Músculo levantador Auris Longus Preparação para exame da transmissão Neuromuscular mamíferos sob condições de grampo de tensão

O objetivo geral deste procedimento é isolar o músculo levantador do longo do auro e seu nervo, a fim de registrar as correntes sinápticas na junção muscular neural. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na fisiologia sináptica, como o tamanho da corrente da placa terminal, o conteúdo quântico, a probabilidade de liberação e as relações entre neurotransmissão e excitabilidade muscular. A principal vantagem desta técnica é que os registros eletrofisiológicos detalhados de uma única sinapse podem ser facilmente combinados com experimentos ópticos de células vivas.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a função sináptica e a comunicação de feedback entre nervo e músculo, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, desde drosófilas a mamíferos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a preparação do músculo nervoso dos mamíferos é frágil, principalmente o nervo. Adquirir e interpretar cuidadosamente os dados subsequentes do grampo de tensão também pode ser um desafio.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora se for executada corretamente. Demonstrando o procedimento estará Steve Burke do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, sob um microscópio de dissecação estéreo, faça uma pequena incisão na pele nas costas do camundongo ao nível das escápulas.

Use uma tesoura de microdissecação. Corte a pele sobre a cabeça e as costas. Em seguida, puxe a pele ao longo da incisão perto das escápulas.

Corte os músculos inferiores ao LAL começando pela escápula direita. Em seguida, levante suavemente o tecido cortado imediatamente para a direita da linha média. Faça um corte em direção à orelha esquerda com as lâminas da tesoura pressionadas contra o crânio para remover várias camadas de músculo que são inferiores ao LAL esquerdo.

Evite cortar o nervo que inerva o LAL que envolve o canal auditivo e entra nos músculos do lado medial da orelha. Continue cortando o canal auditivo, mantendo o máximo possível do nervo conectado. Em seguida, corte o tecido adiposo atrás do canal auditivo ao longo da porção ventrolateral da orelha.

Corte ao longo da escápula esquerda semelhante aos procedimentos feitos no lado direito para remover completamente o músculo do mouse. Em seguida, corte o pavilhão auricular da orelha ao longo da base, deixando a parte cartilaginosa da orelha presa ao LAL. Vire o músculo para que o lado inferior fique voltado para cima.

Para isolar o músculo LAL, coloque o LAL e o tecido circundante em uma placa de Petri com um fundo de elastômero de silicone e prenda o tecido dissecado no fundo. Lave o tecido frequentemente em uma solução salina fisiológica. Em seguida, coloque um pino de inseto no canal auditivo para manter a preparação no lugar.

Usando pinos menores, prenda o tecido restante no lado oposto da linha média do LAL. Use um par de pinças. Puxe suavemente a pele para cima na parte lateral da orelha para esticar o músculo e coloque um pequeno alfinete na pele.

Repita esta etapa até que o tecido esteja bem preso ao prato. Remova os músculos que estão cobrindo o LAL e aqueles ligados ao LAL por meio de tecido conjuntivo e estão especialmente tensos perto da linha média. Em seguida, puxe a camada muscular sobrejacente e corte o tecido conjuntivo com as lâminas orientadas para a camada muscular que está sendo puxada.

Corte em direção à linha média até cerca de 3/4 do caminho até a linha média e continue removendo as camadas musculares até que apenas o LAL permaneça. Durante o processo de limpeza, certifique-se de que os nervos não estejam danificados. Em seguida, remova parte do tecido conjuntivo restante que está cobrindo o LAL para ajudar no empalamento dos eletrodos.

Remova apenas o tecido que pode ser feito facilmente sem risco de danificar o LAL no processo. Para identificar o nervo que inerva o LAL, usando um estimulador de nervo, toque os nervos com o estimulador de nervo. Quando o músculo se contrai, o nervo correto foi identificado.

Em seguida, segure cuidadosamente o tecido perto do nervo e use uma tesoura de mola para separar o nervo do tecido ao redor da orelha. Para minimizar os danos, mantenha a maior parte do nervo embutido em algum tecido circundante que será usado posteriormente para prender o nervo ao prato de registro. Nesse ponto, o investigador pode fazer uma pausa de uma hora, desde que o LAL seja banhado em 20 mililitros ou mais de uma solução salina fisiológica.

Em seguida, solte e transfira o músculo para uma inserção de platina sob o microscópio de dissecção para experimentos de eletrofisiologia. Prenda o músculo nas extremidades e ao longo de sua borda. Posicione o nervo perpendicular às fibras musculares e prenda-o no fundo do prato através de algum excesso de tecido que foi deixado intacto no final do nervo.

Mantenha o tecido banhado em uma solução salina fisiológica o tempo todo. Para experimentos de eletrofisiologia, prenda a câmara de perfusão com o LAL ao microscópio stage. Coloque o eletrodo de referência em um copo cheio de cloreto de potássio trimolar que é conectado à câmara de registro por meio de uma ponte de ágar.

Neste ponto, posicione o eletrodo estimulador do nervo no nervo. Exponha a preparação LAL a 4-Di-2-Asp por 10 minutos para obter uma florescência adequada para visualização da junção neuromuscular. Após 10 minutos, troque a solução de 4-Di-2-Asp pela solução de cálcio normal.

Enquanto isso, encha os capilares de vidro com as soluções apropriadas para os eletrodos de detecção de tensão e passagem de corrente. Bata suavemente no capilar para remover quaisquer bolhas de ar e prenda o capilar cheio no suporte do eletrodo no headstage. Usando um microscópio vertical com iluminação padrão de campo brilhante e florescência, procure uma faixa brilhante de junções neuromusculares verdes fluorescentes perpendiculares às fibras musculares ao longo da preparação com uma objetiva de imersão em água de baixa ampliação.

Em seguida, mude para uma objetiva de imersão em água de maior ampliação para identificar uma junção neuromuscular na camada superior do músculo para examinar com eletrofisiologia. Usando principalmente campo claro, posicione o eletrodo acima da membrana muscular dentro de 100 mícrons da junção neuromuscular identificada. Esta figura mostra um exemplo dos pulsos de corrente e das respostas de tensão de uma fibra LAL sob pinça de corrente de um camundongo R62 do tipo selvagem de 12 semanas.

Os registros foram obtidos em solução salina fisiológica normal e a presença de mEPPs indica que esses registros foram retirados da placa motora. Aqui está uma gravação representativa de um EPC e dois mEPCs obtidos sob condição de grampo de tensão. Esta figura mostra os EPCs e mEPCs sobrepostos de uma fibra representativa.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como imagens de células vivas com corantes de membrana, como FM143 ou histologia, podem ser realizados para responder a perguntas relacionadas à captação de liberação de vesículas ou alterações morfológicas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da fisiologia explorarem a transmissão sináptica e a comunicação entre células nervosas e organismos que vão desde drosófilas a mamíferos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar o músculo elevador do auro longo inervado para registrar as correntes sinápticas na junção neuromuscular. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de tomar muito cuidado ao remover o tecido muscular adjacente ao LAL e isolar o nervo.