Name: Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Aprenda a gerar esferoides tumorais tridimensionais em alta produtividade para triagem de drogas em oncologia. Este método utiliza placas de 1536 poços para cultivo de células cancerígenas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores que gostaria de agradecer Marc Ferrer no centro nacional por avançando Ciências translacionais, institutos nacionais de saúde para seu apoio e orientação sobre o desenvolvimento inicial destes ensaios. Além disso, gostaríamos de agradecer a Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling e Vesselina Cooke para sua entrada científica e discussão como membros da equipe do projeto.

1. cultivo de esferoides Tumor 1536-bem 3D
<ol><li>Preparar um tronco médio tumor 3D fresco esferoide (substituição de soro de nocaute, meio celular + selênio-insulina-transferrina), adicionando os seguintes reagentes para 500 mL de meio de águias de modificado de Dulbecco (DMEM/F12): 1 x penicilina/estreptomicina, 10 ng/mL de humanos básico fator de crescimento fibroblástico (bFGF), 20 ng/mL de humano fator de crescimento epidérmico (EGF), 0,4% albumina de soro bovino (BSA) (fração V), 1 x insulina-transferrina-selênio e substituição de soro 1% nocaute (KO) (não congelamento-descongelamento).</li>
	<li>Filtro-esterilize o meio inteiro com os suplementos através de um sistema de filtro de garrafa-topo 0,4 µm.</li>
	<li>Destacar as linhas de células de câncer, que tem vindo a crescer de acordo com as condições de cultura de rotina recomendado, dos frascos de cultura celular tradicional lavando-os 3 x com fosfato 1x tampão salino (PBS) e adicionando uma quantidade apropriada de tripsina 0,25% (1 mL por 5cm2) por 5 min criar uma camada fina sobre as células. Neutralizar a tripsina com 5 x a quantidade do meio contendo o soro e proceder a contagem das células. Por exemplo, use 25 mL de meio para 5 mL de tripsina.</li>
	<li>Ajuste a concentração da solução de célula a 62,5 x 104 células/mL para um total de 500 células por poço em 8 µ l de meio de esferoide de sementes para as placas de tecido-cultura-Tratado de 1536-bem.</li>
	<li>Em uma câmara de segurança biológica, propagar as células usando uma fita de aço inox-ponta esterilizada, pequena com um sistema de bomba peristáltica-base. Entre as linhas de célula diferente, irrigue o tubo da fita com 1X PBS e 70% etanol por 10 s.</li>
	<li>Alternativamente, as sementes as células usando um manipulador líquido localizado dentro de um quarto de HEPA-filtrado usando uma fita de aço inox-ponta esterilizada, pequena e uma bomba peristáltica ou uma bomba de seringa anexado, dependendo do número de placas por célula linha necessária.</li>
	<li>Sele as placas usando um selo de placa adesiva respirável ou manualmente ou usando um aferidor de placa.</li>
	<li>Coloque as placas em uma incubadora de fiação fixado em 10 rpm e 37 ° C com 5% de dióxido de carbono (CO2) e 95% de humidade relativa. Permitir que os esferoides ao formulário para 3-d.</li>
</ol>2. cultivo de linhas 2D 1536-bem câncer
Nota: As linhas de câncer 2D 1536-bem devem ser cultivadas 24 h antes da adição do composto com as placas 3D.
<ol><li>Preparar um meio de células de câncer 2D, adicionando os seguintes reagentes a 500 mL de um meio de cultura apropriado para as linhas selecionadas: 1 x penicilina/estreptomicina e 10% soro bovino fetal (FBS).</li>
	<li>Filtro-esterilize o meio inteiro com os suplementos através de um sistema de filtro de garrafa-topo 0,4 µm.</li>
	<li>Destacar as linhas de células de câncer, que tem vindo a crescer de acordo com as condições de cultura de rotina recomendado, dos frascos de cultura celular tradicional lavando-os 3 x com 1X PBS e adicionando uma quantidade apropriada de tripsina 0,25% (1 mL por 5 cm2) por 5 min para Crie uma camada fina sobre as células. Neutralizar a tripsina com 5 x a quantidade do meio contendo o soro e proceder a contagem das células. Por exemplo, use 25 mL de meio para 5 mL de tripsina.</li>
	<li>Ajuste a concentração da solução de célula a 62,5 x 104 células/mL para um total de 500 células por poço em 8 µ l de meio completo de sementes em placas de tecido-cultura-Tratado de 1536-boas.</li>
	<li>Em uma câmara de segurança biológica, propagar as células usando uma fita de aço inox-ponta esterilizada, pequena com um sistema de bomba peristáltica-base. Entre as linhas de célula diferente, irrigue o tubo da fita com 1X PBS estéril e de 70% etanol por 10 s.</li>
	<li>Alternativamente, propagar as células usando um manipulador líquido localizado dentro de uma sala de robótica HEPA-filtrado usando uma fita de aço inox-ponta esterilizada, pequena e uma bomba peristáltica ou a bomba de seringa anexado, dependendo do volume das placas por célula linha necessária.</li>
	<li>Sele as placas usando um selo de placa adesiva respirável ou manualmente ou usando um aferidor de placa.</li>
	<li>Coloque as placas em uma incubadora de fiação fixado em 10 rpm e 37 ° C por 24 h antes da adição de composto, com 5% CO2 e 95% de humidade relativa.</li>
