Name: Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprenda a modificar células-tronco hematopoiéticas CD133+ usando transfecção não viral baseada em políplexos magnéticos. Este método seguro permite engenharia genética temporária com monitoramento por ressonância magnética em medicina regenerativa.

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Este trabalho foi financiado pelo Ministério Federal da educação e pesquisa Alemanha (FKZ 0312138A e FKZ 316159), o estado Mecklemburgo-Pomerânia Ocidental com fundos estruturais (FSE/IVWM-B34-0030/10 e FSE/IVBM-B35-0010/12) e a DFG (DA1296/2-1), o Fundação coração alemão (F/01/12), o BMBF (VIP + 00240) e a Fundação úmida. Além disso, F.H. e P.M. são suportados pelo Forum programa de Rostock University centro médico (889001).

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Nos últimos anos, CD133+ SCs surgiram como uma população celular promissor para terapias baseadas em SC, como evidenciado por vários fase I, II e III ensaios clínicos43,44,,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 ,</...

CD133+ SCs representam uma população de célula de tronco e progenitoras heterogénea com promissor potencial para a medicina regenerativa. Sua diferenciação hematopoiéticas, endoteliais e miogênico potencial1,2,3 permite o CD133+ células, por exemplo, contribuir para processos de neovascularização através da modulação em recém formando vasos e ativação de pro-angiogênico sinalização parácrina mecanismos4,5,6,7.
Apesar de seu alto potencial demonstrado em ensaios clínicos aprovados mais de 30 (ClinicalTrails.gov), seu resultado terapêutico é ainda sob polêmica discussão4. Na verdade, uma aplicação clínica de SCs é dificultada pela baixa retenção no órgão de interesse e enorme pilha inicial morte5,8,9. Produção adicional de CD133+ transplante prévio de SCs ajudasse a superar esses desafios.
Um pré-requisito para uma terapia celular eficiente seria a redução da morte maciça de pilha inicial para melhorar a enxertia de células relevantes terapêutico10. Estudos atuais demonstraram uma perda imensa pilha de 90 – 99% em órgãos altamente perfundidos, como o cérebro e o coração durante as primeiras horas de 1 – 2, independente do tipo de células transplantadas ou aplicativo rota11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC rotulagem usando nanopartículas magnéticas (MNPs) permite uma estratégia inovadora de não-invasivo para células-alvo para o site de interesse22,23,24,25,26 e simultaneamente permite que a célula de monitoramento usando MRI27 e partícula magnética (MPI) de imagem. O mais eficiente na vivo estudos aplicando magnetizada célula alvo de retenção célula usada após a administração local, em detrimento da orientação celular após injeção intravenosa23,24,28 . Portanto, o nosso grupo projetado um sistema de entrega consiste de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético29. Com esta técnica, CD133+ SCs e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) com eficiência poderiam ser alvo, como demonstrado em vitro tentativas de30,31.
Um outro obstáculo para terapias de SC é o ambiente hostil e inflamatório do tecido afetado após o transplante, o que contribui para a morte de pilha inicial32. Além de vários estudos de pré-condicionamento, a aplicação de terapêuticas miRs relevantes foi testado33; foi com sucesso demonstrado que anti-apoptotic miRs inibem a apoptose em vitro e realçam a enxertia de celular na vivo33. Estas pequenas moléculas, compostas por 20-25 nucleotides, desempenham um papel crucial como moduladores posttranscriptional de RNA mensageiro (mRNAs) e, portanto, afetam células estaminais destino e comportamento34. Além disso, a introdução exógena de miRs evitar a integração estável indesejada para o anfitrião do genoma34.
Atuais tentativas para introdução eficiente de ácidos nucleicos (NAs) em SCs primárias baseiam-se principalmente a vírus recombinante8,35. Apesar da eficiência elevada do transfection, manipulação de vírus recombinante apresenta um grande obstáculo para uma tradução de banco-de-cabeceira, por exemplo, expressão gênica incontrolável, patogenicidade, imunogenicidade e mutagênese insercional35 ,36. Portanto, sistemas de entrega não-virais como construções baseadas em polímero são fundamentais para desenvolver. Entre esses, o polyethylenimine (PEI) representa um veículo de entrega válido, oferecendo benefícios para miRs como condensação de ND para proteger da degradação, absorção celular, e liberação intracelular através de CDDP escapar37,38. Além disso, complexos de miR-PEI demonstraram uma alta biocompatibilidade em ensaios clínicos39. Portanto, nosso sistema de entrega consiste de um biotinilado ramificada 25 kDa PEI acoplado a um streptavidin-revestido MNP-núcleo30,31,40.
Neste manuscrito, apresentamos um protocolo abrangente descrevendo (i) o isolamento manual de CD133+ SC de doação de medula óssea humana (BM) com uma caracterização detalhada do produto SC e (ii) uma estratégia de transfeccao eficiente e suave de um sistema baseado em polímero magneticamente não-virais entrega por engenharia genética de CD133+ SCs usando miRs. CD133+ SCs são isoladas e magneticamente enriquecido de humanos aspirados BM esternais, usando uma superfície baseado em anticorpos magnético-ativado da pilha classificação sistema (MACS). Depois disso, a viabilidade celular, bem como a pureza de célula é analisada usando citometria de fluxo. Posteriormente, miR/PEI/MNP complexos são preparados e CD133+ SCs são transfectadas. 18 h após a transfeccao, a eficiência de absorção e o impacto do transfection na viabilidade de expressão e célula de marcador de SC são analisados. Além disso, avaliação da distribuição dos compostos complexos transfeccao intracelular é executada usando rotulagem quatro cores e iluminação estruturada microscopia (SIM).

