Name: A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a determinar a especificidade de proteases em extratos brutos de tecido de pulmão de camundongos ICR usando espectrometria de massa MALDI-TOF. Este protocolo permite analisar múltiplas amostras simultaneamente.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo Nihon farmacêutica Universidade bolsa de pesquisa da Universidade de Nihon farmacêutico (2016) e o MEXT KAKENHI Grant número JP17854179.

Protocolos experimentais animais foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade Nihon farmacêutico e realizados em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório da Universidade Nihon farmacêutico. O protocolo foi ajustado para extratos de tecido derivados de camundongos ICR. Camundongos ICR foram comprados de Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japão)
1. preparação do substrato Iminobiotin-etiquetado
O substrato sofre a fase sólida síntese usando grupo 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protegido aminoácidos, conforme descrito abaixo de11. Use a tabela 2 para determinar o Fmoc-composto usado, dependendo do aminoácido desejado e fase de síntese.
<ol><li>Swill 0,2 g de resina de Fmoc-NH-SAL com 10 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) em uma coluna de síntese.</li>
	<li>Adicione 5 mL de piperidina de 30% em DMF. A solução por 10 min cravar o Fmoc-grupo de rock.</li>
	<li>
Confira Fmoc clivagem com o ácido trinitrobenzenesulfonic (neutrófilos) teste12: adicionar 10 µ l de 1% neutrófilos em DMF e 10 µ l de diisopropylethylamine (DIPEA) para um tubo de vidro de2 10 x 75 mm e, em seguida, transferir uma pequena quantidade de resina para o vidro do tubo. A resina de Fmoc-clivada deve desenvolver uma cor laranja.
	<ol>
<li>Repita os passos 1,2-1,3 se este resultado é negativo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave a resina três vezes com 5 mL de DMF.</li>
	<li>
Adicionar 5 mL de DMF contendo 0,3 mmol do Fmoc-composto listado na tabela 2 (começando com o composto usado na etapa 1), 0,3 mmol de Hexafluorofosfato de O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium (HCTU), 0,3 mmol de 1- Hidroxilado-1H-benzotriazol, monohidrato (HOBt) e 0,6 mmol de diisopropylethylamine (DIPEA). Agitar a solução durante 30 min acoplar com a resina.
	<ol>
<li>Verifique este passo com o teste de neutrófilos. Se o resultado for positivo, isso significa que a reação não tem progredido suficientemente e este passo deve ser repetido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave a resina três vezes com 5 mL de DMF.</li>
	<li>Repeti a reação de alongamento, repetindo as etapas 1.2-1.6, mudando o Fmoc-composto usado na etapa 1.5 de acordo com a tabela 2.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de água de 2,5%, 1% triisopropylsilane (TIS) e 2,5% Etanoditiol (EDT) em ácido trifluoroacético para clivar peptídeos dos grupos resina e proteção. Agitar a solução durante 60 min.</li>
	<li>Filtrar e recolher o filtrado em um tubo de 50 mL.</li>
	<li>Adicionar 40 mL de álcool etílico frio e loja durante a noite a-20 ° C.</li>
	<li>Centrífuga 4.000 x g a-20 ° C durante 30 min. coletar o sedimento.</li>
	<li>Use um dessecador para 3h para remover o éter etílico.</li>
	<li>Adicione 1 mL de acetonitrilo 50% de água e dissolver os peptídeos brutos. Lyophilize a solução para remover o ácido trifluoroacético. Repita este passo várias vezes.</li>
	<li>
Purifica os peptídeos usando uma coluna de cartucho C18.
	<ol>
<li>Ative a resina na coluna C18 cartucho usando 3 mL de acetonitrila (ACN).</li>
		<li>Equilibrar com 5 mL de 5% do Grupo ACN, 0,1% TFA em H2O.</li>
		<li>Carrega os peptídeos sintéticos brutos na coluna C18 do cartucho.</li>
		<li>Lavar com 10 mL de 5% do Grupo ACN, 0,1% TFA em H2O.</li>