</ol>3. compostos de adição
<ol><li>Prepare diluições de 8 pontos, 3 vezes seriais de inibidores MAPK em 100% dimetilsulfóxido (DMSO) em um robô de manipulação de líquido com uma concentração superior de 10 mM. O inibidor de proteossomo Bortezomib é usado como um controle positivo para uma célula completa matando para determinar a gama dinâmica do ensaio.</li>
	<li>Rápido-gire todo ensaio placas e placas compostas em 100 g de x para coletar qualquer condensação. Remova o selo de adesivo de cada prato e coloque uma placa em uma afinação acústica dispensador para adicionar um total de 8 nL de cada composto/diluição, representando uma concentração final de 0,1% DMSO por alvéolo e uma dose superior composta de 10 µM.</li>
	<li>Após a adição do composto é concluída, coloque uma tampa de cultura celular feito sob medida, de aço inoxidável que evita a evaporação sobre a chapa e coloque a placa em uma incubadora de fiação a 37 ° C para a 5D, com 5% CO2 e 95% de humidade relativa.</li>
</ol>4. detecção adição de reagente e a aquisição de dados brutos
<ol><li>Pré-aquecer um volume adequado de um reagente de lise celular contendo luciferina para detectar alterações em trifosfato (ATP), adenina e, assim, as alterações a proliferação celular em temperatura ambiente ou em banho maria a 37 ° C. Adicionar um total de 3 µ l de reagente a deteção a cada poço usando uma bomba peristáltica e incube a placa na temperatura ambiente pelo menos 15 min.</li>
	<li>Capture a luminescência luminómetro uma placa.</li>
</ol>5. processamento de dados
<ol><li>Extrair os dados brutos do instrumento e normalizar todos os campos que contêm compostos de teste para a média de todos os poços contendo DMSO sozinho como o controle de neutro. Partir deste valor, calcule a inibição do crescimento percentual de cada composto. Isso é concluído usando a função fórmula no Microsoft Excel onde f (x) = {(amostra de unidades de luz valor relativo (RLUs) / (média de valor de DMSO RLUs) * 100)}.</li>
	<li>Gere as curvas dose-resposta e IC50s inibitório representando graficamente os valores de dados normalizados da etapa 5.1 contra a concentração de compostos usando um programa gráfico. Nota: Foram analisados os dados usando o Helios, uma ferramenta de software interna NIBR. Para completar esta função, selecionamos a ferramenta de análise de curva não paramétrico.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, M., Vasioukhin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+and+cancer--cell+and+tissue+polarity+as+a+non-canonical+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).</li>
<li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research%3A+Focus+on+tumor+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li>
<li>Weigelt, B., Ghajar, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).</li>
<li>Li, L., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+3D+Culture+System+to+Study+the+Interaction+between+Epithelial+Breast+Cancer+and+Its+Surrounding+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts.</a> Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+models%3A+novel+in+vitro+approaches+to+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).</li>
<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+pharmacological+profiling+of+3D+tumor+models+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells.</a> Cell Death & Disease. 7 (12), e2492(2016).</li>
<li>Polo, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+to+PI3K+and+MEK+inhibitors+in+breast+cancer.+Use+of+a+3D+culture+system+to+study+pathways+related+to+hormone+independence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice.</a> PLoS One. 5 (5), e10786(2010).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Bhargava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registered+report%3A+RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Elife. 5, e09976(2016).</li>
<li>Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+CpG+promoter+methylation+in+invasive+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells.</a> Molecular Cancer. 9, 267(2010).</li>
<li>Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+gene+regulation+in+stem+cells+and+correlation+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer.</a> Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+DNA+repair+genes+in+invasive+human+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells.</a> Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+SOX9+by+the+NF-kappaB+signaling+pathway+in+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells.</a> Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li>
<li>Herter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+heterotypic+spheroid+model+for+the+assessment+of+the+activity+of+cancer+immunotherapy+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).</li>
</ol>

Os autores são empregados da Novartis, e alguns funcionários também são acionistas.

