Name: Músculo levantador Auris Longus Preparação para exame da transmissão Neuromuscular mamíferos sob condições de grampo de tensão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a isolar o músculo levantador da orelha longa e seu nervo em camundongos para registrar correntes sinápticas na junção neuromuscular. Este método permite estudos detalhados de neurotransmissão em condições fisiológicas e patológicas.

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Agradecemos Dr. Mark M. Rich e Daniel Miranda Comentários editoriais, Ahmad Khedraki para ajudar a estabelecer essa técnica e Wright State University, para apoio financeiro (fundo de inicialização para A.A.V.).

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui descrito é a preparação e uso do mouse músculo LAL para a medição da transmissão neuromuscular sob condições de tensão ou corrente --braçadeira. Há vários pontos importantes a considerar para a dissecar o LAL. Limpar o excesso de tecido conjuntivo das aids de músculo em empalamento de eletrodo, como os eletrodos pode snag o tecido conjuntivo quando posicionando-os por empalamento. No entanto, só remover o tecido conjuntivo que pode ser retirado facilmente para limitar as chances de danificar o músculo. O isolamento ...

Estudando a transmissão sináptica na junção neuromuscular fornece insights sobre a relação dinâmica entre os sistemas musculares, nervosos e esqueléticos e é um excelente modelo para analisar a fisiologia sináptica. O músculo levantador auris longus (LAL) é um músculo fino, permitindo às junções neuromusculares ser facilmente visualizado. Relatórios anteriores descreveram a conveniência de usar o leite para examinar as toxinas e drogas sinápticas e caracterizaram as características do tipo de fibra de músculo esquelético da LAL1,2. Numerosos estudos têm usado o LAL para examinar a fisiologia neuromuscular3,4,5,6,7,8. Para eletrofisiologia, a capacidade de observar facilmente as junções neuromusculares LAL permite a colocação exata de microeletrodos na placa terminal motor e reduz problemas de braçadeira espaço na gravação de transmissão sináptica. Corrente-braçadeira gravações das propriedades da membrana muscular, tais como a constante de tempo de membrana (τm) e resistência de entrada (Rem) são facilmente obtidas. Além disso, essas propriedades podem ser medidas de fibras musculares mesmas usadas para gravar a transmissão neuromuscular, permitindo uma comparação direta da função sináptica para as propriedades da membrana muscular. A análise destes dados pode fornecer insights-chave nos mecanismos físicos de muitas doenças neuromusculares e Estados de atividade alterada.
Um aspecto fundamental da técnica descrita aqui é a utilização de tensão-braçadeira para gravações sinápticas, que não estão sujeitos as não-linearidades encontradas na corrente-braçadeira e são independentes das propriedades da membrana muscular. Vantagens do uso de tensão-braçadeira em oposição à corrente-braçadeira para examinar a transmissão neuromuscular foram estabelecidas pelo pioneiro esforços na década de 19509. Sob corrente-braçadeira, EPPs que excederem 10-15 mV em amplitude não são um produto linear da amplitude pptm.9. Por exemplo, se o pptm média é 1 mV, uma EPP de 5 mV pode-se supor para ser o produto de 5 pptm (QC de 5); Considerando que, uma EPP de 40 mV será o produto de mais de 40 pptm. Essa não-linearidade no maiores EPPs ocorre porque a força motriz para o PPE, que é a diferença entre o potencial de membrana e o potencial de equilíbrio para o receptor de acetilcolina (~ -10 mV), diminui substancialmente durante grandes EPPs. Esse problema é evitado em experimentos de tensão-braçadeira não altera o potencial de membrana muscular durante experimentos de tensão-braçadeira. Uma desvantagem é que os experimentos de tensão-braçadeira são tecnicamente mais difícil do que a gravação de grampo-corrente. Com isto em mente, McLachlan e Martin desenvolveram uma correção de matemática simples que é responsável por não-linearidades em gravações de corrente-braçadeira de EPPs10. As correções funcionam bem11,12,13, mas importante, assumem que as propriedades da membrana muscular não foram interrompidas.
As propriedades da membrana muscular são especialmente importantes para considerar se a estudar as condições ou Estados de doença que perturbam o músculo. Por exemplo, o músculo esquelético do R6/2 modelo transgênico da doença de Huntington é hyperexcitable devido a uma redução progressiva no descanso de cloreto e potássio correntes14,15. Como consequência, pptm e EPPs são amplificados em músculo esquelético R6/2. Certamente, fatores adicionais podem alterar pptm e EPPs. Trabalhar com um modelo diferente de ratos a doença de Huntington (R6/1) encontrou alterações em EPPs que parecem estar relacionados com proteínas SNARE8. Para avaliar os mecanismos causando alterações de transmissão neuromuscular, seria benéfico eliminar os efeitos das propriedades de membrana muscular alterado usando uma tensão-braçadeira. Em um estudo recente, a transmissão neuromuscular R6/2 foi estudada em ambas as condições de corrente e tensão-braçadeira usando a técnica descrita neste documento. A totalidade das placas terminais motor foram tensão-fixada com menos do que 1% de erro, colocando dois microeletrodos dentro constante do comprimento da placa terminal16. Ele foi mostrado aquela tensão-braçadeira e corrigida registros de corrente-braçadeira rendidos medições contrastantes da transmissão neuromuscular no músculo R6/2. Isto ressalta que pode ser difícil corrigir EPPs não-linearidades se alteraram-se as propriedades da membrana muscular e mostra os benefícios de se obter registros de tensão-braçadeira independentes das propriedades da membrana muscular. O protocolo apresentado neste documento é ideal para examinar as condições ou Estados de doenças que afetam a transmissão sináptica e as propriedades da membrana pós-sináptica.

