Name: Músculo levantador Auris Longus Preparação para exame da transmissão Neuromuscular mamíferos sob condições de grampo de tensão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a isolar o músculo levantador da orelha longa e seu nervo em camundongos para registrar correntes sinápticas na junção neuromuscular. Este método permite estudos detalhados de neurotransmissão em condições fisiológicas e patológicas.

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Agradecemos Dr. Mark M. Rich e Daniel Miranda Comentários editoriais, Ahmad Khedraki para ajudar a estabelecer essa técnica e Wright State University, para apoio financeiro (fundo de inicialização para A.A.V.).

<ol><li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse%3A+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui descrito é a preparação e uso do mouse músculo LAL para a medição da transmissão neuromuscular sob condições de tensão ou corrente --braçadeira. Há vários pontos importantes a considerar para a dissecar o LAL. Limpar o excesso de tecido conjuntivo das aids de músculo em empalamento de eletrodo, como os eletrodos pode snag o tecido conjuntivo quando posicionando-os por empalamento. No entanto, só remover o tecido conjuntivo que pode ser retirado facilmente para limitar as chances de danificar o músculo. O isolamento ...

Estudando a transmissão sináptica na junção neuromuscular fornece insights sobre a relação dinâmica entre os sistemas musculares, nervosos e esqueléticos e é um excelente modelo para analisar a fisiologia sináptica. O músculo levantador auris longus (LAL) é um músculo fino, permitindo às junções neuromusculares ser facilmente visualizado. Relatórios anteriores descreveram a conveniência de usar o leite para examinar as toxinas e drogas sinápticas e caracterizaram as características do tipo de fibra de músculo esquelético da LAL1,2. Numerosos estudos têm usado o LAL para examinar a fisiologia neuromuscular3,4,5,6,7,8. Para eletrofisiologia, a capacidade de observar facilmente as junções neuromusculares LAL permite a colocação exata de microeletrodos na placa terminal motor e reduz problemas de braçadeira espaço na gravação de transmissão sináptica. Corrente-braçadeira gravações das propriedades da membrana muscular, tais como a constante de tempo de membrana (τm) e resistência de entrada (Rem) são facilmente obtidas. Além disso, essas propriedades podem ser medidas de fibras musculares mesmas usadas para gravar a transmissão neuromuscular, permitindo uma comparação direta da função sináptica para as propriedades da membrana muscular. A análise destes dados pode fornecer insights-chave nos mecanismos físicos de muitas doenças neuromusculares e Estados de atividade alterada.
Um aspecto fundamental da técnica descrita aqui é a utilização de tensão-braçadeira para gravações sinápticas, que não estão sujeitos as não-linearidades encontradas na corrente-braçadeira e são independentes das propriedades da membrana muscular. Vantagens do uso de tensão-braçadeira em oposição à corrente-braçadeira para examinar a transmissão neuromuscular foram estabelecidas pelo pioneiro esforços na década de 19509. Sob corrente-braçadeira, EPPs que excederem 10-15 mV em amplitude não são um produto linear da amplitude pptm.9. Por exemplo, se o pptm média é 1 mV, uma EPP de 5 mV pode-se supor para ser o produto de 5 pptm (QC de 5); Considerando que, uma EPP de 40 mV será o produto de mais de 40 pptm. Essa não-linearidade no maiores EPPs ocorre porque a força motriz para o PPE, que é a diferença entre o potencial de membrana e o potencial de equilíbrio para o receptor de acetilcolina (~ -10 mV), diminui substancialmente durante grandes EPPs. Esse problema é evitado em experimentos de tensão-braçadeira não altera o potencial de membrana muscular durante experimentos de tensão-braçadeira. Uma desvantagem é que os experimentos de tensão-braçadeira são tecnicamente mais difícil do que a gravação de grampo-corrente. Com isto em mente, McLachlan e Martin desenvolveram uma correção de matemática simples que é responsável por não-linearidades em gravações de corrente-braçadeira de EPPs10. As correções funcionam bem11,12,13, mas importante, assumem que as propriedades da membrana muscular não foram interrompidas.
As propriedades da membrana muscular são especialmente importantes para considerar se a estudar as condições ou Estados de doença que perturbam o músculo. Por exemplo, o músculo esquelético do R6/2 modelo transgênico da doença de Huntington é hyperexcitable devido a uma redução progressiva no descanso de cloreto e potássio correntes14,15. Como consequência, pptm e EPPs são amplificados em músculo esquelético R6/2. Certamente, fatores adicionais podem alterar pptm e EPPs. Trabalhar com um modelo diferente de ratos a doença de Huntington (R6/1) encontrou alterações em EPPs que parecem estar relacionados com proteínas SNARE8. Para avaliar os mecanismos causando alterações de transmissão neuromuscular, seria benéfico eliminar os efeitos das propriedades de membrana muscular alterado usando uma tensão-braçadeira. Em um estudo recente, a transmissão neuromuscular R6/2 foi estudada em ambas as condições de corrente e tensão-braçadeira usando a técnica descrita neste documento. A totalidade das placas terminais motor foram tensão-fixada com menos do que 1% de erro, colocando dois microeletrodos dentro constante do comprimento da placa terminal16. Ele foi mostrado aquela tensão-braçadeira e corrigida registros de corrente-braçadeira rendidos medições contrastantes da transmissão neuromuscular no músculo R6/2. Isto ressalta que pode ser difícil corrigir EPPs não-linearidades se alteraram-se as propriedades da membrana muscular e mostra os benefícios de se obter registros de tensão-braçadeira independentes das propriedades da membrana muscular. O protocolo apresentado neste documento é ideal para examinar as condições ou Estados de doenças que afetam a transmissão sináptica e as propriedades da membrana pós-sináptica.

