Name: CARIP-Seq e ChIP-Seq: métodos para identificar a cromatina associada RNAs e interações da proteína-ADN em células-tronco embrionárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a realizar CARIP-Seq e ChIP-Seq para mapear RNAs associados à cromatina e interações proteína-DNA em células-tronco embrionárias. Estas técnicas avançadas de epigenética permitem estudos genômicos abrangentes.

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Este trabalho foi apoiado por Wayne estado Universidade, Karmanos Cancer Institute, uma concessão do nacional do coração, pulmão e sangue Institute (1K22HL126842-01A1) atribuído a B.L.K. Este trabalho utilizou o Wayne estado Universidade High Performance Computing Grid para recursos computacionais (< https://www.grid.wayne.edu/>). Agradecemos Jiji Kurup assistência com análise de dados de CARIP-Seq.
CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES:
B.L.K. concebeu o método de CARIP-Seq, concebidos e realizados os experimentos de ChIP-Seq e CARIP-Seq, analisou os dados de sequenciamento e elaborou o manuscrito. Todos os autores leu e aprovou a versão final deste manuscrito.

<ol><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+external+signaling+pathways+with+the+core+transcriptional+network+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells.</a> Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+transcriptional+regulatory+circuitry+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells.</a> Cell. 122 (6), 947-956 (2005).</li>
<li>Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+transcriptional+network+for+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells.</a> Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+self-renewal+and+accelerated+reprogramming+in+the+absence+of+Kdm5b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b.</a> Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDM5B+focuses+H3K4+methylation+near+promoters+and+enhancers+during+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genome Biol. 15 (2), R32(2014).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Hudson, W. H., Ortlund, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function+and+evolution+of+proteins+that+bind+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+RNA+binding+by+chromatin-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins.</a> Genome Biol. 17, 28(2016).</li>
<li>Kelley, R. L., Kuroda, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+genes+in+dosage+compensation+and+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting.</a> Cell. 103 (1), 9-12 (2000).</li>
<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).</li>
<li>Mercer, T. R., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+long+noncoding+RNAs+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation.</a> Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Mak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+the+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Science. 303 (5658), 666-669 (2004).</li>
<li>Garfield, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+primary+mouse+embryonic+fibroblast+%28PMEF%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures.</a> Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29+to+analyze+short+reads+generated+by+sequencing+protein-DNA+interactions+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq%3A+technical+considerations+for+obtaining+high-quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data.</a> Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

ChIP-Seq é um método útil para avaliar o local de interações proteína-ADN global (ex., fatores de transcrição/histona modificando as modificações de histona/enzimas e DNA) em células ES, enquanto o protocolo de CARIP-Seq recentemente desenvolvido é útil em Associação de todo o genoma de RNAs com constituintes de cromatina a interrogar. ChIP-Seq é uma ferramenta fundamental que é usada para avaliar epigenéticas paisagens de pilhas do ES e outros tipos de células. A qualidade do ChIP-Seq e bibliotecas CARIP-Seq é ...

Decisões de destino de células estaminais embrionárias (ES) são reguladas pela comunicação entre sinais extracelulares e uma série de reguladores transcricionais, incluindo modificadores de histona e modificação pós-tradução de caudas de histona. Essas interações facilitam a acessibilidade de cromatina e empacotamento da cromatina em um dos dois Estados: eucromatina, que é aberto e transcricionalmente ativo, e heterocromatina, que é compacto e geralmente transcricionalmente inativo. Factores de transcrição com afinidades de ligação de sequência específica de DNA e modificadores epigenéticas associado com as regiões de eucromatina a participar no controle da expressão gênica. Métodos de sequenciamento de próxima geração, incluindo ChIP-Seq1, têm sido fundamentais para mapear todo o genoma redes transcriptional que são fundamentais para ES célula auto-renovação e pluripotência2,3,4 ,5,6. Além disso, enquanto o RNA immunopreciation seguido de próxima geração sequenciamento (RIP-Seq)7 avaliações interações RNA-proteína sugerem que as proteínas de ligação do DNA interagem com RNAs de regulação transcricional eventos7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, poucos estudos têm investigado a localização de todo o genoma de RNAs associados com cromatina12, ou interações globais entre RNA e histona modificações. Há muito tempo não-codificantes RNAs (lncRNAs) são uma classe de RNAs que foram encontrados para regular a atividade de proteínas da cromatina associada13,14,15. Por exemplo, a Xist é um lncRNA que regula, em células de mamíferos femininas, inativação de um cromossomo X, através do recrutamento de repressores epigenéticas16,17. No entanto, o espectro completo de RNAs associados a cromatina é desconhecido. Aqui, descrevemos um protocolo romance, associada a cromatina RNA imunoprecipitação (CARIP) seguido por sequenciamento de próxima geração (CARIP-Seq), para identificar a cromatina associada RNAs em uma base de todo o genoma em pilhas do ES, incluindo a preparação de biblioteca para sequenciamento de nova geração e ChIP-Seq para mapear ocupação global de modificações do histone, fatores de transcrição e epigenéticas modificadores. Ao contrário de outros métodos de RIP-Seq7, CARIP-Seq inclui etapas de reticulação e sonication, que permitem a identificação directa das RNAs associados a cromatina. Juntos, ChIP-Seq é uma poderosa ferramenta para identificar as interações proteína-ADN de todo o genoma, enquanto CARIP-Seq é um método poderoso para o levantamento RNAs associados a componentes de cromatina.