<table><tbody><tr><td>Microscópio Composto Olympus</td><td></td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>10x Objetiva</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>40x Objetiva</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de Borosilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>Santa Barbara Instruments Group</td><td>ST-7XMEI</td><td></td></tr><tr><td>Mater-9 Pulse Gerador</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iso-flex Stimulus Isolator</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 Software de Aquisição e Análise de Dados</td><td>Molecular Devices</td><td>1-2500-0180</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodo Bipolar Concêntrico</td><td>FHC</td><td>CBDSH75</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador de Junta Esférica</td><td>Narishige&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringas não metálicas 34 Gauge</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>No. 2 Fórceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5Q41</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecação Tesoura</td><td>Roboz</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de Elastômero de Silicone</td><td>Dow Corning</td><td>2404019862</td><td></td></tr><tr><td>Creme de Depilação</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grass SD9 Estimulador</td> de <td>Grama Modelo Médico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-1000 Extrator de Micropipeta</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Axônio Digidata 1550 Sistema de Acuisição de Dados de Baixo Ruído</td><td>Instrumentos</td><td></td><td></td>Molecular</tr><tr><td>Pass Bessell Filter</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador Canhoto</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DL</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador destro</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DR</td><td></td></tr><tr><td>Único Controlador de Movimento</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MC100e</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador de Rolos Cruzados</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641R</td><td>Isso foi adicionado ao eixo Z dos micromanipuladores para canhotos e destros para permitir que o eixo z seja motorizado. Essa configuração personalizada é mais barata e menos volumosa do que comprar um micromanipulador motorizado de 4 eixos. Também nos permite controlar ambos os micromanipuladores com um controlador</td></tr><tr><td>Todos os produtos químicos foram encomendados da Fisher, exceto,</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>BTS</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B315190</td><td></td></tr><tr><td>CTX</td><td>Alomone Labs</td><td>C-270</td><td></td></tr><tr><td>4-Di-2-Asp</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>A Molecular Probes não é mais uma empresa. Agora encomendado através da Fisher</td></tr></tbody></table>

músculo levantador auris longus preparação para exame da transmissão neuromuscular mamíferos sob condições de grampo de tensão