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético com Azul de Metileno</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td>3%</td></tr><tr><td>anti-CD133/2-PE (clone: 293C3)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34-FITC (clone: AC136)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-081-001</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>560178</tr><tr><td>corante de rodamina; Atto 565 corante conjugado à biotina</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CD133 partículas superparamagnéticas de ferro dextrano ligadas a anticorpos; CD133 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-049</td><td></td></tr><tr><td>colagenase B</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>câmara de contagem</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cianina 3 corante marcado como precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Controle Negativo #1</td><td>Ambion</td><td>AM17120</td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 5 kit de rotulagem de corante miR; Kit de rotulagem de miRNA de TI de etiqueta de corante Cy5</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10104159001</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 microscópio confocal</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR Reagente de bloqueio, humano</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>kit de rotulagem de proteína verde brilhante; Kit de Rotulagem de Proteínas Oregon Green 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O10241</td><td></td></tr><tr><td>meio de montagem aquoso; Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrifugação de gradiente de densidade; Tubo de Centrífuga Leukosep</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89048-932</td><td></td></tr><tr><td>Suporte magnético MACS; MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de pré-separação MACS</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td>30 &micro; m</td></tr><tr><td>Coluna de separação MACS (MS / LS)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-201 / 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Ímã permanente MACS; Separador MACS</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDF Filtro</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0,45 &mu; m</td></tr><tr><td>camundongo IgG 2b-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-215</td><td></td></tr><tr><td>corante reativo de amina; Kit de Coloração de Células Mortas Corrigíveis Near-IR LIVE/DEAD</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>meio de separação de linfócitos humanos; Pancoll</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-60500</td><td>densidade: 1,077 g/mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-53500</td><td>sem Ca e Mg</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>408727</td><td>ramificado; 25 kDa</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Schuchardt OHG</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>precursor miR não marcado; Controle Negativo do Precursor de miRNA Pré-miR #1</td><td>Tampão</td> de lise de hemácias <td>Ambion AM17110</td><td></td></tr><tr><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Solução de descontaminação de RNAse; RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>meio linfócito humano; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>suplemento de citocina humana recombinante; StemSpan CC100</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>meio de expansão de células hematopoiéticas sem soro; StemSpan H3000</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9800</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidin MagneSphere Partículas Paramagnéticas</td><td>Promega Corporation</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Solução Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>T8154</td><td>0,4 %</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>0,5 M; pH 8,0</td></tr><tr><td>ZEN2011 software</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Espectrofotômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonorex RK 100 SH sonicação banho-maria</td><td>Bandelin eletrônico</td><td></td><td>Ultrassônico saída nominal: 80 W; Frequência ultrassônica: 35 kHz</td></tr></tbody></table>

protocolo para transferência de microrna na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Enquanto CD133+ células-tronco hematopoiéticas (SCs) tem sido comprovadas para fornecer alto potencial no campo da medicina regenerativa, suas taxas de retenção baixa após a injeção em tecidos feridos, bem como as taxas de mortalidade observadas células maciça levam a muito restrito de efeitos terapêuticos. Para superar essas limitações, nós procurou estabelecer um protocolo baseado em não-viral para engenharia celular adequada antes da sua administração. A modificação de CD133 humana+ expressar SCs usando os polyplexes magnético microRNA (miR) carregado foi abordada em relação a eficiência de absorção e de segurança, bem como o alvo potencial das células. Confiando em nosso protocolo, podemos conseguir taxas de absorção alta miR de 80-90%, enquanto o CD133+ Propriedades de células-tronco permanecem inalteradas. Além disso, essas células modificadas oferecem a opção de segmentação magnético. Descrevemos aqui um procedimento seguro e altamente eficiente para a modificação de CD133+ SCs. Esperamos que esta abordagem para fornecer uma tecnologia padrão para otimização dos efeitos terapêuticos de células estaminais e para acompanhamento do produto celular administrado através de ressonância magnética (MRI).

