CARIP-Seq e ChIP-Seq: métodos para identificar a cromatina associada RNAs e interações da proteína-ADN em células-tronco embrionárias

O objetivo geral do CARIP-Seq é pesquisar RNAs associados à cromatina em todo o genoma. O objetivo do ChIP-Seq é avaliar as interações proteína-DNA em escala global em células-tronco embrionárias. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave nos campos de epigenética e células-tronco, identificar a localização do genoma, fatores de transcrição ou ocupação de ligação ou modificação de histonas do regulador epigenético ou RNAs associados à cromatina em células-tronco embrionárias.

A principal vantagem dessas técnicas é que elas permitem a interrogação imparcial de RNAs associados aos constituintes da cromatina em todo o genoma e a identificação global das interações do DNA da proteína. Embora esses métodos possam fornecer informações sobre a biologia das células-tronco embrionárias, eles também podem ser aplicados a outros tipos de células de mamíferos para estudar a biologia do câncer ou outras doenças humanas. Para colher as células-tronco embrionárias, lave as células primeiro com solução salina tamponada com fosfato.

Em seguida, retire as células com 0,25% de tripsina, pré-aquecidas a 37 graus Celsius. Após tripsinização, ressuspender as células em meio MEF pré-aquecido, suplementado com soro bovino fetal a 10%. Em seguida, adicione 37% de formaldeído às células em um tubo cônico até uma concentração final de 1% e incube a 37 graus Celsius por oito minutos para reticular as células.

Para interromper a reação de fixação, adicione 1,25 glicina molar pré-resfriada a quatro graus Celsius a uma concentração final de 0,125 molar. Em seguida, coloque o tubo em um rotador e inverta-o a oito rotações por minuto por cinco minutos à temperatura ambiente. Após cinco minutos, centrifugue a amostra a 300g por cinco minutos em temperatura ambiente.

Após o término da centrifugação, descarte o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet com solução salina tamponada com fosfato pré-resfriado e centrifugue novamente a amostra. Em seguida, remova a solução salina tamponada com fosfato e congele as células em nitrogênio líquido por um minuto.

Depois que as células-tronco embrionárias forem descongeladas no gelo, ressuspenda o pellet em 2,5 mililitros de tampão de sonicação. Para estudar fatores de transcrição ou fatores epigenéticos, ressuspenda o pellet celular em tampão de sonicação sem dodecil sulfato de sódio. Para modificações de histonas, ressuspenda o pellet celular em tampão contendo dodecil sulfato de sódio.

Em seguida, para imunoprecipitação da cromatina, sonicar a cromatina por 14 a 18 ciclos a 40% de amplitude com 30 segundos no modo de repouso e 30 segundos. Para solubilizar a cromatina para o fator de proteína ChIP, suplementar o tampão de sonicação com 28 microlitros de dodecil sulfato de sódio a 10%. Para fatores de proteína em modificações de histonas, adicione 28 microlitros de desoxicolato de sódio e 0,28 mililitros de 10% Triton X-100 e misture bem.

Em seguida, centrifugue a amostra a 10.000g por 10 minutos a quatro graus Celsius para pré-limpar a cromatina. Em um tubo de baixa ligação de 1,5 mililitro, adicione 40 microlitros de contas magnéticas A ou G. Em seguida, lave as esferas com 600 microlitros de solução salina tamponada com fosfato e transfira o tubo com as contas em uma prateleira contendo um ímã e incube por um minuto em temperatura ambiente.

Em seguida, remova a solução salina tamponada com fosfato e ressuspenda novamente as esferas em 100 microlitros de solução salina tamponada com fosfato. Ao tubo, adicione dois a quatro microgramas de anticorpo e incuba-o colocando em um rotador por 40 minutos a oito rotações por minuto para promover a ligação do anticorpo às contas. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução salina tamponada com fosfato para lavar as contas.

Após a lavagem, incubar o extrato de cromatina sonicado em um rotador a quatro graus Celsius durante a noite para imunoprecipitar as proteínas ligadas à cromatina. No dia seguinte, lave os grânulos e incube com tampão RIPA, tampão RIPA com sal, tampão cloreto de lítio, tampão Tris-EDTA com Triton X-100 e tampão Tris-EDTA, cada um por 10 minutos em um rotador. Para desfazer a reticulação para ChIP, ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão Tris-EDTA.