Os métodos apresentados aqui demonstram um protocolo detalhado sobre como produzir esferoides de tumor em placas de 1536-bem para as sessões de composto em grande escala. Esses métodos foram inicialmente adaptados do trabalho no Instituto Nacional de câncer onde esferoides de tumor foram cultivadas em ensaios de baixa produtividade em placas 6-poços e 96 poços para fazer perguntas sobre genéticas dependências e sensibilidade composto13, 14 , <sup class...

Na última década, cada vez mais estudos têm implementado o uso de modelos de cultura celular 3D para entender conceitos que não são totalmente instaurados pelo crescimento de células em 2D em plástico. Exemplos desses conceitos incluem as alternâncias na célula epitelial normal polaridade1 onde a orientação espacial das camadas basais e apicais das células são perdidos, bem como o papel da matriz extracelular na regulação da sobrevivência e destino da célula. Pesquisa de Oncologia, em particular, tem usado modelos 3D para entender a biologia básica das células cancerosas e as diferenças entre 2D e 3D celular cultura sistemas3,4. O desenvolvimento de técnicas mais sofisticadas de cultura celular e sua adaptação adicional para formatos múltiplos bem permitiu a busca de novas drogas nas configurações 3D. Em contraste com células cultivadas sob condições 2D, modelos 3D de variedade de tumores em complexidade de sistemas celulares em camadas5 single-célula do tipo esferas de tamanhos diferentes, para o complexo de multi-cell-tipo de esferas6,7, 8. a descoberta de novos compostos ou produtos biológicos que induzem a morte celular potente nestes sistemas modelo 3D é, portanto, de grande interesse nas campanhas de desenvolvimento de drogas. Pontos de extremidade destes ensaios muitas vezes são idênticos às realizadas em culturas 2D para avaliar alterações na proliferação celular, mas quando realizado em uma configuração mais fisiologicamente relevante, eles podem revelar o verdadeiro nível de dependência do gene alvo ou caminho sendo interrogado.
Como apresentado acima, uma variedade de sistemas modelo foram desenvolvidos para estudar respostas de drogas nos sistemas de cultura 3D, mas a maioria usa ou placas de microtitulação de 96 ou 384-bem e não é facilmente adaptável para os formatos de elevado-throughput screening (HTS) geralmente usados em campanhas de rastreio droga descoberta. Tais sistemas incluem o uso de tecnologias da gota, culturas de esferoide, células com partículas magnéticas para induzir a levitação, culturas e incorporando géis naturais ou sintéticas, como o colágeno, Matrigel ou polietileno glicol (PEG)2 a pulsar de suspensão . Aqui, apresentamos os métodos detalhados de uma técnica previamente desenvolvido para produzir culturas 3D esferoide de linhas de células de câncer estabelecido em um formato de placa 1536. Neste protocolo, um meio altamente definido é usado que impede a fixação de linhas de células normalmente aderentes9. Este sistema tem limitações (ou seja, é totalmente não pode recapitular um sistema complexo modelo de câncer), mas, no entanto, estes ensaios permitem uma seleção de alto rendimento de grandes coleções de pequenas moléculas e comparações transversalmente da resposta da droga entre 2D e 3D culturas contra uma variedade de linhas de células e compostos.
As linhas de células selecionado para demonstrar os métodos neste artigo todos harbor mutações em genes relacionados com a MAPK, sinalizando o caminho, um caminho que é altamente prejudicado em câncer, e para que muitos terapêutica estão disponíveis. Muitas das linhas tem ativação oncogênicas mutações no vírus Kirsten Rat Sarcoma também conhecido como KRAS, o RAS Neuroblastoma ou ARN, do oncogene do vírus Harvey Rat Sarcoma ou HRAS e os associado quinases Fibrosarcomas rapidamente acelerado, também conhecido como Bruno. Literatura recente sugere que os inibidores de diferentes nós deste percurso são excepcionalmente mais eficazes em um subconjunto das linhas celulares quando cultivadas sob condições 3D9,10. Um estudo descobriu que quando as células cancerosas com RAS ativo foram cultivadas em 3D, eles demonstraram uma sensibilidade aumentada aos inibidores de MAPK e ainda mais, que esta abordagem poderia identificar caminhos e alvo inibidores que podem ser perdidos em 2D tradicional configuração. O objetivo deste estudo é apresentar os métodos de cultura destas linhas de celular, e ainda mais, para demonstrar o diferencial de respostas para estes inibidores que podem ser observadas somente quando estiver usando 3D célula sistemas de cultura.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)/F12</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>Adquirido como uma solução preparada. Esta receita foi considerada preferida em comparação com outros fornecedores.</td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>Adquirido como uma solução preparada.</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Lonza</td><td>12-115Q</td><td>Comprado como uma solução preparada.</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td> <td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>Adquirido como uma solução preparada.</td></tr><tr><td>1x 0,25% de tripsina com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>Comprado como uma solução preparada.</td></tr><tr><td>1x Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Comprado como uma solução preparada.</td></tr><tr><td>10 ng/mL Fator de crescimento de fibrobastos básicos humanos (bFGF)</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Ressuspender em água estéril.</td></tr><tr><td>20 ng/mL Fator de Crescimento Epidérmico Humano (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Ressuspender em água estéril.</td></tr><tr><td>0,4% de albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A9418</td><td>ressuspende em PBS estéril e filtro.</td></tr><tr><td>1x Insulina Transferrina Selênio (ITS)</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>1% KnockOut (KO) Substituição de Soro</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Adicione fresco logo antes de usar.</td></tr><tr><td>100% Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7573</td><td>Comprado como uma solução preparada.</td></tr><tr><td><forte>Consumíveis</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Combi Pequeno</td><td>ThermoFisher</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Multifluxo Pequeno</td><td>BioTek</td><td>294085</td><td></td></tr><tr><td>Placas TC estéreis de 1536 poços (branco)</td><td>Corning</td><td>3727</td><td></td></tr><tr><td>Placas TC estéreis de 1536 poços (preto)</td><td>Placas</td><td></td> Corning 3893 <td></td></tr><tr><td>Scivax</td><td>MBL International</td><td>NCP-LH384-10</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesives vedações</td><td></td><td></td> Incubadora <td></td></tr> giratória <tr><td></td><td>LiCONiC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampas de aço inoxidável</td><td>The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATS Acoustic Dispensor</td><td>EDS Dispensador Acústico Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo</td><td>Labcyte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Envision-Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica- Multidrop Combi</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Handler-Multiflow FX</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geração de esferoides tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

