Name: A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a determinar a especificidade de proteases em extratos brutos de tecido de pulmão de camundongos ICR usando espectrometria de massa MALDI-TOF. Este protocolo permite analisar múltiplas amostras simultaneamente.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo Nihon farmacêutica Universidade bolsa de pesquisa da Universidade de Nihon farmacêutico (2016) e o MEXT KAKENHI Grant número JP17854179.

Protocolos experimentais animais foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade Nihon farmacêutico e realizados em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório da Universidade Nihon farmacêutico. O protocolo foi ajustado para extratos de tecido derivados de camundongos ICR. Camundongos ICR foram comprados de Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japão)
1. preparação do substrato Iminobiotin-etiquetado
O substrato sofre a fase sólida síntese usando grupo 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protegido aminoácidos, conforme descrito abaixo de11. Use a tabela 2 para determinar o Fmoc-composto usado, dependendo do aminoácido desejado e fase de síntese.
<ol><li>Swill 0,2 g de resina de Fmoc-NH-SAL com 10 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) em uma coluna de síntese.</li>
	<li>Adicione 5 mL de piperidina de 30% em DMF. A solução por 10 min cravar o Fmoc-grupo de rock.</li>
	<li>
Confira Fmoc clivagem com o ácido trinitrobenzenesulfonic (neutrófilos) teste12: adicionar 10 µ l de 1% neutrófilos em DMF e 10 µ l de diisopropylethylamine (DIPEA) para um tubo de vidro de2 10 x 75 mm e, em seguida, transferir uma pequena quantidade de resina para o vidro do tubo. A resina de Fmoc-clivada deve desenvolver uma cor laranja.
	<ol>
<li>Repita os passos 1,2-1,3 se este resultado é negativo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave a resina três vezes com 5 mL de DMF.</li>
	<li>
Adicionar 5 mL de DMF contendo 0,3 mmol do Fmoc-composto listado na tabela 2 (começando com o composto usado na etapa 1), 0,3 mmol de Hexafluorofosfato de O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium (HCTU), 0,3 mmol de 1- Hidroxilado-1H-benzotriazol, monohidrato (HOBt) e 0,6 mmol de diisopropylethylamine (DIPEA). Agitar a solução durante 30 min acoplar com a resina.
	<ol>
<li>Verifique este passo com o teste de neutrófilos. Se o resultado for positivo, isso significa que a reação não tem progredido suficientemente e este passo deve ser repetido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave a resina três vezes com 5 mL de DMF.</li>
	<li>Repeti a reação de alongamento, repetindo as etapas 1.2-1.6, mudando o Fmoc-composto usado na etapa 1.5 de acordo com a tabela 2.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de água de 2,5%, 1% triisopropylsilane (TIS) e 2,5% Etanoditiol (EDT) em ácido trifluoroacético para clivar peptídeos dos grupos resina e proteção. Agitar a solução durante 60 min.</li>
	<li>Filtrar e recolher o filtrado em um tubo de 50 mL.</li>
	<li>Adicionar 40 mL de álcool etílico frio e loja durante a noite a-20 ° C.</li>
	<li>Centrífuga 4.000 x g a-20 ° C durante 30 min. coletar o sedimento.</li>
	<li>Use um dessecador para 3h para remover o éter etílico.</li>
	<li>Adicione 1 mL de acetonitrilo 50% de água e dissolver os peptídeos brutos. Lyophilize a solução para remover o ácido trifluoroacético. Repita este passo várias vezes.</li>
	<li>
Purifica os peptídeos usando uma coluna de cartucho C18.
	<ol>
<li>Ative a resina na coluna C18 cartucho usando 3 mL de acetonitrila (ACN).</li>
		<li>Equilibrar com 5 mL de 5% do Grupo ACN, 0,1% TFA em H2O.</li>
		<li>Carrega os peptídeos sintéticos brutos na coluna C18 do cartucho.</li>
		<li>Lavar com 10 mL de 5% do Grupo ACN, 0,1% TFA em H2O.</li>
		<li>Eluir as amostras com 3 mL de 60% ACN, 0,1% TFA em H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verifique os peptídeos medindo seu peso molecular usando espectrometria de massa MALDI-TOF.