		<li>Eluir as amostras com 3 mL de 60% ACN, 0,1% TFA em H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verifique os peptídeos medindo seu peso molecular usando espectrometria de massa MALDI-TOF.
	<ol>
<li>Pipete 1 µ l de eluente numa placa de destino. Adicione imediatamente a solução ácida (CHCA) α-cyano-4-hidroxicinâmicos saturada em 50% acetonitrila em ácido trifluoroacético de 0,1%</li>
		<li>Cristalizar a mistura por secagem ao ar.</li>
		<li>Aquisição de espectros de massa das amostras de acordo com o protocolo do fabricante instrumento.<ol>
<li>Definir manualmente o espectrômetro de massa MALDI-TOF para um positivo refletir de modo.</li>
			<li>Calibrar o espectrômetro de massa usando CHCA, bradicinina fragmento 1-7 (peso molecular de monoisotópico = Da 756.3997) e da angiotensina II (peso molecular de monoisotópico = Da 1,045.5423).</li>
			<li>Adquirir os espectros de massa de peptídeos sintéticos e em seguida avaliar, comparando-o com o peso molecular teórico.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação dos extratos de tecido
<ol><li>Anestesiar os ratos masculinos ICR em uma câmara de inalação de isoflurano e verificar a profundidade de anestesia através de pitada de dedo do pé. Eutanásia em ratos por deslocamento cervical.</li>
	<li>Usando a tesoura, faça uma incisão abdominal através da pele, estendendo até o processo xifoide.</li>
	<li>Corte através do diafragma e recolher todo o tecido pulmonar. Corte o tecido em pequenos pedaços.</li>
	<li>Lave o tecido três vezes com gelada 50 mM Tris salino (pH 7,4).</li>
	<li>Pese os tecidos e a transferência de cerca de 100 mg de tecidos para um tubo de vidro 12 x 75 mm2 .</li>
	<li>Adicione 0,3 mL de tampão de extração (Tris-tampão, pH 7,4, contendo 0,1% de éter de octilfenil poli (oxietileno) de 50 mM).</li>
	<li>
Homogeneizar as amostras de tecido de pulmão usando um misturando homogenizador.
	<ol>
<li>Fixe as amostras no gelo.</li>
		<li>Homogeneizar as amostras a 20.000 rpm para 30 s em um liquidificador. Repita este passo até que as amostras são completamente homogêneas. Nota: Não homogeneizar durante mais de 1 minuto continuamente, a fim de evitar um aumento de temperatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferência de 1.000 µ l do homogeneizado para um tubo de 1,5 mL e centrifugar durante 5 min à 10.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Transferi 500 µ l do sobrenadante para um novo tubo de plástico de 1,5 mL.</li>
	<li>Use 10 µ l da amostra para determinar a concentração de proteína, usando métodos como o bicinchoninic ácido (BCA) ou o método de Coomassie brilhante azul (CBB).</li>
	<li>Para evitar o congelamento, adicione glicerol 80% para as amostras para uma concentração final de glicerol a 50%.</li>
	<li>Armazene as amostras a-80 ° C até utilização posterior.</li>
</ol>3. digestão de substratos no modelo Protease e extratos de tecido
<ol><li>
Adicionar 10 µ l de 0,1 µ g / µ l de cetona de clorometil N-Tosil-L-fenilalanina (TPCK)-tripsina, 0,1 µ g / µ l de protease de Staphylococcus aureus V8 ou 10 µ g / µ l dos extratos de tecido em 890 µ l de um buffer de digestão.
	<ol>
<li>Para esclarecer a diferença na especificidade da protease dependendo do pH, use buffers ajustados ao pH 3, 5, 7 e 9. A composição do buffer digestão é mostrada na tabela 3.</li>
		<li>Efectue um controlo negativo usando protease inactiva em extratos de tecido, preparados pela incubação em água fervente (ou aquecimento a 100 ° C) por 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 10 µ l de substratos iminobiotin-rotulado (dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO), concentração final = 100 µ l de pmol/10).</li>
	<li>Incube durante 3 horas a 37 ° C para digerir substratos iminobiotin-rotulados.</li>
	<li>Após a incubação, pare a digestão de substratos com água a ferver (ou por aquecimento a 100 ° C) por 10 min.</li>
