Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas
5 de setembro de 2018
Uma grande variedade de indicações de doença, modelos mais fisiologicamente relevantes estão sendo programas de descoberta de drogas desenvolvida e implementada em. O novo sistema de modelo aqui descrito demonstra como tridimensional tumor esferoides podem ser cultivadas e exibidos em um sistema de baseado em placa de 1536-bem elevado-throughput para pesquisar novas drogas de Oncologia.
Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da descoberta de medicamentos, como qual é a configuração de cultura de tecidos mais relevante para a identificação de acerto para eletrodo. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a cultura de células em três dimensões, de forma de alto rendimento, usando 1536 placas de poço. Demonstrando este protocolo estará Kalyani Gampa, uma cientista sênior do meu laboratório.
Para configurar uma cultura esferóide tumoral 3D, separe as linhas de células cancerígenas de interesse com três lavagens de BBS. Seguido pela adição de um mililitro de tripsina por área de cinco centímetros quadrados de frasco de cultura. Após cinco minutos, neutralizar a tripsina com cinco vezes o volume de soro suplementado em cada frasco e contar as células.
Use um pequeno esterilizado com ponta de aço inoxidável com um sistema baseado em bomba peristáltica para semear um total de 500 células em oito microlitros de meio esferóide em cada poço de uma placa tratada com cultura de tecidos de 1.536 poços. Em seguida, use um selo de placa adesiva respirável para cobrir a placa. E coloque a placa em uma incubadora giratória ajustada a 37 graus Celsius e 10 rpm com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade relativa por três dias.
A etapa mais crítica é garantir que as placas estejam bem vedadas antes de serem colocadas na incubadora. Os esferóides precisarão de três dias para se formar e esta etapa evita a evaporação do meio. No final da incubação, gire rapidamente as placas de cultura revestidas com câncer a 100 vezes a gravidade para coletar qualquer condensação e remova os selos adesivos.
Coloque cada placa a ser tratada em um dispensador acústico configurado para fornecer um total de oito nanolitros de cada composto. Diluição para uma concentração final de 0,1% de DMSO por poço e uma dose composta máxima de 10 micromolares. Quando o composto tiver sido adicionado às placas apropriadas, coloque uma tampa de cultura de células de aço inoxidável feita sob medida em cada placa para evitar a evaporação e devolva as placas à incubadora giratória por mais cinco dias.
No final da incubação, adicione três microlitros de reagente de lise celular pré-aquecido, suplementado com luciferina em cada poço de cada placa de cultura celular. E incube as placas em temperatura ambiente por pelo menos 15 minutos. Em seguida, capture a luminescência de ATP em um luminômetro de placa.
Quando todas as placas tiverem sido analisadas, extraia os dados brutos do instrumento e normalize todos os campos que contêm os compostos de teste para a média de todos os poços contendo apenas DMSO como controle neutro. A porcentagem de inibição do crescimento de cada composto pode então ser calculada de acordo com a fórmula, e curvas de resposta à dose e IC50s inibitórios podem ser gerados. Uma variedade de células cancerígenas estabelecidas conhecidas por crescerem bem em condições de cultura 2D também formaram estruturas 3D quando cultivadas, como acabamos de demonstrar, apesar de suas diferenças morfológicas.
Quando usado para triagem em larga escala, pode-se observar a sensibilidade diferencial do composto entre as culturas cultivadas em 2D versus aquelas cultivadas em 3D. Com cada ponto representando a concentração inibitória de um único composto para o qual uma resposta de morte celular de 50% é observada em ambos os ambientes de cultura. Neste experimento representativo, ambos os compostos inibidores da RAF quinase testados foram mais potentes em condições 3D em uma cultura de linha de câncer de pulmão de células não pequenas que abriga uma mutação ativadora na proteína KRAS.
No entanto, os compostos demonstram uma potência semelhante em culturas de linha de câncer de cólon esferóide 3D e 2D que contêm uma mutação ativadora de G13D em KRAS. O ensaio 3D também permite a observação do fenômeno paradoxal de ativação do crescimento, que ocorre quando há uma inibição incompleta dos dímeros RAF em linhagens mutantes RAFs altamente ativadas, como evidenciado pelo crescimento celular em baixas concentrações da droga, que é reprimida em altas concentrações. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da descoberta de medicamentos contra o câncer explorarem condições alternativas de cultura para identificar matéria química nova e eficaz contra alvos conhecidos.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo apresenta um método inovador para a descoberta de fármacos utilizando esferoides tumorais tridimensionais cultivados em um sistema de placas de 1536 poços de alto rendimento. Esta abordagem tem como objetivo aumentar a relevância dos ambientes de cultura de tecidos na identificação de potenciais medicamentos oncológicos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Oncologia
- Descoberta de Fármacos
- Técnicas de Cultura Celular
Antecedentes
- Culturas celulares tradicionais bidimensionais frequentemente não conseguem imitar o microambiente tumoral.
- Culturas tridimensionais fornecem um modelo fisiologicamente mais relevante para o estudo do câncer.