	<ol>
<li>Pipete 1 µ l de eluente numa placa de destino. Adicione imediatamente a solução ácida (CHCA) α-cyano-4-hidroxicinâmicos saturada em 50% acetonitrila em ácido trifluoroacético de 0,1%</li>
		<li>Cristalizar a mistura por secagem ao ar.</li>
		<li>Aquisição de espectros de massa das amostras de acordo com o protocolo do fabricante instrumento.<ol>
<li>Definir manualmente o espectrômetro de massa MALDI-TOF para um positivo refletir de modo.</li>
			<li>Calibrar o espectrômetro de massa usando CHCA, bradicinina fragmento 1-7 (peso molecular de monoisotópico = Da 756.3997) e da angiotensina II (peso molecular de monoisotópico = Da 1,045.5423).</li>
			<li>Adquirir os espectros de massa de peptídeos sintéticos e em seguida avaliar, comparando-o com o peso molecular teórico.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação dos extratos de tecido
<ol><li>Anestesiar os ratos masculinos ICR em uma câmara de inalação de isoflurano e verificar a profundidade de anestesia através de pitada de dedo do pé. Eutanásia em ratos por deslocamento cervical.</li>
	<li>Usando a tesoura, faça uma incisão abdominal através da pele, estendendo até o processo xifoide.</li>
	<li>Corte através do diafragma e recolher todo o tecido pulmonar. Corte o tecido em pequenos pedaços.</li>
	<li>Lave o tecido três vezes com gelada 50 mM Tris salino (pH 7,4).</li>
	<li>Pese os tecidos e a transferência de cerca de 100 mg de tecidos para um tubo de vidro 12 x 75 mm2 .</li>
	<li>Adicione 0,3 mL de tampão de extração (Tris-tampão, pH 7,4, contendo 0,1% de éter de octilfenil poli (oxietileno) de 50 mM).</li>
	<li>
Homogeneizar as amostras de tecido de pulmão usando um misturando homogenizador.
	<ol>
<li>Fixe as amostras no gelo.</li>
		<li>Homogeneizar as amostras a 20.000 rpm para 30 s em um liquidificador. Repita este passo até que as amostras são completamente homogêneas. Nota: Não homogeneizar durante mais de 1 minuto continuamente, a fim de evitar um aumento de temperatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferência de 1.000 µ l do homogeneizado para um tubo de 1,5 mL e centrifugar durante 5 min à 10.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Transferi 500 µ l do sobrenadante para um novo tubo de plástico de 1,5 mL.</li>
	<li>Use 10 µ l da amostra para determinar a concentração de proteína, usando métodos como o bicinchoninic ácido (BCA) ou o método de Coomassie brilhante azul (CBB).</li>
	<li>Para evitar o congelamento, adicione glicerol 80% para as amostras para uma concentração final de glicerol a 50%.</li>
	<li>Armazene as amostras a-80 ° C até utilização posterior.</li>
</ol>3. digestão de substratos no modelo Protease e extratos de tecido
<ol><li>
Adicionar 10 µ l de 0,1 µ g / µ l de cetona de clorometil N-Tosil-L-fenilalanina (TPCK)-tripsina, 0,1 µ g / µ l de protease de Staphylococcus aureus V8 ou 10 µ g / µ l dos extratos de tecido em 890 µ l de um buffer de digestão.