As células cancerosas rotineiramente têm sido cultivadas em duas dimensões (2D) em uma superfície de plástico. Esta técnica, no entanto, carece o verdadeiro ambiente um tumor massa é exposta ao vivo em. Tumores sólidos crescem não como uma folha anexada ao plástico, mas em vez disso como uma coleção de células clonais em um tridimensional (3D) espaço interagindo com seus vizinhos e com distintas Propriedades espaciais tais como o rompimento da polaridade celular normal. Essas interações causam células 3D-cultivadas para adquirir características morfológicas e celulares que são mais relevantes para tumores na vivo . Além disso, um tumor em massa está em contato direto com outros tipos de células, como células do estroma e imunes, bem como de todos os outros tipos de células, a matriz extracelular. A matriz depositada é composta de macromoléculas como o colágeno e fibronectina.
Na tentativa de aumentar a tradução dos resultados da investigação em oncologia do banco ao lado da cama, muitos grupos começaram a investigar o uso de sistemas de modelo 3D em suas estratégias de desenvolvimento de drogas. Estes sistemas são pensados para ser mais fisiologicamente relevantes porque eles tentam recapitular o ambiente heterogêneo e complexo de um tumor. Estes sistemas, no entanto, podem ser bastante complexos, e, embora passível de crescimento em formatos de 96 poços e alguns agora mesmo em 384, oferecem poucas opções para o crescimento em grande escala e triagem. Este observado lacuna levou ao desenvolvimento dos métodos aqui descritos pormenorizadamente esferoides de tumor de cultura em uma capacidade de alta produtividade em placas de 1536-bem. Esses métodos representam um compromisso aos sistemas baseados na matriz altamente complexos, que são difíceis de tela e ensaios 2D convencionais. Uma variedade de linhas de células de câncer abrigando diferentes mutações genéticas são rastreados com êxito, examinando a eficácia do composto usando uma biblioteca com curadoria de compostos visando o caminho Mitogen-Activated proteína quinase ou MAPK. As respostas de cultura esferoide são então comparadas com a resposta das células cultivadas em 2D, e diferenciais atividades são relatadas. Esses métodos fornecem um protocolo exclusivo para testes de atividade composta num ambiente 3D de alto rendimento.

Uma variedade de células de câncer estabelecido linhas conhecidas para crescer bem em condições de cultura 2D foram testadas usando os métodos descritos aqui. Linhas de células de imagens representativas de uma variedade de câncer mutante MAPK (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS e KNS-62:HRAS) são vistos na Figura 1. Essas imagens demonstram que, embora as linhas de celular têm diversas morfologias, cada um formado estruturas 3D nas placas de ensaio ...

