Name: Ablação de uma população Neuronal, usando um Laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprenda a ablação de neurônios pré-tectais usando laser de dois fótons em larvas de Danio rerio. Este método permite estudar circuitos neurais e comportamentos de captura de presas com alta resolução espacial.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Estes estudos foram financiados por subvenções recebidas do MEXT, JSPS KAKENHI Grant números JP25290009, JP25650120, JP17K07494 e JP17H05984.

<ol><li>Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+whole+picture%3A+A+comprehensive+imaging+approach+to+functional+mapping+of+circuits+in+behaving+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish.</a> Neuroscience. 296, 26-38 (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+visualization+with+an+improved+GCaMP+calcium+indicator+reveals+spatiotemporal+activation+of+the+spinal+motor+neurons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).</li>
<li>Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+space+cadet+gene+controls+axonal+pathfinding+of+neurons+that+modulate+fast+turning+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements.</a> Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).</li>
<li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li>
<li>Sternberg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Neurotoxin+to+Investigate+the+Contribution+of+Excitatory+Interneurons+to+Speed+Modulation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo.</a> Curr Biol. , (2016).</li>
<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li>
<li>Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+visually+guided+behavior+by+distinct+populations+of+spinal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons.</a> Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).</li>
<li>Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+projection+neurons+control+turning+behaviors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish.</a> Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).</li>
<li>Smear, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+glutamate+transport+at+a+central+synapse+limits+the+acuity+of+visual+perception+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish.</a> Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).</li>
<li>Bianco, I. H., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visuomotor+transformations+underlying+hunting+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish.</a> Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).</li>
<li>Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+driven+chaining+of+elementary+swim+patterns+into+a+goal-directed+motor+sequence%3A+a+virtual+reality+study+of+zebrafish+prey+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture.</a> Front Neural Circuits. 7, 86(2013).</li>
<li>Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2D+virtual+reality+system+for+visual+goal-driven+navigation+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae.</a> Sci Rep. 6, 34015(2016).</li>
<li>Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+neuronal+activity+during+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of neuronal activity during perception.</a> Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).</li>
<li>Del Bene, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtering+of+visual+information+in+the+tectum+by+an+identified+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit.</a> Science. 330 (6004), 669-673 (2010).</li>
<li>Semmelhack, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dedicated+visual+pathway+for+prey+detection+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish.</a> Elife. 3, 04878(2014).</li>
<li>Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+object+size+in+retinotectal+microcircuits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Classification of object size in retinotectal microcircuits.</a> Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).</li>
<li>Romano, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Neuronal+Network+Dynamics+Reveal+Circuit%27s+Functional+Adaptations+for+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior.</a> Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).</li>
<li>Barker, A. J., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+decision+making+in+the+zebrafish+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum.</a> Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).</li>
<li>Ewert, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783642675027">Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior</a>. , Springer Verlag. (1980).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+hypothalamic+feeding+centre+upon+visual+prey+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection.</a> Nat Commun. 8, 15029(2017).</li>
<li>Muto, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+in+Free-Swimming+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>National BioResource Project Paramecium. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en">http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en</a> (2017).</li>
<li>Fiji. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://fiji.sc">https://fiji.sc</a> (2017).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Mueller, T., Wullimann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU-%2C+neuroD+%28nrd%29-+and+Hu-studies+reveal+unusual+non-ventricular+neurogenesis+in+the+postembryonic+zebrafish+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain.</a> Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+of+visual+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish.</a> PLoS Genet. 1 (5), 66(2005).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse para o relatório.

Embora os dois fotões do laser tem uma excelente resolução espacial para ablate especificamente neurônios individuais, cautela deve ser tomada para evitar danos indesejáveis no tecido do cérebro devido ao calor. O passo mais importante no experimento de ablação é determinar a quantidade ideal de irradiação do laser. Irradiação de insuficiente não consegue matar os neurônios. Muita irradiação será calor-danos no tecido circundante, o que irá resultar em efeitos indesejáveis. A gama óptima de irradiação do laser (áreas do ...