	<ol>
<li>Para esclarecer a diferença na especificidade da protease dependendo do pH, use buffers ajustados ao pH 3, 5, 7 e 9. A composição do buffer digestão é mostrada na tabela 3.</li>
		<li>Efectue um controlo negativo usando protease inactiva em extratos de tecido, preparados pela incubação em água fervente (ou aquecimento a 100 ° C) por 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 10 µ l de substratos iminobiotin-rotulado (dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO), concentração final = 100 µ l de pmol/10).</li>
	<li>Incube durante 3 horas a 37 ° C para digerir substratos iminobiotin-rotulados.</li>
	<li>Após a incubação, pare a digestão de substratos com água a ferver (ou por aquecimento a 100 ° C) por 10 min.</li>
	<li>Centrifugue os substratos digeridos durante 5 min à 10.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Transferi o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
</ol>4. purificação do substrato Iminobiotin-etiquetado
<ol><li>
Adicione 50 µ l de grânulos de sepharose streptavidin 50% em 1 M-tampão Tris (pH 9) contendo 0,1% poly(oxyethylene) octilfenil éter.
	<ol>
<li>Use papel de teste de pH para garantir que a solução é em torno de pH 9. Se o pH da solução é baixo, ajustá-lo para aproximadamente pH 9, adicionando 1 M-tampão Tris (pH 9) contendo 0,1% poly(oxyethylene) octilfenil éter. Esta etapa é importante, já que envolve a ligação do substrato iminobiotin-rotulado de estreptavidina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube durante uma noite a 4 ° C, com uma mistura suave contínua em uma roda de rotator para ligar os substratos iminobiotin-rotulado o streptavidin. Os grânulos devem permanecer suspensos durante a incubação.</li>
	<li>Centrífuga para 1 min a 10.000 x g a 4 ° C. Remova o sobrenadante.</li>
	<li>
Lave os grânulos cinco vezes como segue:
	<ol>
<li>Adicione 1.000 µ l de um tampão de lavagem (50 mM Tris-tampão, pH 9) para as contas.</li>
		<li>Lavagem por 10 min a 4 ° C, com uma mistura suave contínua em uma roda de rotator. Os grânulos devem permanecer suspensos durante a incubação.</li>
		<li>Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C e remover o sobrenadante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adicione 100 µ l de ácido trifluoroacético de 0,2% para os grânulos.
	<ol>
<li>Use papel de teste de pH para garantir que a solução está abaixo de pH 2. Se o pH da solução é alto, ajuste o pH para abaixo de 2 adicionando ácido trifluoroacético de 1%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube durante 30 min à temperatura ambiente com mistura suave contínua em uma roda de rotator.</li>
	<li>Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C e, em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
</ol>5. preparação e espectrometria de massa (espectrometria de massa MALDI-TOF) tempo-de-voo de dessorção/ionização Matrix-Assisted Laser da amostra
Nota: Todas as soluções nas etapas a seguir devem ser preparadas com a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)-água de sequenciamento-grau grau ou aminoácido.
<ol><li>Pipete 500 µ l de acetonitrilo para uma resina C18 para ativá-lo. Remova o acetonitrilo usado. Repita este passo 3 vezes.</li>
	<li>Equilibrar a resina C18 com 100 µ l de ácido trifluoroacético de 0,1%. Remova o eluente. Repita este passo 3 vezes.</li>
	<li>Para carregar as amostras, vincule as amostras para a resina com uma pipeta.</li>
	<li>Lave a resina com 20 µ l de ácido trifluoroacético de 0,1%. Repita essa etapa cinco vezes.</li>
	<li>Eluir as amostras com 3 µ l de acetonitrilo 60% em ácido trifluoroacético de 0,1%. Pipete o eluente numa placa de destino por espectrometria de massa MALDI-TOF. Adicione imediatamente a solução ácida (CHCA) α-cyano-4-hidroxicinâmicos saturada em 50% acetonitrila em ácido trifluoroacético de 0,1%.</li>
	<li>Cristalizar a mistura por secagem ao ar.</li>
	<li>
Aquisição de espectros de massa das amostras de acordo com o protocolo do fabricante do instrumento.
