendo má conexão de circuitos, apoiando a exploração translacional de biomarcadores.
- Continuidade Pré-clínica: Conecta descoberta e validação ao permitir o registro consistente da função neuronal ao longo de pontos temporais do desenvolvimento.
- Decisões com Ajuste de Risco: Apoia critérios de continuidade ou interrupção baseados em fenótipos eletrofisiológicos, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados de programas neurodesenvolvimentais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer a validação funcional de alvos neuronais antes da otimização do composto líder, com resultados que informam tanto a seleção do alvo quanto a compreensão mecanicista.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao registrar respostas evocadas de neurônios tectais após a estimulação de axônios de células ganglionares da retina.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio de preparações reprodutíveis de cérebro inteiro e fatias, gerando leituras eletrofisiológicas quantificáveis para triagem de compostos.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes, como amplitudes de corrente e latência, facilitando a comparação entre condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validade pré-clínica ao manter propriedades de circuitos relevantes para doenças em diferentes preparações, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma eletrofisiológica reutilizável, adaptável a múltiplos contextos experimentais, reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio da gravação neuronal direta.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade e a padronização entre laboratórios por meio de protocolos definidos de preparação para métodos in vivo, cérebro inteiro e cortes.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a detecção precoce de compostos ineficazes, reduzindo investimentos em alvos inviáveis.
- Impacto sobre o Portfólio: Orienta decisões de avanço ajustadas ao risco ao vincular resultados eletrofisiológicos à função em nível de circuito.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia e técnicas de dissecação microcirúrgica para um preparo cerebral consistente.
- Depende de soluções de registro extracelular estáveis e equipamentos de estimulação funcionais para respostas evocadas confiáveis.
- Necessita padronização entre equipes dos parâmetros de estímulo e configurações de registro para garantir a comparabilidade dos dados.
- A adaptação entre sistemas modelo pode exigir ajustes nos métodos de dissecação e semeadura com base no tamanho e acessibilidade do cérebro.
- As limitações práticas incluem taxas de sucesso dependentes do operador e estabilidade do preparo durante sessões prolongadas de registro.