O protocolo apresentado descreve um isolamento manual e magnético enriquecimento do humano BM-derivado CD133+ SCs com uma célula independente de vírus subsequentes engenharia estratégia, como uma tecnologia não-invasiva para manipulação de células em vitro e em vivo ferramenta de monitoramento.
Esta tecnologia de isolamento de três etapas permite uma separação de multinacionais de BM esternal pré-dig...

Este protocolo ilustra um procedimento seguro e eficiente para modificar CD133+ células-tronco hematopoiéticas. A apresentado não-virais, magnética polyplex abordagem pode fornecer uma base para a otimização dos efeitos terapêuticos células-tronco, bem como acompanhamento do produto celular administrado via ressonância magnética.

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Nosso protocolo pode responder a questões-chave no campo da medicina regenerativa, como se as células podem ser melhoradas para as propriedades benéficas, bem como se elas podem ser direcionadas para o local de interesse. Uma das principais vantagens do nosso protocolo é o fato de que as células podem ser transitoriamente modificadas geneticamente usando nosso método de transfecção não viral, retendo assim as propriedades das células. O método de Sauter pode fornecer informações sobre a modificação de células-tronco hematopoiéticas que podem ser aplicadas a outros tipos de células usadas para transplante, como células-tronco mesenquimais.Para iniciar o protocolo, pré-aqueça o meio dos linfócitos humanos à temperatura ambiente e descongele a colagenase B e a DNase. Colete a medula óssea, ou BM, em um tubo cônico de 50 mililitros. Descarte todos os coágulos existentes.Colher uma amostra de MO de 200 microlitros para análise citométrica de fluxo subsequente. Armazene a amostra a quatro graus Celsius até que seja necessário. Em seguida, transfira dez mililitros de BM para um novo tubo cônico de 50 mililitros e adicione seis mililitros de PBS EDTA, 20 mililitros de meio linfócito humano

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Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

A entrega celular direcionada é útil em uma variedade de aplicações biomédicas.  O objetivo deste protocolo é usar nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPION) para rotular células e, assim, permitir abordagens de direcionamento de células magnéticas para um alto grau de controle sobre a entrega e localização celular.

Rotulagem celular e Segmentação com nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas

Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Este manuscrito descreve a entrega eficiente, não-viral de miR a células endoteliais por um vector de PEI / MNP e a sua magnetização. Assim, em adição à modificação genética, esta abordagem permite a orientação celular magnética e ressonância magnética detectabilidade. A técnica pode ser usada para melhorar as características de produtos de células terapêuticas.

preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de magnetizado miR-modificado Células Endoteliais

Este protocolo descreve a transiente engenharia genética de células-tronco dentárias extraídas do folículo dental humano. A estratégia de modificação não-virais aplicada pode tornar-se uma base para a melhoria dos produtos terapêuticos células-tronco.

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

Nós descrevemos o uso do transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) para avaliar o potencial maligno das células hematopoiéticas geneticamente modificados. TCTH é útil para avaliar várias células hematopoiéticas malignas na vivo , bem como gerar uma grande coorte de ratos com Síndromes Mielodisplásicas (MDS) ou leucemia para avaliar novas terapias.

Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

O objetivo do presente protocolo é isolar os primatas não-humanos CD34+ células de medula aprontada, gene-modificar estas células com vetores Lentivirus e preparar um produto para infusão no hospedeiro autólogo. O comprimento total do protocolo é aproximadamente 48 h.

Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

O presente protocolo descreve um procedimento de cultura otimizado de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) para o enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.

Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica

Este protocolo descreve o procedimento de edição do genoma em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos usando complexos ribonucleoprotéicos Cas9-sgRNA montados in vitro e liberados por eletroporação.

Ruptura Gênica de Alta Eficiência em Macrófagos Primários Derivados da Medula Óssea Usando Complexos Eletroporados Cas9-sgRNA

Este protocolo descreve a injeção intrafemoral de algumas células-tronco hematopoiéticas ou leucêmicas, incluindo células editadas por genes, em modelos de xenoenxerto murino, o que permitirá não apenas o transplante rápido e seguro de células, mas também análises seriadas da medula óssea.

Injeções intrafemorais simplificadas usando camundongos vivos permitem análise contínua da medula óssea

Aprenda a modificar células-tronco hematopoiéticas CD133+ usando transfecção não viral baseada em políplexos magnéticos. Este método seguro permite engenharia genética temporária com monitoramento por ressonância magnética em medicina regenerativa.

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético (Vídeo) | JoVE Journal

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

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