	<ol>
<li>Definir manualmente o espectrômetro de massa MALDI-TOF para um positivo refletir de modo.</li>
		<li>Calibrar o espectrômetro de massa usando CHCA, bradicinina fragmento 1-7 (peso molecular de monoisotópico = Da 756.3997) e da angiotensina II (peso molecular de monoisotópico = Da 1,045.5423).</li>
		<li>Adquira os espectros de massa das amostras, prestando atenção aos espectros de massa de 700 a 900 para a forma clivada de substratos biotina-rotulados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifica os picos detectados usando a tabela 1. Deteção do peso molecular adequado indica clivagem no C-terminal do aminoácido relevante.</li>
</ol>

<ol><li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+%28a+review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li>
<li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein%5BTitle%5D)+AND+%22Vopr+Med+Khim%22%5BJournal%5D)">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li>
<li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li>
<li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li>
<li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li>
<li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li>
<li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li>
<li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li>
<li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li>
<li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li>
<li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00897a025">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li>
<li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2%2C4%2C6-trinitrobenzenesulphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li>
<li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+NeutraLite+avidin%3A+A+non-glycosylated%2C+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li>
<li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li>
</ol>

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Este protocolo utiliza a espectrometria de massa MALDI-TOF para identificar a especificidade de protease em amostras brutas derivado de extratos de tecido e facilmente pode ser ampliado para múltiplo processamento de amostra. Em particular, estamos manipulados pH para causar uma mudança na especificidade de substrato.
O método (ABC) complexo avidina-biotina, que tem sido amplamente utilizado em bioquímica devido à sua especificidade de ligação, foi utilizado em nosso protocolo. Devido a forte ...

Proteases regulam processos fisiológicos por clivagem de proteínas, e o início da atividade de protease em horários específicos e locais é regulamentado1. Portanto, é importante identificar a expressão e a atividade dos tecidos que são regulamentados localmente e desenvolver um novo método para detectar proteases. O método proposto neste estudo visa identificar a especificidade da protease em paralelo para detecção de proteases.
Existem alguns métodos para a detecção de especificidade de protease. O método azocasein é conhecido por sua utilização na detecção de proteases2 mas é limitado em sua capacidade de obter mais informações. Zimografia é outro método de deteção de protease abrangente que pode ser usado para determinar o peso molecular de proteases3, mas não pode ser usado para examinar a especificidade de substrato. Especificidade de protease pode ser determinada por ensaios de espectrometria, usando substratos tais como p-nitroanilide4e ensaios fluorométrica, utilizando substratos de cumarina5 ou de ensaios de fluorescência ressonância energia transferência (FRET)6. Estes métodos permitem a detecção de single-especificidade de substratos contidos em um único poço. No presente estudo, a especificidade de protease de extratos de tecido é examinada sob várias condições, como estes extratos contêm várias proteases. Atividade de protease é regulada por vários fatores, incluindo pH, coenzimas, grupos prostético e força iônica. Recentemente, métodos baseados em proteômica têm sido usados para identificar a especificidade da protease; por exemplo, o método relatado por Biniossek et al. 7 usa a proteoma para determinar a especificidade de substrato mesmo em extratos brutos e permite a determinação exata da atividade de proteases que reconhecer várias sequências de aminoácidos8clivagem. No entanto, esse método não é adequado para a análise de várias amostras. Em contraste, o nosso método permite o processamento simultâneo de várias amostras e o uso de Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização tempo-de-voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa para análise de amostra facilita a detecção rápida e fácil do clivada substratos.