Em seguida, adicione três microlitros de dodecil sulfato de sódio a 10% e cinco microlitros de 20 miligramas por mililitro de proteinase K e incube as esferas a 65 graus Celsius durante a noite. Após a incubação, no dia seguinte, inverta os tubos várias vezes, deixe-os no suporte magnético e transfira o sobrenadante para um novo tubo. Em seguida, lave as esferas magnéticas adicionando 100 microlitros de tampão Tris-EDTA, contendo cloreto de sódio 0,5 molar e combine os dois sobrenadantes.

Para desfazer a reticulação do CARIP, ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão Tris-EDTA. Em seguida, adicione três microlitros de dodecil sulfato de sódio a 10% e cinco microlitros de 20 miligramas por mililitro de proteinase K e incube as esferas a 65 graus Celsius por quatro a 12 horas. Novamente, inverta o tubo várias vezes e coloque no rack magnético para transferir o sobrenadante para um tubo novo.

Em seguida, lave as esferas magnéticas adicionando 100 microlitros de tampão Tris-EDTA, contendo cloreto de sódio 0,5 molar e, em seguida, combine os dois sobrenadantes. Finalmente, isole a amostra de RNA usando álcool fenol clorofórmio isoamílico na proporção de 25 a 24 para um volume por volume. Em seguida, use DNase para remover o DNA da amostra de RNA imunoprecipitado associada à cromatina.

Em seguida, adicione tampão DNase 10X à amostra CARIP e ajuste o volume final para a concentração de 1X. Em seguida, incube a amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, sintetize a primeira fita de DNA complementar estabelecendo uma reação de PCR adicionando 10,5 microlitros de RNA e um microlitro de três microgramas por mililitro de primers hexâmeros aleatórios.

Para desnaturar a estrutura secundária, primeiro incube o tubo a 65 graus Celsius por cinco minutos e depois no gelo por dois minutos. Em seguida, adicione a mistura principal ao tubo de PCR e incube a 25 graus Celsius por dois minutos. Em seguida, adicione um microlitro de 200 unidades por microlitro de dois sobrescritos e execute o programa termociclador.

Para sintetizar a segunda fita de DNA complementar, configure a reação no gelo adicionando os reagentes, tampão e enzimas. Em seguida, vórtice para misturar os reagentes suavemente e incubar a 16 graus Celsius por duas horas. Após a síntese do DNA, purifique o DNA complementar usando um kit de purificação por PCR.

Em seguida, desfragmente o DNA de fita dupla, use um sonificador em banho-maria e um tubo de 1,5 mililitro para compartilhar o DNA em um tamanho de 250 a 500 pares de bases por três vezes 10 minutos ou quatro vezes 10 minutos. Em seguida, prepare a biblioteca e execute o sequenciamento de próxima geração. Aqui, imagens de contraste de fase de células-tronco embrionárias foram capturadas para visualizar as colônias de células-tronco.

Neste protocolo, as células foram cultivadas na presença ou ausência de fibroblastos embrionários de camundongo mitoticamente inativados com LIF e/ou GSK3i nos meios de cultura para evitar a diferenciação das células. Em seguida, para visualizar a eficiência da sonicação da cromatina de células-tronco embrionárias reticuladas, o DNA sonicado de fita dupla foi carregado em um gel de 2% de agarose. A imagem do gel mostra cromatina cisalhada na faixa de 200 a 500 pares de bases.

Em seguida, as bibliotecas ChIP-Seq foram geradas e sequenciadas usando uma plataforma de sequenciamento de próxima geração para avaliar a ocupação em todo o genoma de uma enzima modificadora de histonas e modificações de histonas em células-tronco embrionárias. Na visualização personalizada do navegador UCSC, a trimetilação H3K4 enriquecida, a dimetilação H3K4 e o KDM5B são visíveis no gene regulador de pluripotência central, POU5F1 e no cluster HOXC. A análise CARIP-Seq também foi realizada para avaliar RNAs associados à cromatina em células-tronco embrionárias.

A visualização personalizada do navegador UCSC mostra o RNA associado à trimetilação H4K20 e a ocupação da trimetilação H4K20 em células-tronco embrionárias. A partir dos resultados do CARIP-Seq, pode-se interpretar que, embora o RNA esteja associado à trimetilação de H4K20, ele pode não interagir com o locus específico. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro dias se for executada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como pesquisar RNAs associados à cromatina usando CARIP-Seq e identificar interações de DNA de proteína em escala global em células-tronco embrionárias.