<table><tbody><tr><td>Microscópio Composto Olympus</td><td></td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>10x Objetiva</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>40x Objetiva</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de Borosilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>Santa Barbara Instruments Group</td><td>ST-7XMEI</td><td></td></tr><tr><td>Mater-9 Pulse Gerador</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iso-flex Stimulus Isolator</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 Software de Aquisição e Análise de Dados</td><td>Molecular Devices</td><td>1-2500-0180</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodo Bipolar Concêntrico</td><td>FHC</td><td>CBDSH75</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador de Junta Esférica</td><td>Narishige&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringas não metálicas 34 Gauge</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>No. 2 Fórceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5Q41</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecação Tesoura</td><td>Roboz</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de Elastômero de Silicone</td><td>Dow Corning</td><td>2404019862</td><td></td></tr><tr><td>Creme de Depilação</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grass SD9 Estimulador</td> de <td>Grama Modelo Médico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-1000 Extrator de Micropipeta</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Axônio Digidata 1550 Sistema de Acuisição de Dados de Baixo Ruído</td><td>Instrumentos</td><td></td><td></td>Molecular</tr><tr><td>Pass Bessell Filter</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador Canhoto</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DL</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador destro</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DR</td><td></td></tr><tr><td>Único Controlador de Movimento</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MC100e</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador de Rolos Cruzados</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641R</td><td>Isso foi adicionado ao eixo Z dos micromanipuladores para canhotos e destros para permitir que o eixo z seja motorizado. Essa configuração personalizada é mais barata e menos volumosa do que comprar um micromanipulador motorizado de 4 eixos. Também nos permite controlar ambos os micromanipuladores com um controlador</td></tr><tr><td>Todos os produtos químicos foram encomendados da Fisher, exceto,</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>BTS</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B315190</td><td></td></tr><tr><td>CTX</td><td>Alomone Labs</td><td>C-270</td><td></td></tr><tr><td>4-Di-2-Asp</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>A Molecular Probes não é mais uma empresa. Agora encomendado através da Fisher</td></tr></tbody></table>

músculo levantador auris longus preparação para exame da transmissão neuromuscular mamíferos sob condições de grampo de tensão

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Este protocolo descreve uma técnica para gravar transmissão sináptica da junção neuromuscular sob condições de grampo-corrente e tensão-braçadeira. Uma preparação ex vivo do levantador auris longus (LAL) é usada porque é um fino músculo que proporciona fácil visualização da junção neuromuscular por empalamento microeléctrodo do motor placa terminal. Este método permite a gravação dos potenciais de placa terminal em miniatura espontânea e correntes (pptm e mEPCs), os potenciais de placa terminal evocado-nervo e correntes (EPPs e EPCs), bem como as propriedades de membrana da placa terminal motor. Resultados obtidos com este método incluem o conteúdo quantal (QC), número de sítios de liberação de vesículas (n), a probabilidade de liberação de vesículas (prel), facilitação sináptica e depressão, bem como a constante de tempo de membrana do músculo (τ m) e resistência de entrada. Aplicação desta técnica para modelos do rato da doença humana pode destacar as principais patologias nos Estados de doença e ajudar a identificar estratégias de tratamento de novela. Apertando totalmente tensão-uma única sinapse, este método fornece uma das análises mais detalhadas da transmissão sináptica atualmente disponível.

A Figura 8 mostra um exemplo dos pulsos de corrente (Figura 8A) e as respostas de tensão (Figura 8B) de uma fibra de leite sob corrente-braçadeira de um selvagem de 12 semanas de idade tipo R6/2 do rato. A presença de pptm indica que esses registros foram retirados do motor placa terminal. Os registros foram obtidos em soro fisiológico normal. Esses registros de corrente-braçadeira podem ser analisad...