Para entender como o comportamento surge da atividade neuronal no cérebro, é necessário identificar os circuitos neurais envolvidos na geração desse comportamento. Na fase larval, o zebrafish fornece um modelo animal ideal para estudar a função do cérebro associada com o comportamento porque seus cérebros pequenos, transparentes tornam possível investigar a atividade neuronal em uma resolução de celular em uma ampla área da cérebro enquanto observa o comportamento1. Imagem de atividade neuronal em neurônios específicos tornou-se possível graças a invenção dos indicadores geneticamente codificado cálcio (Ca) (GECIs), tais como GCaMP2. GCaMP zebrafish transgênico tem provado para ser útil para associar o circuito neural funcional com comportamento através da realização de imagem Ca em comportar-se de animais3.
Enquanto a imagem de Ca pode demonstrar correlações entre a atividade neuronal e comportamento, para mostrar a causalidade, supressão da atividade neuronal e testar sua consequence(s) sobre o comportamento são passos importantes. Existem várias maneiras de conseguir isso: uso de mutação genética que altera os circuitos neurais específicos4, expressão de neurotoxinas em neurônios específicos5,6, uso de ferramentas de optogenetic como halorhodopsin7, e do laser ablação de neurônios alvo8,9. Ablação a laser é particularmente adequada para eliminar a atividade em um número relativamente pequeno de neurônios específicos. Facilita a eliminação irreversível da atividade neuronal, matando os neurônios avaliar consequências comportamentais.
Um comportamento interessante que pode ser observado na fase larval no zebrafish é a captura de presas (Figura 1A). Esse comportamento visualmente guiadas, objetivo-dirigido fornece um sistema experimental favorável para o estudo da acuidade visual10, transformação visuomotoras11,12,13, percepção visual e reconhecimento de objetos14,15,16,17,18e tomada de decisão19. Como presa é reconhecida por predadores e como a deteção da rapina leva a presa captura o comportamento tem sido uma questão central na neuroetologia20. Neste artigo, enfocamos o papel do circuito pretecto-hipotalâmico formado por projeções de um núcleo no pretectum (núcleo pretectalis superficial pars magnocellularis, daqui por diante, conhecido simplesmente como o pretectum) para a ilha. Ablação a laser do pretectum foi mostrado para reduzir a atividade de captura de presas e abolir a atividade neuronal na ilha que está associada com o de percepção visual presa21. Aqui, os protocolos para a realização de laser ablação e teste seu efeito usando imagens de Ca2 + e gravação comportamental no zebrafish larvas são descritas.

<table><tbody><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>Cat.#50080</td> placa <td>de Petri</td>de</tr><tr><td>agarose de 6 cm</td> de baixa temperatura <td>de fusão FALCON</td><td>Produto#:351007</td><td></td></tr><tr><td>agulha de dissecação</td><td>AS ONE Corporation</td><td>Cat. No. 2-013-01</td><td>https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142</td></tr><tr><td>LSM7MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td> microscópio <td>de varredura a laser de dois fótons</td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 63x/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>63X lente objetiva</td></tr><tr><td>Imager.Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>um microscópio de epifluorescência</td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Software de aquisição de imagem para microscópios confocais</td></tr><tr><td>Junta da Câmara de Hibridização Secure-Seal, 8 câmaras, 9 mm de diâmetro x 0,8 mm de profundidade</td><td>Sondas</td><td>Moleculares Catálogo # S-24732</td><td>Usado como câmara de gravação em câmaras de imagem Ca</td></tr><tr><td></td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5</td><td>Usado como uma faca cirúrgica de câmara de gravação comportamental</td></tr><tr><td></td><td>MANI</td><td>Faca oftálmica MST15</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Modelo de Hamamatsu Photonics</td><td>: C11440-22CU</td><td>uma câmera científica</td></tr><tr><td>HCImage</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>software de acuisition de imagem</td></tr><tr><td>Módulo de gravação de disco rígido</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>Um módulo de software que permite salvar os arquivos de filme em uma unidade de disco rígido em um curto espaço de tempo</td></tr><tr><td>SZX7</td><td>Olympus</td><td></td><td>estereoscópio</td></tr><tr><td>DF PL 0.5X</td><td>Olympus</td><td></td><td>lente objetiva para SZX7</td></tr><tr><td>Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio</td><td>FLIR Systems, Inc.</td><td>Nº do produto GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>CMOS</td></tr><tr><td>câmera XIMEA xiQ câmera</td><td>XIMEA Nº</td><td>do produto MQ042RG-CM</td><td>CMOS câmera</td></tr><tr><td>com anel LED luz</td><td></td><td>CCS Modelo: LDR2-100SW2-LA</td><td>Malha de nylon LED</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> branca <tr><td>32&micro; m</td><td>Tokyo Screen</td><td>N-No.380T</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Malha de nylon 13&micro; m</td><td>Tokyo Screen</td><td>N-No. 508T-K</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Metal seive 150 mícrons de abertura</td><td>Tokyo Screen</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>Metal seive 75 mícrons de abertura</td><td>Tokyo Screen</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>EBIOS</td><td>Asahi Food & Saúde, Co. Ltd.</td><td></td><td>fermento de cerveja seco</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>um ambiente de desenvolvimento integrado para programação</td></tr><tr><td>Mai-Tai HP</td><td>Spectra Physics&nbsp;</td><td></td><td>laser de dois fótons&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ablação de uma população neuronal, usando um laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de zebrafish