<table><tbody><tr><td>Fator inibidor da leucemia de camundongo (ESGRO LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>106 ou 107 units</td></tr><tr><td>GSK3&beta; inibidor CHIR99021 (GSK3i)</td><td>Solvente Stemgent</td><td></td><td>: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>Inibidor MEK PD0325901 (MEKi)</td><td>Solvente Stemgent</td><td></td><td>: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), glicose</td> <td>altaInvitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solução salina tamponada com fosfato)</td><td>Invitrogen</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (50 mM)</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1% Solução de Gelatina</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>G7126-500G</td><td>1,25 M conentração de estoque em água</td></tr><tr><td>Solução de formaldeído</td><td>Sigma</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TE (Tris EDTA) pH 8,0 1X</td><td>Qualidade Biológica</td><td>351-011-131</td><td></td></tr><tr><td>Solução de fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>93482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Solução de dodecil sulfato de sódio (20%)</td> <td>Qualidade Biológica</td><td>A611-0837-10</td><td></td></tr><tr><td>Q125 sonifier Qsonica</td><td></td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Solução Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína G para imunoprecipitação</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína A para imunoprecipitação</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína A / Proteína G e Pacote Inicial de Ímã</td><td>Invitrogen</td><td>10015D</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de lítio</td><td>Sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td> Kit de purificação de mRNA <td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads (para purificação de mRNA a partir de preparações totais de RNA)</td><td>Invitrogen</td><td>61006</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript Síntese de cDNA de fita dupla Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11917010</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Purificação PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Reparo Final de DNA End-It</td><td>Fragmento de Klenow</td><td>Lucigen ER81050</td><td></td></tr><tr><td>(3'&rarr; 5' exo-)</td><td>NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dATP (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>18252015</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>E-gel EX géis de agarose, 2%</td><td>Invitrogen</td><td>G402002</td><td></td></tr><tr><td>Phusion mistura master 2X de alta fidelidade com tampão HF</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>F531LPM</tr><tr><td>ChIPAb+ Trimetil-Histona H3 (Lys4) - Anticorpo validado por ChIP</td><td>EMD Millipore</td><td>17-614</td><td></td></tr><tr><td>Anti-histona H3 (di metil K4) anticorpo [Y47] - Grau ChIP (ab32356)</td><td>Placas de</td> cultura de células de fundo plano Abcam <td>ab32356</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar (6 poços)Placas de</td> cultura de tecidos padrão <td>Fisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>Falcon (10cm)</td><td>Fisher</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor pico</td><td>Diagenode</td><td>B01010001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flurometer 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit</td><td>de Ensaio Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Limpeza de Reação MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Extração de Gel MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histona H4 (tri metil K20) anticorpo - Grau ChIP (ab9053)</td> <td>Abcam</td><td>ab9053</td><td></td></tr><tr><td>Labquake rotator</td><td>Thermo Fisher</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq plataforma</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

carip-seq e chip-seq: métodos para identificar a cromatina associada rnas e interações da proteína-adn em células-tronco embrionárias

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

Autorenovação de células estaminais embrionárias (ES) e a diferenciação é regulada por sinais extrínsecos e intrínsecas redes de fatores de transcrição, epigenéticos reguladores e modificações pós-tradução das histonas que combinatóriamente influenciam o gene Estado de expressão de genes nas proximidades. RNA também foi mostrado para interagir com várias proteínas para regular a dinâmica da cromatina e expressão gênica. Associada a cromatina RNA imunoprecipitação (CARIP) seguida por sequenciamento de próxima geração (CARIP-Seq) é um novo método para o levantamento de RNAs associados a proteínas da cromatina, enquanto imunoprecipitação da cromatina, seguido por sequenciamento de próxima geração ( ChIP-Seq) é uma técnica poderosa genômica para mapear a localização de modificação pós-traducional de histonas, fatores de transcrição e modificadores epigenéticas em uma escala global em pilhas do ES. Aqui, descrevemos os métodos para executar CARIP-Seq e ChIP-Seq, incluindo a construção da biblioteca para geração de sequenciamento, para gerar o RNA global associada a cromatina e epigenomic mapas em pilhas do ES.