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Este protocolo descreve uma técnica para gravar transmissão sináptica da junção neuromuscular sob condições de grampo-corrente e tensão-braçadeira. Uma preparação ex vivo do levantador auris longus (LAL) é usada porque é um fino músculo que proporciona fácil visualização da junção neuromuscular por empalamento microeléctrodo do motor placa terminal. Este método permite a gravação dos potenciais de placa terminal em miniatura espontânea e correntes (pptm e mEPCs), os potenciais de placa terminal evocado-nervo e correntes (EPPs e EPCs), bem como as propriedades de membrana da placa terminal motor. Resultados obtidos com este método incluem o conteúdo quantal (QC), número de sítios de liberação de vesículas (n), a probabilidade de liberação de vesículas (prel), facilitação sináptica e depressão, bem como a constante de tempo de membrana do músculo (τ m) e resistência de entrada. Aplicação desta técnica para modelos do rato da doença humana pode destacar as principais patologias nos Estados de doença e ajudar a identificar estratégias de tratamento de novela. Apertando totalmente tensão-uma única sinapse, este método fornece uma das análises mais detalhadas da transmissão sináptica atualmente disponível.

A Figura 8 mostra um exemplo dos pulsos de corrente (Figura 8A) e as respostas de tensão (Figura 8B) de uma fibra de leite sob corrente-braçadeira de um selvagem de 12 semanas de idade tipo R6/2 do rato. A presença de pptm indica que esses registros foram retirados do motor placa terminal. Os registros foram obtidos em soro fisiológico normal. Esses registros de corrente-braçadeira podem ser analisad...

O protocolo descrito neste artigo usa o músculo levator auris longus (LAL) de rato para gravar espontânea e nervo-evocou potenciais pós-sinápticos (corrente-braçadeira) e correntes (tensão-braçadeira) na junção neuromuscular. Uso desta técnica pode fornecer insights-chave nos mecanismos de transmissão sináptica sob condições normais e doença.

Músculo levantador Auris Longus Preparação para exame da transmissão Neuromuscular mamíferos sob condições de grampo de tensão