	<li>Centrifugue os substratos digeridos durante 5 min à 10.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Transferi o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
</ol>4. purificação do substrato Iminobiotin-etiquetado
<ol><li>
Adicione 50 µ l de grânulos de sepharose streptavidin 50% em 1 M-tampão Tris (pH 9) contendo 0,1% poly(oxyethylene) octilfenil éter.
	<ol>
<li>Use papel de teste de pH para garantir que a solução é em torno de pH 9. Se o pH da solução é baixo, ajustá-lo para aproximadamente pH 9, adicionando 1 M-tampão Tris (pH 9) contendo 0,1% poly(oxyethylene) octilfenil éter. Esta etapa é importante, já que envolve a ligação do substrato iminobiotin-rotulado de estreptavidina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube durante uma noite a 4 ° C, com uma mistura suave contínua em uma roda de rotator para ligar os substratos iminobiotin-rotulado o streptavidin. Os grânulos devem permanecer suspensos durante a incubação.</li>
	<li>Centrífuga para 1 min a 10.000 x g a 4 ° C. Remova o sobrenadante.</li>
	<li>
Lave os grânulos cinco vezes como segue:
	<ol>
<li>Adicione 1.000 µ l de um tampão de lavagem (50 mM Tris-tampão, pH 9) para as contas.</li>
		<li>Lavagem por 10 min a 4 ° C, com uma mistura suave contínua em uma roda de rotator. Os grânulos devem permanecer suspensos durante a incubação.</li>
		<li>Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C e remover o sobrenadante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adicione 100 µ l de ácido trifluoroacético de 0,2% para os grânulos.
	<ol>
<li>Use papel de teste de pH para garantir que a solução está abaixo de pH 2. Se o pH da solução é alto, ajuste o pH para abaixo de 2 adicionando ácido trifluoroacético de 1%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube durante 30 min à temperatura ambiente com mistura suave contínua em uma roda de rotator.</li>
	<li>Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C e, em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
</ol>5. preparação e espectrometria de massa (espectrometria de massa MALDI-TOF) tempo-de-voo de dessorção/ionização Matrix-Assisted Laser da amostra
Nota: Todas as soluções nas etapas a seguir devem ser preparadas com a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)-água de sequenciamento-grau grau ou aminoácido.
<ol><li>Pipete 500 µ l de acetonitrilo para uma resina C18 para ativá-lo. Remova o acetonitrilo usado. Repita este passo 3 vezes.</li>
	<li>Equilibrar a resina C18 com 100 µ l de ácido trifluoroacético de 0,1%. Remova o eluente. Repita este passo 3 vezes.</li>
	<li>Para carregar as amostras, vincule as amostras para a resina com uma pipeta.</li>
	<li>Lave a resina com 20 µ l de ácido trifluoroacético de 0,1%. Repita essa etapa cinco vezes.</li>
	<li>Eluir as amostras com 3 µ l de acetonitrilo 60% em ácido trifluoroacético de 0,1%. Pipete o eluente numa placa de destino por espectrometria de massa MALDI-TOF. Adicione imediatamente a solução ácida (CHCA) α-cyano-4-hidroxicinâmicos saturada em 50% acetonitrila em ácido trifluoroacético de 0,1%.</li>
	<li>Cristalizar a mistura por secagem ao ar.</li>
	<li>
Aquisição de espectros de massa das amostras de acordo com o protocolo do fabricante do instrumento.
	<ol>
<li>Definir manualmente o espectrômetro de massa MALDI-TOF para um positivo refletir de modo.</li>
		<li>Calibrar o espectrômetro de massa usando CHCA, bradicinina fragmento 1-7 (peso molecular de monoisotópico = Da 756.3997) e da angiotensina II (peso molecular de monoisotópico = Da 1,045.5423).</li>
		<li>Adquira os espectros de massa das amostras, prestando atenção aos espectros de massa de 700 a 900 para a forma clivada de substratos biotina-rotulados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifica os picos detectados usando a tabela 1. Deteção do peso molecular adequado indica clivagem no C-terminal do aminoácido relevante.</li>
</ol>