Este artigo descreve um método para avaliar a especificidade do protease usando espectrometria de massa MALDI-TOF para medir o peso molecular de substratos exclusivos. As formas moleculares de substratos clivados, juntamente com seus pesos moleculares teóricos, são mostradas na Figura 1 e tabela 1. Estudos anteriores têm utilizados substratos contendo polyglycine espaçadores e biotina9; no entanto, estes substratos são falhos porque a sequência de polyglycine pode ser clivada por enzimas que reconhecem a sequência de glicina. Além disso, a alta afinidade entre avidina e biotina pode levar a uma taxa de recuperação de baixo. Para melhorar estes inconvenientes, neste estudo que nós sintetizado um substrato original, que era composto de polietileno glicol (PEG), iminobiotin e um aminoácido que pode identificar o local de clivagem (Figura 1). Para discriminar entre aminoácidos de peso moleculares similares, D-serina foi adicionado entre o espaçador de PEG e o aminoácido no site entalhado.
O N-terminal do substrato foi rotulado com iminobiotin, que permite a purificação da afinidade de amostras brutas. O uso de iminobiotin em vez de biotina é crítico; Biotina tem uma forte afinidade com avidina, que resulta em taxas de baixa recuperação de substratos de biotina-rotulado de resina avidin, enquanto a afinidade do iminobiotin para avidin pode ser alterada por pH. Iminobiotin-rotulado substratos irão ligar para avidin nas condições acima pH 9, enquanto avidin libera substratos iminobiotin-etiquetadas em condições abaixo de pH 4. Portanto, iminobiotin foi usado para purificação de afinidade10. Em resumo, nós descrevemos um protocolo detalhado para a detecção de especificidade de protease usando substratos exclusivos.

<table><tbody><tr><td>Resina Fmoc-NH-SAL (- [2,4-Dimetoxifenil-N- (9-fluorenilmetoxicarbonil) aminometil]fenoxi resina)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00102</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimetilformamida (DMF)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00185</td><td></td></tr><tr><td>piperidina</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00176</td><td></td></tr><tr><td>ácido trinitrobenzenossulfônico (TNBS)</td> <td>WAKO Chemical</td><td>209-1483</td><td></td></tr><tr><td>O- (6-Cloro-1H-benzotriazol-1-il) -N, N, N ', N'-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HCTU)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00067</td><td></td></tr><tr><td>1-Hidroxi-1H-benzotriazol, monohidrato (HOBt)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00014</td><td></td></tr><tr><td>diisopropiletilamina (DIPEA)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00030</td><td></td></tr><tr><td>triisopropilsilano (TIS)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00170</td><td></td></tr><tr><td>ethanedithiol (EDT)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00057</td><td></td></tr><tr><td>ácido trifluoroacético (TFA)</td> <td>Millipore</td><td>S6612278 403</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrila</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2153025</td><td></td></tr><tr><td>coluna de cartucho C18</td><td>Águas</td><td>WAT051910</td><td></td></tr><tr><td>éter octilfenílico de poli (oxietileno)</td><td>WAKO Chemical</td><td>168-11805</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>homogeneizador de mistura</td><td>Kinematica</td><td>PT3100</td><td>Homogeneizador Polytron</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250</td><td>Nakarai Chemical</td><td>094-09</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Nakarai Chemical</td><td>170-18</td><td></td></tr><tr><td>N-tosil-L-fenilalanina clorometilcetona (TPCK)-tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>WAKO Chemical</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>estreptavidina sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td>17-511-01</td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-ciano-4-hidroxicinâmico ácido (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2020</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF espectrometria de massa</td><td>Bruker Daltonics, Alemanha</td><td>autoflex</td><td></td></tr><tr><td>2-iminobiotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4632</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-aminoácidos</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a determinação da especificidade da protease no mouse tecido extrai por espectrometria de massa maldi-tof: manipulando o ph para causar alterações de especificidade

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases têm várias funções biológicas, incluindo a digestão de alimentos e ativação/inativação de proteínas. Identificar a especificidade da protease é importante por revelar a função de protease. O método proposto neste estudo determina a especificidade de protease medindo-se o peso molecular de substratos exclusivos usando Matrix-assisted Laser dessorção/ionização de espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF). Os substratos contêm iminobiotin, enquanto o site clivado consiste de aminoácidos, e o espaçador é composto por polietileno glicol. O substrato clivado irá gerar um único peso molecular, usando um ácido aminado clivado. Um dos méritos desse método é que pode ser efectuada em uma panela, usando amostras brutas, e é também adequado para avaliar várias amostras. Neste artigo, descrevemos um método experimental simples otimizado com amostras extraídas do tecido do pulmão do rato, incluindo a extracção de tecido, colocação de substratos digestivos em amostras, purificação de substratos digestivos sob condições de pH diferente e medição de peso molecular dos substratos, utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF. Em resumo, esta técnica permite a identificação da especificidade da protease em amostras brutas derivado de extratos de tecido usando espectrometria de massa MALDI-TOF, que facilmente pode ser ampliada para múltiplo processamento de amostra.