O protocolo descrito neste artigo usa o músculo levator auris longus (LAL) de rato para gravar espontânea e nervo-evocou potenciais pós-sinápticos (corrente-braçadeira) e correntes (tensão-braçadeira) na junção neuromuscular. Uso desta técnica pode fornecer insights-chave nos mecanismos de transmissão sináptica sob condições normais e doença.

Músculo levantador Auris Longus Preparação para exame da transmissão Neuromuscular mamíferos sob condições de grampo de tensão

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar o músculo levantador do longo do auro e seu nervo, a fim de registrar as correntes sinápticas na junção muscular neural. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na fisiologia sináptica, como o tamanho da corrente da placa terminal, o conteúdo quântico, a probabilidade de liberação e as relações entre neurotransmissão e excitabilidade muscular. A principal vantagem desta técnica é que os registros eletrofisiológicos detalhados de uma única sinapse podem ser facilmente combinados com experimentos ópticos de células vivas.Embora esse método possa fornecer informações sobre a função sináptica e a comunicação de feedback entre nervo e músculo, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, desde drosófilas a mamíferos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a preparação do músculo nervoso dos mamíferos é frágil, principalmente o nervo. Adquirir e interpretar cuidadosamente os dados subsequentes do grampo de tensão também pode ser um desafio.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora se for executada corretamente. Demonstrando o procedimento estará Steve Burke do meu laboratório. Par

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Neurociência

Aqui nós descrevemos métodos eletrofisiológicos para medir a transmissão sináptica na junção neuromuscular de larva Drosophila. Liberação evocada é iniciado artificialmente estimulando os axônios do neurônio motor ea transmissão através do MNJ pode ser medida pela resposta pós-sináptica evocado no músculo.

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Aplicação de eletrofisiologia às sinapses acessível fornece uma medida quantificável de atividade sináptica, útil na análise de mutantes sináptica. Este artigo descreve um método de dissecação usada para expor as junções neuromusculares (MNJ)...

Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

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Este método novo permite a gravação simultânea intracelular de um motoneurônio único adulto rato e a medição da força produzida por suas fibras musculares. A investigação combinado das propriedades eléctricas e mecânicas das unidades motoras em animais normais e geneticamente modificadas é um avanço para o estudo do sistema neuromuscular.

Gravação Intracelular simultânea de um motoneurônio lombar e a força produzida pelo seu motor no Rato Adulto<em&gt; Em vivo</em

Uma avaliação funcional da junção neuromuscular (JNM) pode fornecer informações essenciais sobre a comunicação entre o músculo e do nervo. Aqui descrevemos um protocolo para avaliar exaustivamente o músculo e o MNJ funcionalidade usando duas preparações diferentes de nervo-músculo, ou seja, sóleo-isquiático e frênico-diafragma.

Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

Técnicas de excitabilidade axonal fornecem uma poderosa ferramenta para examinar a fisiopatologia e alterações biofísicas que precedem eventos degenerativas irreversíveis. Este manuscrito demonstra a utilização destas técnicas no nervo ulnar de ratos anestesiados.

Na Vivo Medida eletrofisiológica do nervo Ulnar rato com teste de excitabilidade Axonal

O protocolo descreve o método de carregar um corante de cálcio fluorescente através do nervo cortado em terminais nervosos motores do rato. Além disso, é apresentado um método único para o registro de transintes rápidos de cálcio nas terminações nervosas periféricas usando microscopia confocal.

Registro de Transintes de Cálcio na Junção Neuromuscular do Rato com Alta Resolução Temporal utilizando Microscopia Confocal

Aqui, apresentamos um protocolo que combina eletroporação in vivo e desnervação do músculo levantador do auro longo do crânio (LAL). Este procedimento permite o estudo do papel potencial das proteínas derivadas do músculo na regeneração da sinapse neuromuscular.

Eletroporação In Vivo Combinada e Reinervação de Curto Prazo do Músculo Esquelético do Elevador do Crânio Longo do Auris

A eletrofisiologia dinâmica do clamp pode estabelecer ligações causais entre déficits de disparo neuronal e disfunção do canal iônico. Descrevemos métodos e protocolos de grampo dinâmico em neurônios de Purkinje cerebelares de camundongos, observando recursos úteis e considerações técnicas. Em um estudo representativo, adicionamos condutância de sódio modelada aos neurônios Tsc1-/- Purkinje para resgatar disparos repetitivos.

Métodos dinâmicos de grampo para investigar a excitabilidade neuronal prejudicada associada ao autismo

Aprenda a isolar o músculo levantador da orelha longa e seu nervo em camundongos para registrar correntes sinápticas na junção neuromuscular. Este método permite estudos detalhados de neurotransmissão em condições fisiológicas e patológicas.

Músculo levantador Auris Longus Preparação para exame da transmissão Neuromuscular mamíferos sob condições de grampo de tensão

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