<ol><li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+%28a+review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li>
<li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein%5BTitle%5D)+AND+%22Vopr+Med+Khim%22%5BJournal%5D)">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li>
<li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li>
<li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li>
<li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li>
<li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li>
<li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li>
<li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li>
<li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li>
<li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li>
<li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00897a025">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li>
<li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2%2C4%2C6-trinitrobenzenesulphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li>
<li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+NeutraLite+avidin%3A+A+non-glycosylated%2C+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li>
<li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li>
</ol>

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Este protocolo utiliza a espectrometria de massa MALDI-TOF para identificar a especificidade de protease em amostras brutas derivado de extratos de tecido e facilmente pode ser ampliado para múltiplo processamento de amostra. Em particular, estamos manipulados pH para causar uma mudança na especificidade de substrato.
O método (ABC) complexo avidina-biotina, que tem sido amplamente utilizado em bioquímica devido à sua especificidade de ligação, foi utilizado em nosso protocolo. Devido a forte ...

Proteases regulam processos fisiológicos por clivagem de proteínas, e o início da atividade de protease em horários específicos e locais é regulamentado1. Portanto, é importante identificar a expressão e a atividade dos tecidos que são regulamentados localmente e desenvolver um novo método para detectar proteases. O método proposto neste estudo visa identificar a especificidade da protease em paralelo para detecção de proteases.
Existem alguns métodos para a detecção de especificidade de protease. O método azocasein é conhecido por sua utilização na detecção de proteases2 mas é limitado em sua capacidade de obter mais informações. Zimografia é outro método de deteção de protease abrangente que pode ser usado para determinar o peso molecular de proteases3, mas não pode ser usado para examinar a especificidade de substrato. Especificidade de protease pode ser determinada por ensaios de espectrometria, usando substratos tais como p-nitroanilide4e ensaios fluorométrica, utilizando substratos de cumarina5 ou de ensaios de fluorescência ressonância energia transferência (FRET)6. Estes métodos permitem a detecção de single-especificidade de substratos contidos em um único poço. No presente estudo, a especificidade de protease de extratos de tecido é examinada sob várias condições, como estes extratos contêm várias proteases. Atividade de protease é regulada por vários fatores, incluindo pH, coenzimas, grupos prostético e força iônica. Recentemente, métodos baseados em proteômica têm sido usados para identificar a especificidade da protease; por exemplo, o método relatado por Biniossek et al. 7 usa a proteoma para determinar a especificidade de substrato mesmo em extratos brutos e permite a determinação exata da atividade de proteases que reconhecer várias sequências de aminoácidos8clivagem. No entanto, esse método não é adequado para a análise de várias amostras. Em contraste, o nosso método permite o processamento simultâneo de várias amostras e o uso de Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização tempo-de-voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa para análise de amostra facilita a detecção rápida e fácil do clivada substratos.
Este artigo descreve um método para avaliar a especificidade do protease usando espectrometria de massa MALDI-TOF para medir o peso molecular de substratos exclusivos. As formas moleculares de substratos clivados, juntamente com seus pesos moleculares teóricos, são mostradas na Figura 1 e tabela 1. Estudos anteriores têm utilizados substratos contendo polyglycine espaçadores e biotina9; no entanto, estes substratos são falhos porque a sequência de polyglycine pode ser clivada por enzimas que reconhecem a sequência de glicina. Além disso, a alta afinidade entre avidina e biotina pode levar a uma taxa de recuperação de baixo. Para melhorar estes inconvenientes, neste estudo que nós sintetizado um substrato original, que era composto de polietileno glicol (PEG), iminobiotin e um aminoácido que pode identificar o local de clivagem (Figura 1). Para discriminar entre aminoácidos de peso moleculares similares, D-serina foi adicionado entre o espaçador de PEG e o aminoácido no site entalhado.
O N-terminal do substrato foi rotulado com iminobiotin, que permite a purificação da afinidade de amostras brutas. O uso de iminobiotin em vez de biotina é crítico; Biotina tem uma forte afinidade com avidina, que resulta em taxas de baixa recuperação de substratos de biotina-rotulado de resina avidin, enquanto a afinidade do iminobiotin para avidin pode ser alterada por pH. Iminobiotin-rotulado substratos irão ligar para avidin nas condições acima pH 9, enquanto avidin libera substratos iminobiotin-etiquetadas em condições abaixo de pH 4. Portanto, iminobiotin foi usado para purificação de afinidade10. Em resumo, nós descrevemos um protocolo detalhado para a detecção de especificidade de protease usando substratos exclusivos.