- A triagem de alto rendimento é essencial para a descoberta eficiente de fármacos.
- Este estudo concentra-se na otimização do cultivo de esferoides tumorais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método de alto rendimento para o cultivo de esferoides tumorais.
- Avaliar a relevância desse modelo na descoberta de fármacos.
- Facilitar a identificação de novos medicamentos para oncologia.
Métodos Utilizados
- Desprendimento de linhagens celulares tumorais utilizando lavagens com BBS.
- Uso de tripsina para desanexação celular e neutralização com meio suplementado com soro.
- Cultivo de células em formato de placa de 1536 poços.
- Triagem de candidatos potenciais a fármacos de maneira de alto rendimento.
Resultados Principais
- O método permite o cultivo eficiente de esferoides tumorais tridimensionais.
- As capacidades de alto rendimento permitem triagem rápida de candidatos a fármacos.
- Relevância demonstrada do modelo de cultivo tridimensional na descoberta de fármacos.
- Potencial para melhorar o processo de identificação de acertos para liderança.
Conclusões
- Este método de cultivo de esferoides tumorais tridimensionais aprimora os esforços de descoberta de fármacos.
- Ele fornece uma representação mais precisa da biologia tumoral.
- A abordagem pode levar à identificação de novas terapias oncológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método aborda a lacuna translacional na descoberta de fármacos oncológicos ao permitir triagem em alta produtividade em um modelo de esferoides tumorais tridimensionais fisiologicamente relevante. Ele aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao revelar respostas diferenciais aos fármacos entre condições de cultivo bidimensionais e tridimensionais. A abordagem aprimora a identificação de compostos ativos promissores para inibidores da via MAPK em modelos de câncer geneticamente definidos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em um sistema relevante para a doença que capta interações celulares tridimensionais e organização espacial.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao comparar a eficácia de compostos em culturas 2D versus 3D para identificar atividade dependente do contexto.
- Valor Preditivo: Facilita a identificação de compostos líderes ao detectar sensibilidade diferencial em modelos de câncer de pulmão não microcítico com mutação em KRAS sob condições tridimensionais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Fornece um sistema padronizado e reprodutível de cultivo 3D compatível com formatos de 1536 poços para triagem em larga escala de compostos.
- Valor Operacional: Permite leituras quantitativas de luminiscência baseadas em ATP para medir a inibição do crescimento e gerar curvas de dose-resposta e valores de IC50.
- Prontidão do Ensaio: Utiliza dispensação acústica para entrega precisa de compostos em nanolitros e incubação selada para prevenir evaporação, garantindo a integridade do ensaio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas e fluxos de trabalho pré-clínicos ao modelar interações entre tumor e estroma e condições semelhantes à matriz extracelular em um formato escalonável.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a observação da ativação paradoxal do crescimento em mutantes do dímero RAF, orientando estratégias de terapia combinada e reduzindo riscos em candidatos clínicos.
- Alinhamento de Biomarcadores: Permite a avaliação de inibidores específicos de vias (por exemplo, MAPK) em contextos geneticamente definidos para correlacionar genótipo com resposta ao fármaco.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, permitindo a avaliação precoce da eficácia de compostos em um contexto fisiologicamente mais relevante, antes do investimento pré-clínico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao revelar como o cultivo tridimensional altera a sensibilidade a fármacos em modelos impulsionados por oncogenes, como o NSCLC com mutação em KRAS.
- Triagem: Oferece prontidão e reprodutibilidade do ensaio por meio da formação padronizada de esferoides em placas de 1536 poços, com protocolos controlados de incubação e vedação.
- Análises: Permite a medição quantitativa de variáveis dependentes por meio da normalização da luminiscência de ATP aos controles de DMSO, facilitando o cálculo do IC50 e a análise comparativa de potência.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar a arquitetura espacial do tumor e as interações clonais ausentes em sistemas bidimensionais.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem de diversas linhagens celulares de câncer e bibliotecas de compostos que visam vias conservadas, como a MAPK.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio da comparação direta das respostas a fármacos em 2D e 3D.
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de fluxos de trabalho em placas de 1536 poços compatíveis com robótica e incubação selada.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper ao identificar compostos com atividade específica ao contexto, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos promissores com base na eficácia diferencial em modelos fisiologicamente relevantes.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em técnicas de cultivo celular tridimensional, incluindo neutralização da tripsina, contagem de células e semeadura asséptica.
- Depende de instrumentação como sistemas baseados em bombas peristálticas com cartuchos, dispensadores acústicos, incubadoras rotativas e luminômetros de placa.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de vedação, parâmetros de incubação (37°C, 10 rpm, 5% CO2, 95% umidade) e procedimentos de normalização de dados.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes linhagens celulares de câncer, já que a eficiência de formação de esferoides pode variar, mesmo com formação bem-sucedida em linhagens estabelecidas.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de prevenir a evaporação durante incubações prolongadas e a otimização da dosagem de compostos em volumes de nanolitros.