Interrogámo com êxito a ligação de todo o genoma de H3K4me3, H3K4me2 e KDM5B em células ES usando este ChIP-Seq protocolo6. ES as células foram cultivadas em condições de livre de alimentador (Figura 1) e reticulado como descrito acima. Sonication posteriormente foi realizada conforme descrito na etapa 3.2 do protocolo ChIP-Seq e avaliado pela execução de DNA em um gel de agarose a 2% (Figura 2). Em seguid...

Aqui, descrevemos os métodos para executar o ChIP-Seq e CARIP-Seq, incluindo preparação de biblioteca para o sequenciamento de última geração, para gerar epigenomic global e cromatina associada RNA mapas em pilhas do ES.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: métodos para identificar a cromatina associada RNAs e interações da proteína-ADN em células-tronco embrionárias

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

O objetivo geral do CARIP-Seq é pesquisar RNAs associados à cromatina em todo o genoma. O objetivo do ChIP-Seq é avaliar as interações proteína-DNA em escala global em células-tronco embrionárias. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave nos campos de epigenética e células-tronco, identificar a localização do genoma, fatores de transcrição ou ocupação de ligação ou modificação de histonas do regulador epigenético ou RNAs associados à cromatina em células-tronco embrionárias.A principal vantagem dessas técnicas é que elas permitem a interrogação imparcial de RNAs associados aos constituintes da cromatina em todo o genoma e a identificação global das interações do DNA da proteína. Embora esses métodos possam fornecer informações sobre a biologia das células-tronco embrionárias, eles também podem ser aplicados a outros tipos de células de mamíferos para estudar a biologia do câncer ou outras doenças humanas. Para colher as células-tronco embrionárias, lave as células primeiro com solução salina tamponada com fosfato.Em seguida, retire as células com 0,25% de tripsina, pré-aquecidas a 37 graus Celsius. Após tripsinização, ressuspender as células em meio MEF pré-aquecido, suplementado com soro bovino fetal a 10%. Em seguida, adicione 37% de formaldeído às células em um tubo cônico até uma concentração final de 1% e incube a 37 graus Celsius por oito minutos para reticular as células.Para interromper a reação de fixação, adicione 1,25 glicina molar pré-resfriada a quatro graus Celsius a uma concentração final de 0,125 molar. Em seguida, coloque o tubo em um rotador e inverta-o a oito rotações por minuto por cinco minutos à temperatura ambiente. Após cinco minutos, centrifugue a amostra a 300g por cinco minutos em temperatura ambiente.Após o término da centrifugação, descarte o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet com solução salina tamponada com fosfato pré-resfriado e centrifugue novamente a amostra. Em seguida, remova a solução salina tamponada com fosfato e congele as células em nitrogênio líquido por um minuto.Depois que as células-tronco embrionárias forem descongeladas no gelo, ressuspenda o pellet em 2,5 mililitros de tampão de sonicação. Para estudar fatores de transcrição ou fatores epigenéticos, ressuspenda o pellet celular em tampão de sonicação sem dodecil sulfato de sódio. Para modificações de histonas, ressuspenda o pellet celular em tampão contendo dodecil sulfato de sódio.Em seguida, para imunoprecipitação da cromatina, sonicar a cromatina por 14 a 18 ciclos a 40% de amplitude com 30 segundos no modo de repouso e 30 segundos. Para solubilizar a cromatina para o fator de proteína ChIP, suplementar o tampão de sonicação com 28 microlitros de dodecil sulfato de sódio a 10%. Para fatores de proteína em modificações de histonas, adicione 28 microlitros de desoxicolato de sódio e 0,28 mililitros de 10% Triton X-100 e misture bem.Em seguida, centrifugue a amostra a 10.000g por 10 minutos a quatro graus Celsius para pré-limpar a cromatina. Em um tubo de baixa ligação de 1,5 mililitro, adicione 40 microlitros de contas magnéticas A ou G. Em seguida, lave as esferas com 600 microlitros de solução salina tamponada com fosfato e transfira o tubo com as contas em uma prateleira contendo um ímã e incube por um minuto em temperatura ambiente.Em seguida, remova a solução salina tamponada com fosfato e ressuspenda novamente as esferas em 100 microlitros de solução salina tamponada com fosfato. Ao tubo, adicione dois a quatro microgramas de anticorpo e incuba-o colocando em um rotador por 40 minutos a oito rotações por minuto para promover a ligação do anticorpo às contas. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução salina tamponada com fosfato para lavar as contas.Após a lavagem, incubar o extrato de cromatina sonicado em um rotador a quatro graus Celsius durante a noite para imunoprecipitar as proteínas ligadas à cromatina. No dia seguinte, lave os grânulos e incube com tampão RIPA, tampão RIPA com sal, tampão cloreto de lítio, tampão Tris-EDTA com Triton X-100 e tampão Tris-EDTA, cada um por 10 minutos em um rotador. Para desfazer a reticulação para ChIP, ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão Tris-EDTA.Em seguida, adicione três microlitros de dodecil sulfato de sódio a 10% e cinco microlitros de 20 miligramas por mililitro de proteinase K e incube as esferas a 65 graus Celsius durante a noite. Após a incubação, no dia seguinte, inverta os tubos várias vezes, deixe-os no suporte magnético e transfira o sobrenadante para um novo tubo. Em seguida, lave as esferas magnéticas adicionando 100 microlitros de tampão Tris-EDTA, contendo cloreto de sódio 0,5 molar e combine os dois sobrenadantes.Para desfazer a reticulação do CARIP, ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão Tris-EDTA. Em seguida, adicione três microlitros de dodecil sulfato de sódio a 10% e cinco microlitros de 20 miligramas por mililitro de proteinase K e incube as esferas a 65 graus Celsius por quatro a 12 horas. Novamente, inverta o tubo várias vezes e coloque no rack magnético para transferir o sobrenadante para um tubo novo.Em seguida, lave as esferas magnéticas adicionando 100 microlitros de tampão Tris-EDTA, contendo cloreto de sódio 0,5 molar e, em seguida, combine os dois sobrenadantes. Finalmente, isole a amostra de RNA usando álcool fenol clorofórmio isoamílico na proporção de 25 a 24 para um volume por volume. Em seguida, use DNase para remover o DNA da amostra de RNA imunoprecipitado associada à cromatina.Em seguida, adicione tampão DNase 10X à amostra CARIP e ajuste o volume final para a concentração de 1X. Em seguida, incube a amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, sintetize a primeira fita de DNA complementar estabelecendo uma reação de PCR adicionando 10,5 microlitros de RNA e um microlitro de três microgramas por mililitro de primers hexâmeros aleatórios.Para desnaturar a estrutura secundária, primeiro incube o tubo a 65 graus Celsius por cinco minutos e depois no gelo por dois minutos. Em seguida, adicione a mistura principal ao tubo de PCR e incube a 25 graus Celsius por dois minutos. Em seguida, adicione um microlitro de 200 unidades por microlitro de dois sobrescritos e execute o programa termociclador.Para sintetizar a segunda fita de DNA complementar, configure a reação no gelo adicionando os reagentes, tampão e enzimas. Em seguida, vórtice para misturar os reagentes suavemente e incubar a 16 graus Celsius por duas horas. Após a síntese do DNA, purifique o DNA complementar usando um kit de purificação por PCR.Em seguida, desfragmente o DNA de fita dupla, use um sonificador em banho-maria e um tubo de 1,5 mililitro para compartilhar o DNA em um tamanho de 250 a 500 pares de bases por três vezes 10 minutos ou quatro vezes 10 minutos. Em seguida, prepare a biblioteca e execute o sequenciamento de próxima geração. Aqui, imagens de contraste de fase de células-tronco embrionárias foram capturadas para visualizar as colônias de células-tronco.Neste protocolo, as células foram cultivadas na presença ou ausência de fibroblastos embrionários de camundongo mitoticamente inativados com LIF e/ou GSK3i nos meios de cultura para evitar a diferenciação das células. Em seguida, para visualizar a eficiência da sonicação da cromatina de células-tronco embrionárias reticuladas, o DNA sonicado de fita dupla foi carregado em um gel de 2% de agarose. A imagem do gel mostra cromatina cisalhada na faixa de 200 a 500 pares de bases.Em seguida, as bibliotecas ChIP-Seq foram geradas e sequenciadas usando uma plataforma de sequenciamento de próxima geração para avaliar a ocupação em todo o genoma de uma enzima modificadora de histonas e modificações de histonas em células-tronco embrionárias. Na visualização personalizada do navegador UCSC, a trimetilação H3K4 enriquecida, a dimetilação H3K4 e o KDM5B são visíveis no gene regulador de pluripotência central, POU5F1 e no cluster HOXC. A análise CARIP-Seq também foi realizada para avaliar RNAs associados à cromatina em células-tronco embrionárias.A visualização personalizada do navegador UCSC mostra o RNA associado à trimetilação H4K20 e a ocupação da trimetilação H4K20 em células-tronco embrionárias. A partir dos resultados do CARIP-Seq, pode-se interpretar que, embora o RNA esteja associado à trimetilação de H4K20, ele pode não interagir com o locus específico. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro dias se for executada corretamente.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como pesquisar RNAs associados à cromatina usando CARIP-Seq e identificar interações de DNA de proteína em escala global em células-tronco embrionárias.