<table><tbody><tr><td>Resina Fmoc-NH-SAL (- [2,4-Dimetoxifenil-N- (9-fluorenilmetoxicarbonil) aminometil]fenoxi resina)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00102</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimetilformamida (DMF)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00185</td><td></td></tr><tr><td>piperidina</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00176</td><td></td></tr><tr><td>ácido trinitrobenzenossulfônico (TNBS)</td> <td>WAKO Chemical</td><td>209-1483</td><td></td></tr><tr><td>O- (6-Cloro-1H-benzotriazol-1-il) -N, N, N ', N'-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HCTU)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00067</td><td></td></tr><tr><td>1-Hidroxi-1H-benzotriazol, monohidrato (HOBt)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00014</td><td></td></tr><tr><td>diisopropiletilamina (DIPEA)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00030</td><td></td></tr><tr><td>triisopropilsilano (TIS)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00170</td><td></td></tr><tr><td>ethanedithiol (EDT)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00057</td><td></td></tr><tr><td>ácido trifluoroacético (TFA)</td> <td>Millipore</td><td>S6612278 403</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrila</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2153025</td><td></td></tr><tr><td>coluna de cartucho C18</td><td>Águas</td><td>WAT051910</td><td></td></tr><tr><td>éter octilfenílico de poli (oxietileno)</td><td>WAKO Chemical</td><td>168-11805</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>homogeneizador de mistura</td><td>Kinematica</td><td>PT3100</td><td>Homogeneizador Polytron</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250</td><td>Nakarai Chemical</td><td>094-09</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Nakarai Chemical</td><td>170-18</td><td></td></tr><tr><td>N-tosil-L-fenilalanina clorometilcetona (TPCK)-tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>WAKO Chemical</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>estreptavidina sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td>17-511-01</td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-ciano-4-hidroxicinâmico ácido (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2020</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF espectrometria de massa</td><td>Bruker Daltonics, Alemanha</td><td>autoflex</td><td></td></tr><tr><td>2-iminobiotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4632</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-aminoácidos</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a determinação da especificidade da protease no mouse tecido extrai por espectrometria de massa maldi-tof: manipulando o ph para causar alterações de especificidade

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases têm várias funções biológicas, incluindo a digestão de alimentos e ativação/inativação de proteínas. Identificar a especificidade da protease é importante por revelar a função de protease. O método proposto neste estudo determina a especificidade de protease medindo-se o peso molecular de substratos exclusivos usando Matrix-assisted Laser dessorção/ionização de espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF). Os substratos contêm iminobiotin, enquanto o site clivado consiste de aminoácidos, e o espaçador é composto por polietileno glicol. O substrato clivado irá gerar um único peso molecular, usando um ácido aminado clivado. Um dos méritos desse método é que pode ser efectuada em uma panela, usando amostras brutas, e é também adequado para avaliar várias amostras. Neste artigo, descrevemos um método experimental simples otimizado com amostras extraídas do tecido do pulmão do rato, incluindo a extracção de tecido, colocação de substratos digestivos em amostras, purificação de substratos digestivos sob condições de pH diferente e medição de peso molecular dos substratos, utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF. Em resumo, esta técnica permite a identificação da especificidade da protease em amostras brutas derivado de extratos de tecido usando espectrometria de massa MALDI-TOF, que facilmente pode ser ampliada para múltiplo processamento de amostra.

Avaliação do método para a identificação da especificidade de protease por protease modelo
A eficiência deste sistema foi avaliada usando TPCK-tripsina e protease V8, cujas especificidades do substrato foram obtidas. TPCK-tripsina e protease V8 foram estimados para clivar a sequência de aminoácidos no C-terminal dos resíduos lisina e arginina e no lado de carboxila do ácido aspártico e ácido glutâmico resíduos, respectivamente. <st...

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a especificidade da protease no tecido cru rato extratos usando espectrometria de MALDI-TOF.

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

O objetivo geral deste experimento é determinar a especificidade da protease em vários extratos brutos. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave para determinar a especificidade da protease. A principal vantagem desta técnica é que ela pode identificar a especificidade da protease de várias amostras em parlay.Amostras de tecido pulmonar frio obtidas de camundongos ICR machos em gelo. Homogeneizar as amostras a 20.000 RMP por 30 segundos no liquidificador. Repita esta etapa até que as amostras estejam completamente homogêneas.Não homogeneizar por mais de um minuto continuamente para evitar o aumento da temperatura. Transfira 1.000 microlitros do homogeneizado para um tubo de 1,5 mililitro e centrifugue por cinco minutos a 10.000 vezes G a quatro graus Celsius. Transfira 500 microlitros do sobrenadante para um novo tubo de plástico de 1,5 mililitro.Use 10 microlitros da amostra para determinar a concentração de proteína. Usando métodos, como o ensaio de ácido bicinconínico ou o ensaio de Bradford. Para evitar o congelamento, adicione 80% de glicerol às amostras para uma concentração final de 50% de glicerol.Para esclarecer a diferença na especificidade da protease depend