Avaliação do método para a identificação da especificidade de protease por protease modelo
A eficiência deste sistema foi avaliada usando TPCK-tripsina e protease V8, cujas especificidades do substrato foram obtidas. TPCK-tripsina e protease V8 foram estimados para clivar a sequência de aminoácidos no C-terminal dos resíduos lisina e arginina e no lado de carboxila do ácido aspártico e ácido glutâmico resíduos, respectivamente. <st...

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a especificidade da protease no tecido cru rato extratos usando espectrometria de MALDI-TOF.

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

O objetivo geral deste experimento é determinar a especificidade da protease em vários extratos brutos. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave para determinar a especificidade da protease. A principal vantagem desta técnica é que ela pode identificar a especificidade da protease de várias amostras em parlay.Amostras de tecido pulmonar frio obtidas de camundongos ICR machos em gelo. Homogeneizar as amostras a 20.000 RMP por 30 segundos no liquidificador. Repita esta etapa até que as amostras estejam completamente homogêneas.Não homogeneizar por mais de um minuto continuamente para evitar o aumento da temperatura. Transfira 1.000 microlitros do homogeneizado para um tubo de 1,5 mililitro e centrifugue por cinco minutos a 10.000 vezes G a quatro graus Celsius. Transfira 500 microlitros do sobrenadante para um novo tubo de plástico de 1,5 mililitro.Use 10 microlitros da amostra para determinar a concentração de proteína. Usando métodos, como o ensaio de ácido bicinconínico ou o ensaio de Bradford. Para evitar o congelamento, adicione 80% de glicerol às amostras para uma concentração final de 50% de glicerol.Para esclarecer a diferença na especificidade da protease dependendo do pH, use tampões de digestão ajustados para pH três, cinco, sete e nove. Em 890 microlitros de um tampão de digestão, adicione 10 microlitros de 0,1 micrograma por microlitro ou tripsina TPCK, 0,1 micrograma por microlitro de protease V8 de staphylococcus aureus ou 10 microgramas por microlitro de extratos de tecido. Preparar os controlos negativos inactivando a protease nos extractos teciduais por incubação e água a ferver durante 10 minutos.Em seguida, adicione 10 microlitros de substratos de rótulo de biotina MNO às amostras e incube por três horas a 37 graus Celsius para digerir. Após a incubação, interrompa a digestão dos substratos com água fervente por 10 minutos. Centrifugue os substratos digeridos por cinco minutos a 10.000 vezes G a quatro graus Celsius.Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitros. Adicione 50 mililitros de grânulos de sepharose de estreptavidina a 50% em um tampão tris molar, contendo 0,1% de éter octilfenílico de polioxietileno. Use papel de teste de pH para garantir que a solução esteja em torno de pH nove.É importante ajustar o pH adequado para nove ou mais. A aminobiotina não pode morder uma morder uma pérola, a menos que tenha pH nove ou superior. Se o pH da solução estiver baixo, ajuste-o para aproximadamente pH nove adicionando mais tampão.Além disso, um tampão tris molar pode ser adicionado para aumentar o pH, se necessário. Incube a suspensão durante a noite a quatro graus Celsius com mistura suave contínua em uma roda rotadora para ligar os substratos marcados com biotina MNO à estreptavidina. As esferas devem permanecer suspensas durante toda a incubação.No dia seguinte, centrifugue as amostras durante um minuto a 10 000 vezes G a quatro graus Celsius. Depois de remover o sobrenadante, lave as contas adicionando 1.000 microlitros de um tampão de lavagem. Em seguida, incube por 