Uma grande variedade de indicações de doença, modelos mais fisiologicamente relevantes estão sendo programas de descoberta de drogas desenvolvida e implementada em. O novo sistema de modelo aqui descrito demonstra como tridimensional tumor esferoides podem ser cultivadas e exibidos em um sistema de baseado em placa de 1536-bem elevado-throughput para pesquisar novas drogas de Oncologia.

Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da descoberta de medicamentos, como qual é a configuração de cultura de tecidos mais relevante para a identificação de acerto para eletrodo. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a cultura de células em três dimensões, de forma de alto rendimento, usando 1536 placas de poço. Demonstrando este protocolo estará Kalyani Gampa, uma cientista sênior do meu laboratório.Para configurar uma cultura esferóide tumoral 3D, separe as linhas de células cancerígenas de interesse com três lavagens de BBS. Seguido pela adição de um mililitro de tripsina por área de cinco centímetros quadrados de frasco de cultura. Após cinco minutos, neutralizar a tripsina com cinco vezes o volume de soro suplementado em cada frasco e contar as células.Use um pequeno esterilizado com ponta de aço inoxidável com um sistema baseado em bomba peristáltica para semear um total de 500 células em oito microlitros de meio esferóide em cada poço de uma placa tratada com cultura de tecidos de 1.536 poços. Em seguida, use um selo de placa adesiva respirável para cobrir a placa. E coloque a placa em uma incubadora giratória ajustada a 37 graus Celsi

generation-high-throughput-three-dimensional-tumor-spheroids-for-drug

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Nós introduzimos um protocolo para a geração de um grande número (milhares a centenas de milhares) de tamanho-e esferóides uniformes tumor controlado por composição, usando placas de micropoços disponíveis no mercado.

Produção de grande número de controladas pelo tamanho Spheroids tumorais usando placas de micropoços

A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Um protocolo para impressão robótica de esferoides de células cancerígenas em um formato de placa de 96 poços de alto rendimento usando um sistema aquoso de duas fases é apresentado.

Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Xenoenxertos derivados de pacientes de glioblastoma multiforme podem ser miniaturizados em microtumores vivos usando o sistema de cultura de biogel humano 3D. Este ensaio tumoral 3D semelhante ao in vivo é adequado para testes de resposta a medicamentos e perfis moleculares, incluindo análise cinômica.

Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga

Tomografia de coerência óptica (OCT), uma tecnologia de imagem tridimensional, foi usada para monitorar e caracterizar a cinética de crescimento de esferoides tumor multicelulares. Precisa quantificação volumétrica de esferoides tumor usando um voxel contando a abordagem e deteção de tecido livre de rótulo morto nos esferoides baseado no contraste intrínseco atenuação óptica, foram demonstradas.

Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

Este protocolo detalha um método para a produção de três tipos diferentes de esferoides de uma maneira que os torna adequados para triagem e análise de alto conteúdo em larga escala. Além disso, são apresentados exemplos mostrando como eles podem ser analisados nos níveis esferoide e células individuais.

Um método robusto para a produção em larga escala de spheroids para aplicativos de triagem e análise de alto conteúdo

Os esferoides tumorais estão se tornando cada vez mais utilizados para avaliar as interações de microambientes de células tumorais e a resposta terapêutica. O presente protocolo descreve um método robusto, mas simples, para imagens semi-de alta produtividade de esferoides tumorais 3D usando limpeza óptica rápida.

Limpeza óptica rápida para análise semi-de alto rendimento de esferoides tumorais

O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Este artigo demonstra um método padronizado para a construção de esferoides tumorais tridimensionais. Uma estratégia para observação esferoide e análise de aprendizagem profunda baseada em imagens usando um sistema de imagem automatizado também é descrita.

Geração de esferoides tumorais 3D para estudos de avaliação de fármacos

Aqui, estabelecemos uma plataforma de perfil metabólico integrando esferóides de glioma tridimensionais (3D) e normalização baseada em imagem por meio de análise de fluxo extracelular. Essa abordagem permite uma avaliação mais precisa das respostas metabólicas do tumor aos tratamentos medicamentosos e fornece informações sobre os possíveis mecanismos de resistência.

Avanços no perfil metabólico de esferoides tridimensionais de tumores cerebrais para triagem de drogas

Aprenda a gerar esferoides tumorais tridimensionais em alta produtividade para triagem de drogas em oncologia. Este método utiliza placas de 1536 poços para cultivo de células cancerígenas.

Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Explorar mais vídeos