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Bioquímica

Compostos de captura são trifuncional pequenas moléculas para reduzir a complexidade do proteoma por funcionais reversíveis interação molécula de proteína pequena seguido por foto-reticulação e purificação. Aqui usamos um Composto de captura...

Perfil de metiltransferases e Outros S-Adenosil- L Homocisteína-Proteínas de Ligação de captura por Espectrometria de Massa Compound (CCMS)

O onipresente segundo mensageiro c-di-GMP controla o crescimento e o comportamento de muitas bactérias. Desenvolvemos uma nova tecnologia baseada em espectrometria de massa composta de captura para identificar e caracterizar bioquimicamente as proteínas de ligação c-di-GMP em praticamente qualquer espécie bacteriana.

Captura de Espectrometria de Massa Compound - uma ferramenta poderosa para identificar novos c-di-GMP efetoras Proteínas

As matrizes de peptídeos sintetizadas pelo método SPOT podem ser usadas para analisar a especificidade do substrato das proteínas lisina metiltransferases (PKMTs) e para definir o espectro de substrato das PKMTs para entender seu papel biológico. Este protocolo descreve como sintetizar matrizes de peptídeos, metilá-las com PKMTs e analisar os resultados.

Especificidade Análise de Proteína Lisina Metiltransferases Usando SPOT Peptide Arrays

Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar polysome de criação de perfil em coração isolado de rato perfundido. Nós descrevemos os métodos para análise das frações no que diz respeito a mRNAs, miRNAs e o proteome polysome polysome, polysome de criação de perfil e perfusão do coração.

Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Este fluxo de trabalho descreve o desempenho do enriquecimento tempo e econômico de múltiplas modificações pós-translacionais de proteínas (PTMs) simultaneamente para análise proteômica global quantitativa. O protocolo utiliza o enriquecimento ptm em nível de peptídeo com múltiplos anticorpos conjugados, seguido pela análise de espectrometria de aquisição independente de dados para obter insights biológicos sobre o crosstalk PTM.

Enriquecimento de afinidade simultânea de duas modificações pós-translacionais para quantificação e localização do site

Este protocolo abrange uma análise detalhada da composição de peptidoglicanos usando cromatografia líquida, espectrometria de massas acoplada com extração avançada de recursos e software de análise bioinformática.

Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

Este protocolo descreve como realizar a marcação de proteína específica do tipo celular com azidonorleucina (ANL) usando uma linha de camundongo expressando uma L274G-Metionina tRNA sintetase mutante (MetRS*) e as etapas necessárias para o isolamento de proteínas específicas do tipo celular marcadas. Delineamos duas possíveis vias de administração de ANL em camundongos vivos por (1) água potável e (2) injeções intraperitoneais.

Purificação e identificação de proteínas específicas do tipo celular de tecidos complexos usando uma linha de camundongo mutante de metionina tRNA sintetase

Aqui, apresentamos um protocolo para o enriquecimento de fosfatrofames fosfoproteínas e suas proteínas interativas a partir de células e tecidos e sua identificação e quantificação por proteômica baseada em espectrometria de massa.

Uma abordagem baseada em espectrometria de massa para identificar fosfofamina fosfates e seus interacttores

Apresentamos um protocolo para identificação e quantificação dos componentes em misturas de espécies que possuem proteínas semelhantes. A espectrometria de massa detecta peptídeos para identificação e fornece quantificação relativa por proporções de áreas de pico. Como alimento de ferramenta para detecção de fraudes, o método pode detectar 1% de cavalo na carne bovina.

Determinação das espécies e quantificação de misturas utilizando MRM Espectrometria de Massa de peptídeos Aplicada à autenticação Meat

Aprenda a determinar a especificidade de proteases em extratos brutos de tecido de pulmão de camundongos ICR usando espectrometria de massa MALDI-TOF. Este protocolo permite analisar múltiplas amostras simultaneamente.

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A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

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