Ablação de uma população Neuronal, usando um Laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de Zebrafish

O objetivo geral deste experimento é testar o efeito da ablação a laser de certos neurônios na atividade e no comportamento do circuito. Com esta técnica experimental, podemos examinar a necessidade de neurônios em um circuito subjacente ao comportamento. Este método pode ajudar a responder às nossas principais questões no campo do comportamento e da neurociência, como a forma como a presa é percebida e como o comportamento capturado pela presa é gerado pela atividade neural.

A principal vantagem dessa técnica é que os neurônios podem ser especificamente ablacionados devido à marcação genética desses neurônios e também à alta resolução espacial do laser. Depois de criar as larvas e montá-las em agarose de baixo ponto de fusão a 2% de acordo com o protocolo de texto, coloque as larvas embutidas em agarose sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons e inicie o sistema de microscopia. Abra o software de aquisição de imagem e, na guia do laser, clique no botão liga para ligar o laser.

Aguarde até que o status do laser mude de ocupado para modo bloqueado. Na guia canais, defina o comprimento de onda do laser para 880 nanômetros para ablação EGFP ou 800 nanômetros para ablação GCaMP. Selecione a lente subjetiva 20X movendo manualmente o revólver da lente.

Em seguida, clique na guia localizar, clique em GFP para alterar os caminhos ópticos e visualizar diretamente a fluorescência a olho nu. Centralize o cérebro da larva do peixe-zebra no campo de visão e clique na guia de aquisição para voltar à microscopia de dois fótons e definir a potência e o ganho do laser. Como um registro da condição antes da ablação, clique em Pilha Z para selecionar a opção Pilha Z.

Então, depois de focar na extremidade ventral do cérebro larval, clique no primeiro botão definir para definir o limite inferior e depois de focar na superfície mais dorsal do cérebro, clique no último botão definir para definir o limite superior. Por fim, clique no botão iniciar experimento para executar a aquisição de imagem da pilha Z. Em seguida, selecione a lente subjetiva 63X movendo manualmente o revólver da lente.

Em seguida, clique na guia localizar para alternar para a microscopia de epifluorescência. Centralize as células a serem ablacionadas pelo olho e clique na guia de aquisição para voltar à microscopia de varredura a laser. Na guia do modo de aquisição, defina o tamanho do quadro para 256 por 256.

Clique ao vivo e observe os neurônios de interesse. Então, começando pelo lado mais dorsal, encontre um plano focal no qual as células a serem abladas estejam em foco. Usando a função de regiões, marque uma pequena área circular com cerca de 1/3 do tamanho da célula em diâmetro em cada neurônio como uma ROI.

Defina a velocidade de varredura para 13,9 segundos por 256 por 256 pixels, o que corresponde a um tempo de permanência do laser de aproximadamente 200 microssegundos por pixel ou 200 microssegundos por meio mícron. Além disso, defina o ciclo de iteração para quatro repetições. Clique em iniciar experimento para executar as funções de série temporal e branqueamento.

Compare a imagem antes da ablação com a imagem após a ablação no ciclo da série temporal para garantir que a fluorescência nas células-alvo tenha desaparecido. Em seguida, mova o plano focal um pouco mais fundo e escolha o próximo plano focal onde as células não abladas aparecem. Execute a função de branqueamento como acabamos de demonstrar e repita o processo até que todas as células da estrutura neural de interesse tenham sido abladas.

Após a ablação, verifique as células quanto à fluorescência abolida e repita a irradiação do laser, se necessário. Após a irradiação, as larvas precisam ser recuperadas. Faça cuidadosamente pequenos cortes perpendiculares na agarose ao redor das larvas.

Em seguida, espere que o peixe nade para fora da agarose por conta própria quando o anestésico passar. Depois de cultivar paramécia e anestesiar uma larva de peixe-zebra de acordo com o protocolo de texto, coloque as larvas em agarose de baixo ponto de fusão a 2% e remova imediatamente qualquer excesso de agarose para que a superfície da agarose pareça ligeiramente convexa. Usando uma agulha de dissecação, oriente rapidamente as larvas na posição vertical.