carip-seq-chip-seq-methods-to-identify-chromatin-associated-rnas

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

A diferenciação do ESC coincide com células tipo mudanças específicas na estrutura e composição da cromatina. A detecção dessas mudanças fornece informações valiosas sobre os mecanismos que definem stemcellness e diferenciação celular. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) representa um método valioso para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes à diferenciação de células-tronco.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

Este vídeo mostra as etapas básicas para realizar a análise de transcriptoma completo em amostras de medula espinhal embrionária de pintinho dissecado após a transfecção com eletroporação in ovo.

RNA-Seq Análise de Gene Expression Diferencial em electroporados Pintainho Embryonic Medular

A questão de como os reguladores e os estados de cromatina cromatina afetar o genoma in vivo é essencial para a nossa compreensão de como o diagnóstico precoce decisões destino celular são feitas no embrião em desenvolvimento. Abordagem mais popular para investigar características de cromatina em um nível-se global definida aqui para embriões de Xenopus o chip-Seq-.

Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões por Chip-Seq

Um regulamento ajuste fino da transcrição do gene subjacente a decisão destino da célula embrionária. Aqui, descrevemos ensaios de imunoprecipitação de cromatina utilizados para investigar regulação epigenética de ambos diferenciação cardíaca de células estaminais e desenvolvimento cardíaco de embriões de camundongos.

Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Aqui, descrevemos uma imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e protocolo de preparação ChIP-seq biblioteca para gerar perfis de epigenomic global de amostras embrionárias de galinha baixa abundância.

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Descreveremos um protocolo passo a passo para cromatina em tandem da imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq) que permite a análise da modificação do histone todo o genoma de célula tipo-específicas.

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

A determinação precisa de locais de ligação de proteínas em todo o genoma é importante para entender a regulação genética. Aqui descrevemos um método de mapeamento genômico que trata DNA cromatina-imunoprecipitado com digestão exonuclease (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alta produtividade. Este método detecta interações proteína-DNA com resolução de mapeamento quase par de bases e alta relação sinal-ruído em neurônios mamíferos.

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Este protocolo fornece um pipeline computacional simplificado para quantificar transcritos de intensificadores nascentes. Ao integrar a acessibilidade da cromatina, a característica da cromatina e os dados transcricionais, ele permite a detecção precisa e a análise específica da atividade do intensificador em regiões intragênicas complexas, mantendo-se acessível a pesquisadores sem treinamento extensivo em bioinformática.

Um pipeline computacional para quantificação de RNA intensificador intergênico/intragênico em células-tronco embrionárias de camundongo

Aqui, apresentamos um protocolo para capturar as interações DNA-DNA de cromatina associadas ao RNA para mapear a organização do genoma tridimensional relacionada ao RNA.

Método de Interação DNA-DNA de Cromatina Associada a RNA

Um método ChIRP baseado em UV para identificar interações diretas entre lncRNA e proteína.

Um método de ChIRP Baseado em UV para a Identificação Verificável de Proteínas que Interagem Diretamente com LncRNA: De Células Cultivadas a Testículos de Camundongos

Aprenda a realizar CARIP-Seq e ChIP-Seq para mapear RNAs associados à cromatina e interações proteína-DNA em células-tronco embrionárias. Estas técnicas avançadas de epigenética permitem estudos genômicos abrangentes.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: métodos para identificar a cromatina associada RNAs e interações da proteína-ADN em células-tronco embrionárias (Vídeo) | JoVE Journal

CARIP-Seq e ChIP-Seq: métodos para identificar a cromatina associada RNAs e interações da proteína-ADN em células-tronco embrionárias

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