10 minutos a quatro graus Celsius com mistura suave contínua em um rotador.Centrifugue os grânulos por um minuto a 10.000 vezes G a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e repita esta lavagem quatro vezes. Em seguida, adicione 100 microlitros de ácido trifluoroacético a 0,2% às contas.Use papel de teste de pH para garantir que a solução esteja abaixo do pH dois. Se o pH da solução for alto, ajuste o pH para menos de dois adicionando ácido trifluoroacético a 1%. Incube a suspensão por 30 minutos em temperatura ambiente com mistura suave contínua em uma roda rotadora.Depois de centrifugar as esferas como antes, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitros. Pipetar 20 microlitros de acetonitrila em uma resina C18 para ativá-la. Remova a acetonitrila usada e repita esta etapa de ativação três vezes.Em seguida, equilibre a resina C18 com 20 microlitros de ácido trifluoroacético a 0,1%. Retirar o eluente e repetir este passo de equilíbrio três vezes. Para carregar as amostras, ligue-as à resina usando uma pipeta.Lave a resina com 20 microlitros de ácido trifluoroacético a 0,1%. Repita esta etapa cinco vezes. Eluir as amostras com três microlitros de acetonitrila a 60% em ácido trifluoroacético a 0,1%.Pipetar o eluente em uma placa-alvo para espectrometria de massa MALDI-TOF. Adicione imediatamente a solução de CHCA, saturada em 50% de acetonitrila em ácido trifluoroacético a 0,1%. Cristalize a mistura por secagem ao ar.Adquirir espectros de massa de amostras, de acordo com o protocolo do fabricante do instrumento, prestando muita atenção aos espectros de massa de 700 a 900 daltons para a forma clivada dos substratos dos rótulos de biotina. Espectros de massa de substratos sintéticos são mostrados aqui. Picos correspondentes ao peso molecular do precursor foram detectados entre 850 e 1.050.Os fragmentos clivados são detectados na faixa de 700 a 850. Aqui são mostrados os espectros para substratos marcados com biotina MNO tratados com tripsina TPCK. Os picos de 839,81 dalton e 796,76 dalton correspondem aos fragmentos clivados do terminal C de lisina e arginina, respectivamente.Aqui são mostrados os espectros de massa de substratos sintéticos digeridos com protease V8. Os picos de 769,78 dalton e 755,62 dalton correspondem aos fragmentos clivados do terminal C do ácido glutâmico e do ácido aspártico, respectivamente. Os espectros para substratos de marcadores de biotina MNO tratados com um extrato de tecido pulmonar em várias condições de pH são mostrados aqui.Na condição ácida, em pH cinco, o peso molecular de um fragmento clivado foi de 770,13 daltons e 826,66 daltons, indicando clivagem no terminal C do ácido glutâmico e triptofano. Na condição neutra e básica, em pH sete e nove, o peso molecular de um fragmento clivado foi aumentado no pico de 767 daltons e 840 daltons, indicando clivado no terminal C de arginina e lisina. Por outro lado, os picos do ácido glutâmico e do triptofano diminuíram.Além disso, este método não pode detectar fragmentos clivados com extratos inativados. Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em dois dias se for realizada corretamente, exceto para a síntese de substrato. Além disso, uma vez que o substrato é sintetizado, ele pode ser medido em várias amostras. Por que?Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de operar no pH tampão, cerca de nove. Geralmente, a reação do complexo avidina amino biotina. Após este procedimento, é possível quantificar a atividade enzimática realizando um CMS.Este método permitirá que os pesquisadores no campo da protease abram caminho para explorar a expressão da protease em várias condições.

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