A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

O objetivo geral deste experimento é determinar a especificidade da protease em vários extratos brutos. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave para determinar a especificidade da protease. A principal vantagem desta técnica é que ela pode identificar a especificidade da protease de várias amostras em parlay.

Amostras de tecido pulmonar frio obtidas de camundongos ICR machos em gelo. Homogeneizar as amostras a 20.000 RMP por 30 segundos no liquidificador. Repita esta etapa até que as amostras estejam completamente homogêneas.

Não homogeneizar por mais de um minuto continuamente para evitar o aumento da temperatura. Transfira 1.000 microlitros do homogeneizado para um tubo de 1,5 mililitro e centrifugue por cinco minutos a 10.000 vezes G a quatro graus Celsius. Transfira 500 microlitros do sobrenadante para um novo tubo de plástico de 1,5 mililitro.

Use 10 microlitros da amostra para determinar a concentração de proteína. Usando métodos, como o ensaio de ácido bicinconínico ou o ensaio de Bradford. Para evitar o congelamento, adicione 80% de glicerol às amostras para uma concentração final de 50% de glicerol.

Para esclarecer a diferença na especificidade da protease dependendo do pH, use tampões de digestão ajustados para pH três, cinco, sete e nove. Em 890 microlitros de um tampão de digestão, adicione 10 microlitros de 0,1 micrograma por microlitro ou tripsina TPCK, 0,1 micrograma por microlitro de protease V8 de staphylococcus aureus ou 10 microgramas por microlitro de extratos de tecido. Preparar os controlos negativos inactivando a protease nos extractos teciduais por incubação e água a ferver durante 10 minutos.

Em seguida, adicione 10 microlitros de substratos de rótulo de biotina MNO às amostras e incube por três horas a 37 graus Celsius para digerir. Após a incubação, interrompa a digestão dos substratos com água fervente por 10 minutos. Centrifugue os substratos digeridos por cinco minutos a 10.000 vezes G a quatro graus Celsius.

Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitros. Adicione 50 mililitros de grânulos de sepharose de estreptavidina a 50% em um tampão tris molar, contendo 0,1% de éter octilfenílico de polioxietileno. Use papel de teste de pH para garantir que a solução esteja em torno de pH nove.

É importante ajustar o pH adequado para nove ou mais. A aminobiotina não pode morder uma morder uma pérola, a menos que tenha pH nove ou superior. Se o pH da solução estiver baixo, ajuste-o para aproximadamente pH nove adicionando mais tampão.

Além disso, um tampão tris molar pode ser adicionado para aumentar o pH, se necessário. Incube a suspensão durante a noite a quatro graus Celsius com mistura suave contínua em uma roda rotadora para ligar os substratos marcados com biotina MNO à estreptavidina. As esferas devem permanecer suspensas durante toda a incubação.

No dia seguinte, centrifugue as amostras durante um minuto a 10 000 vezes G a quatro graus Celsius. Depois de remover o sobrenadante, lave as contas adicionando 1.000 microlitros de um tampão de lavagem. Em seguida, incube por 10 minutos a quatro graus Celsius com mistura suave contínua em um rotador.

Centrifugue os grânulos por um minuto a 10.000 vezes G a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e repita esta lavagem quatro vezes. Em seguida, adicione 100 microlitros de ácido trifluoroacético a 0,2% às contas.

Use papel de teste de pH para garantir que a solução esteja abaixo do pH dois. Se o pH da solução for alto, ajuste o pH para menos de dois adicionando ácido trifluoroacético a 1%. Incube a suspensão por 30 minutos em temperatura ambiente com mistura suave contínua em uma roda rotadora.

Depois de centrifugar as esferas como antes, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitros. Pipetar 20 microlitros de acetonitrila em uma resina C18 para ativá-la. Remova a acetonitrila usada e repita esta etapa de ativação três vezes.

Em seguida, equilibre a resina C18 com 20 microlitros de ácido trifluoroacético a 0,1%. Retirar o eluente e repetir este passo de equilíbrio três vezes. Para carregar as amostras, ligue-as à resina usando uma pipeta.

Lave a resina com 20 microlitros de ácido trifluoroacético a 0,1%. Repita esta etapa cinco vezes. Eluir as amostras com três microlitros de acetonitrila a 60% em ácido trifluoroacético a 0,1%.

Pipetar o eluente em uma placa-alvo para espectrometria de massa MALDI-TOF. Adicione imediatamente a solução de CHCA, saturada em 50% de acetonitrila em ácido trifluoroacético a 0,1%. Cristalize a mistura por secagem ao ar.

Adquirir espectros de massa de amostras, de acordo com o protocolo do fabricante do instrumento, prestando muita atenção aos espectros de massa de 700 a 900 daltons para a forma clivada dos substratos dos rótulos de biotina. Espectros de massa de substratos sintéticos são mostrados aqui. Picos correspondentes ao peso molecular do precursor foram detectados entre 850 e 1.050.

Os fragmentos clivados são detectados na faixa de 700 a 850. Aqui são mostrados os espectros para substratos marcados com biotina MNO tratados com tripsina TPCK. Os picos de 839,81 dalton e 796,76 dalton correspondem aos fragmentos clivados do terminal C de lisina e arginina, respectivamente.

Aqui são mostrados os espectros de massa de substratos sintéticos digeridos com protease V8. Os picos de 769,78 dalton e 755,62 dalton correspondem aos fragmentos clivados do terminal C do ácido glutâmico e do ácido aspártico, respectivamente. Os espectros para substratos de marcadores de biotina MNO tratados com um extrato de tecido pulmonar em várias condições de pH são mostrados aqui.

Na condição ácida, em pH cinco, o peso molecular de um fragmento clivado foi de 770,13 daltons e 826,66 daltons, indicando clivagem no terminal C do ácido glutâmico e triptofano. Na condição neutra e básica, em pH sete e nove, o peso molecular de um fragmento clivado foi aumentado no pico de 767 daltons e 840 daltons, indicando clivado no terminal C de arginina e lisina. Por outro lado, os picos do ácido glutâmico e do triptofano diminuíram.

Além disso, este método não pode detectar fragmentos clivados com extratos inativados. Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em dois dias se for realizada corretamente, exceto para a síntese de substrato. Além disso, uma vez que o substrato é sintetizado, ele pode ser medido em várias amostras. Por que?

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de operar no pH tampão, cerca de nove. Geralmente, a reação do complexo avidina amino biotina. Após este procedimento, é possível quantificar a atividade enzimática realizando um CMS.

Este método permitirá que os pesquisadores no campo da protease abram caminho para explorar a expressão da protease em várias condições.