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar o músculo levantador do longo do auro e seu nervo, a fim de registrar as correntes sinápticas na junção muscular neural. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na fisiologia sináptica, como o tamanho da corrente da placa terminal, o conteúdo quântico, a probabilidade de liberação e as relações entre neurotransmissão e excitabilidade muscular. A principal vantagem desta técnica é que os registros eletrofisiológicos detalhados de uma única sinapse podem ser facilmente combinados com experimentos ópticos de células vivas.Embora esse método possa fornecer informações sobre a função sináptica e a comunicação de feedback entre nervo e músculo, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, desde drosófilas a mamíferos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a preparação do músculo nervoso dos mamíferos é frágil, principalmente o nervo. Adquirir e interpretar cuidadosamente os dados subsequentes do grampo de tensão também pode ser um desafio.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora se for executada corretamente. Demonstrando o procedimento estará Steve Burke do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, sob um microscópio de dissecação estéreo, faça uma pequena incisão na pele nas costas do camundongo ao nível das escápulas.Use uma tesoura de microdissecação. Corte a pele sobre a cabeça e as costas. Em seguida, puxe a pele ao longo da incisão perto das escápulas.Corte os músculos inferiores ao LAL começando pela escápula direita. Em seguida, levante suavemente o tecido cortado imediatamente para a direita da linha média. Faça um corte em direção à orelha esquerda com as lâminas da tesoura pressionadas contra o crânio para remover várias camadas de músculo que são inferiores ao LAL esquerdo.Evite cortar o nervo que inerva o LAL que envolve o canal auditivo e entra nos músculos do lado medial da orelha. Continue cortando o canal auditivo, mantendo o máximo possível do nervo conectado. Em seguida, corte o tecido adiposo atrás do canal auditivo ao longo da porção ventrolateral da orelha.Corte ao longo da escápula esquerda semelhante aos procedimentos feitos no lado direito para remover completamente o músculo do mouse. Em seguida, corte o pavilhão auricular da orelha ao longo da base, deixando a parte cartilaginosa da orelha presa ao LAL. Vire o músculo para que o lado inferior fique voltado para cima.Para isolar o músculo LAL, coloque o LAL e o tecido circundante em uma placa de Petri com um fundo de elastômero de silicone e prenda o tecido dissecado no fundo. Lave o tecido frequentemente em uma solução salina fisiológica. Em seguida, coloque um pino de inseto no canal auditivo para manter a preparação no lugar.Usando pinos menores, prenda o tecido restante no lado oposto da linha média do LAL. Use um par de pinças. Puxe suavemente a pele para cima na parte lateral da orelha para esticar o músculo e coloque um pequeno alfinete na pele.Repita esta etapa até que o tecido esteja bem preso ao prato. Remova os músculos que estão cobrindo o LAL e aqueles ligados ao LAL por meio de tecido conjuntivo e estão especialmente tensos perto da linha média. Em seguida, puxe a camada muscular sobrejacente e corte o tecido conjuntivo com as lâminas orientadas para a camada muscular que está sendo puxada.Corte em direção à linha média até cerca de 3/4 do caminho até a linha média e continue removendo as camadas musculares até que apenas o LAL permaneça. Durante o processo de limpeza, certifique-se de que os nervos não estejam danificados. Em seguida, remova parte do tecido conjuntivo restante que está cobrindo o LAL para ajudar no empalamento dos eletrodos.Remova apenas o tecido que pode ser feito facilmente sem risco de danificar o LAL no processo. Para identificar o nervo que inerva o LAL, usando um estimulador de nervo, toque os nervos com o estimulador de nervo. Quando o músculo se contrai, o nervo correto foi identificado.Em seguida, segure cuidadosamente o tecido perto do nervo e use uma tesoura de mola para separar o nervo do tecido ao redor da orelha. Para minimizar os danos, mantenha a maior parte do nervo embutido em algum tecido circundante que será usado posteriormente para prender o nervo ao prato de registro. Nesse ponto, o investigador pode fazer uma pausa de uma hora, desde que o LAL seja banhado em 20 mililitros ou mais de uma solução salina fisiológica.Em seguida, solte e transfira o músculo para uma inserção de platina sob o microscópio de dissecção para experimentos de eletrofisiologia. Prenda o músculo nas extremidades e ao longo de sua borda. Posicione o nervo perpendicular às fibras musculares e prenda-o no fundo do prato através de algum excesso de tecido que foi deixado intacto no final do nervo.Mantenha o tecido banhado em uma solução salina fisiológica o tempo todo. Para experimentos de eletrofisiologia, prenda a câmara de perfusão com o LAL ao microscópio stage. Coloque o eletrodo de referência em um copo cheio de cloreto de potássio trimolar que é conectado à câmara de registro por meio de uma ponte de ágar.Neste ponto, posicione o eletrodo estimulador do nervo no nervo. Exponha a preparação LAL a 4-Di-2-Asp por 10 minutos para obter uma florescência adequada para visualização da junção neuromuscular. Após 10 minutos, troque a solução de 4-Di-2-Asp pela solução de cálcio normal.Enquanto isso, encha os capilares de vidro com as soluções apropriadas para os eletrodos de detecção de tensão e passagem de corrente. Bata suavemente no capilar para remover quaisquer bolhas de ar e prenda o capilar cheio no suporte do eletrodo no headstage. Usando um microscópio vertical com iluminação padrão de campo brilhante e florescência, procure uma faixa brilhante de junções neuromusculares verdes fluorescentes perpendiculares às fibras musculares ao longo da preparação com uma objetiva de imersão em água de baixa ampliação.Em seguida, mude para uma objetiva de imersão em água de maior ampliação para identificar uma junção neuromuscular na camada superior do músculo para examinar com eletrofisiologia. Usando principalmente campo claro, posicione o eletrodo acima da membrana muscular dentro de 100 mícrons da junção neuromuscular identificada. Esta figura mostra um exemplo dos pulsos de corrente e das respostas de tensão de uma fibra LAL sob pinça de corrente de um camundongo R62 do tipo selvagem de 12 semanas.Os registros foram obtidos em solução salina fisiológica normal e a presença de mEPPs indica que esses registros foram retirados da placa motora. Aqui está uma gravação representativa de um EPC e dois mEPCs obtidos sob condição de grampo de tensão. Esta figura mostra os EPCs e mEPCs sobrepostos de uma fibra representativa.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como imagens de células vivas com corantes de membrana, como FM143 ou histologia, podem ser realizados para responder a perguntas relacionadas à captação de liberação de vesículas ou alterações morfológicas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da fisiologia explorarem a transmissão sináptica e a comunicação entre células nervosas e organismos que vão desde drosófilas a mamíferos.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar o músculo elevador do auro longo inervado para registrar as correntes sinápticas na junção neuromuscular. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de tomar muito cuidado ao remover o tecido muscular adjacente ao LAL e isolar o nervo.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós descrevemos métodos eletrofisiológicos para medir a transmissão sináptica na junção neuromuscular de larva Drosophila. Liberação evocada é iniciado artificialmente estimulando os axônios do neurônio motor ea transmissão através do MNJ pode ser medida pela resposta pós-sináptica evocado no músculo.

Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila

Aplicação de eletrofisiologia às sinapses acessível fornece uma medida quantificável de atividade sináptica, útil na análise de mutantes sináptica. Este artigo descreve um método de dissecação usada para expor as junções neuromusculares (MNJ)...

Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião

O músculo da perna opener crustáceo é apresentado por sua importância histórica e versatilidade experimental no fenótipo muscular, fisiologia e plasticidade sináptica.

Ver histórico e demonstração Fisiologia da MNJ da Muscle Opener Crayfish

Descrevemos os procedimentos para a administração repetida de inibidores da sinalização muscarínicos ao longus levantador auris (LAL) muscular de ratos adultos jovens e para a imunocoloração subseqüente de sua junções neuromusculares (NMJs) em wholemounts. O músculo LAL tem vantagens exclusivas para...

A administração subcutânea de antagonistas muscarínicos e Triple-A imunocoloração do músculo Longus Levator Auris em Ratos

Este método novo permite a gravação simultânea intracelular de um motoneurônio único adulto rato e a medição da força produzida por suas fibras musculares. A investigação combinado das propriedades eléctricas e mecânicas das unidades motoras em animais normais e geneticamente modificadas é um avanço para o estudo do sistema neuromuscular.

Gravação Intracelular simultânea de um motoneurônio lombar e a força produzida pelo seu motor no Rato Adulto<em&gt; Em vivo</em

Uma avaliação funcional da junção neuromuscular (JNM) pode fornecer informações essenciais sobre a comunicação entre o músculo e do nervo. Aqui descrevemos um protocolo para avaliar exaustivamente o músculo e o MNJ funcionalidade usando duas preparações diferentes de nervo-músculo, ou seja, sóleo-isquiático e frênico-diafragma.

Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

Técnicas de excitabilidade axonal fornecem uma poderosa ferramenta para examinar a fisiopatologia e alterações biofísicas que precedem eventos degenerativas irreversíveis. Este manuscrito demonstra a utilização destas técnicas no nervo ulnar de ratos anestesiados.

Na Vivo Medida eletrofisiológica do nervo Ulnar rato com teste de excitabilidade Axonal

O protocolo descreve o método de carregar um corante de cálcio fluorescente através do nervo cortado em terminais nervosos motores do rato. Além disso, é apresentado um método único para o registro de transintes rápidos de cálcio nas terminações nervosas periféricas usando microscopia confocal.

Registro de Transintes de Cálcio na Junção Neuromuscular do Rato com Alta Resolução Temporal utilizando Microscopia Confocal

Aqui, apresentamos um protocolo que combina eletroporação in vivo e desnervação do músculo levantador do auro longo do crânio (LAL). Este procedimento permite o estudo do papel potencial das proteínas derivadas do músculo na regeneração da sinapse neuromuscular.

Eletroporação In Vivo Combinada e Reinervação de Curto Prazo do Músculo Esquelético do Elevador do Crânio Longo do Auris

A eletrofisiologia dinâmica do clamp pode estabelecer ligações causais entre déficits de disparo neuronal e disfunção do canal iônico. Descrevemos métodos e protocolos de grampo dinâmico em neurônios de Purkinje cerebelares de camundongos, observando recursos úteis e considerações técnicas. Em um estudo representativo, adicionamos condutância de sódio modelada aos neurônios Tsc1-/- Purkinje para resgatar disparos repetitivos.

Métodos dinâmicos de grampo para investigar a excitabilidade neuronal prejudicada associada ao autismo

Aprenda a isolar o músculo levantador da orelha longa e seu nervo em camundongos para registrar correntes sinápticas na junção neuromuscular. Este método permite estudos detalhados de neurotransmissão em condições fisiológicas e patológicas.

Músculo levantador Auris Longus Preparação para exame da transmissão Neuromuscular mamíferos sob condições de grampo de tensão

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