Em seguida, usando uma faca cirúrgica, faça alguns pequenos cortes na agarose para remover a agarose ao redor da cabeça do peixe-zebra, o que abre espaço para o paramécio nadar. Remova cuidadosamente a agarose residual despejando suavemente a água do sistema na câmara. Em seguida, coloque um paramécio na câmara de gravação para servir como estímulo visual.

Em seguida, coloque a câmara de gravação sob um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera CMOS científica e selecione uma lente objetiva de 2,5X. Inicie o aplicativo de aquisição de imagem para a câmera equipada. Clique no painel de sequência e selecione o registro do disco rígido no painel.

Na seção de configuração de varredura, defina a contagem de quadros para 900 ou qualquer outro número total de quadros desejado. No painel de captura, defina o tempo de exposição em 30 milissegundos e o compartimentalização como dois por dois. Clique ao vivo no painel de captura para localizar as larvas na visualização e foco da câmera e, em seguida, clique em parar ao vivo e clique no botão Iniciar.

Salve o filme no formato cxd e analise os dados de acordo com o protocolo de texto. Depois de configurar o sistema de registro comportamental e colocar uma larva em uma câmara de gravação de acordo com o protocolo de texto, use uma micropipeta para coletar 50 paramécios e colocá-los na câmara de gravação. Para colocar uma lamínula em cima da câmara de gravação, coloque uma pequena gota de água na lamínula antes de colocá-la na superfície da água da câmara de gravação para evitar a introdução de ar na câmara.

Coloque a câmara de gravação no sistema de iluminação. Em seguida, inicie a gravação de lapso de tempo a 10 quadros por segundo por 11 minutos. Por fim, realizar a análise de acordo com o protocolo de texto.

Neste experimento com a linha Gal4 que rotula núcleos na área pré-tectal e uma subpopulação de neurônios do bulbo olfatório. Os neurônios pré-tectais foram ablacionados a laser bilateralmente. Os neurônios olfatórios foram ablacionados como controle.

Os resultados mostram que o laser de dois fótons pode ablar as células-alvo, deixando os neuritos adjacentes inalterados. Neste experimento, a conectividade funcional de neurônios pré-tectais que projetam seus axônios em direção ao ILH ipsilateralmente foi investigada. Tanto o pretectum quanto o ILH mostraram atividade neuronal na presença proximal da presa, sugerindo que ambas as atividades neuronais são visualmente conduzidas.

A imagem de cálcio também foi usada para observar a atividade neuronal no pré-tecto e o ILH em larvas de ablação de neurônios pré-tectais. O pré-teto esquerdo que foi ablacionado a laser mostrou atividade neuronal residual ou inexistente. Além disso, a ILH ipsilateral exibiu atividade neuronal dramaticamente deslocada, sugerindo que a principal entrada para a ILH vem do pretectum ipsilateral.

Em contraste, a ILH do outro lado do pré-teto ablacionado a laser mostrou atividade neuronal comparável à atividade neuronal no pré-teto ipsilateral, o que sugere que a ILH direita está recebendo informações do pré-teto direito. Uma vez dominada, a ablação a laser pode ser feita em cerca de uma hora para cada larva de peixe-zebra. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ablação apenas dos neurônios-alvo com irradiação a laser adequada, evitando danos causados pelo calor pelo laser.

Após este procedimento, a ablação de neurônios em outras áreas do cérebro, como prosencéfalo ou rombencéfalo, pode ser realizada para responder a perguntas adicionais, como como esses neurônios estão envolvidos nas funções cognitivas ou motoras. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência comportamental explorarem circuitos neurais funcionais em modelos de peixe-zebra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como ablação específica de neurônios no cérebro das larvas do peixe-zebra e avaliar as consequências funcionais e comportamentais.

Não se esqueça de que trabalhar com um laser pode ser extremamente perigoso e sempre cumpra as instruções do fabricante ao realizar este procedimento.