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Para identificar o papel de uma subpopulação de neurônios no comportamento, é essencial para testar as consequências do bloqueio de sua atividade em animais vivos. Remoção a laser de neurônios é um método eficaz para essa finalidade quando os neurônios são etiquetados seletivamente com sondas fluorescentes. No presente estudo, são descritos os protocolos para laser retirando uma subpopulação de neurônios usando um microscópio de dois fotões e testes de suas consequências funcionais e comportamentais. Neste estudo, o comportamento de captura de presas em larvas de zebrafish é usado como um modelo de estudo. O circuito pretecto-hipotalâmico é conhecido por fundamentam esta presa visualmente orientado, captura o comportamento. Zebrafish pretectum foram retirado de laser, e atividade neuronal no lobo inferior do hipotálamo (ilha; o alvo da projeção pretectal) foi examinada. Comportamento de captura de presas após ablação pretectal também foi testado.

Os neurônios específicos foram geneticamente rotulados com EGFP ou GCaMP6s, cuja expressão foram expulsos em linhas Gal4. Um gSAIzGFFM119B de linha de Gal4 foi usado para rotular um núcleo na área pretectal (núcleo pretectal superficial de magnocelular) e uma subpopulação de neurônios do bulbo olfatório. Outra linha de Gal4, hspGFFDMC76A, era usada para rotular a ilha. Nós do laser-retirado os neurônios pretectal bilateralmente (Figura 2 pain...

Aqui, apresentamos um protocolo para ablate uma subpopulação geneticamente rotulada de neurônios por um laser de dois fotões de larvas de peixe-zebra.

Ablação de uma população Neuronal, usando um Laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de Zebrafish

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

O objetivo geral deste experimento é testar o efeito da ablação a laser de certos neurônios na atividade e no comportamento do circuito. Com esta técnica experimental, podemos examinar a necessidade de neurônios em um circuito subjacente ao comportamento. Este método pode ajudar a responder às nossas principais questões no campo do comportamento e da neurociência, como a forma como a presa é percebida e como o comportamento capturado pela presa é gerado pela atividade neural.A principal vantagem dessa técnica é que os neurônios podem ser especificamente ablacionados devido à marcação genética desses neurônios e também à alta resolução espacial do laser. Depois de criar as larvas e montá-las em agarose de baixo ponto de fusão a 2% de acordo com o protocolo de texto, coloque as larvas embutidas em agarose sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons e inicie o sistema de microscopia. Abra o software de aquisição de imagem e, na guia do laser, clique no botão liga para ligar o laser.Aguarde até que o status do laser mude de ocupado para modo bloqueado. Na guia canais, defina o comprimento de onda do laser para 880 nanômetros para ablação EGFP ou 800 nanômetros para ablação GCaMP. Selecione a lente subjetiva 20X movendo manualmente o revólver da lente.Em seguida, clique na guia localizar, clique em GFP para alterar os caminhos ópticos e visualizar diretamente a fluorescência a olho nu. Centralize o cérebro da larva do peixe-zebra no campo de visão e clique na guia de aquisição para voltar à microscopia de dois fótons e definir a potência e o ganho do laser. Como um registro da condição antes da ablação, clique em Pilha Z para selecionar a opção Pilha Z.Então, depois de focar na extremidade ventral do cérebro larval, clique no primeiro botão definir para definir o limite inferior e depois de focar na superfície mais dorsal do cérebro, clique no último botão definir para definir o limite superior. Por fim, clique no botão iniciar experimento para executar a aquisição de imagem da pilha Z. Em seguida, selecione a lente subjetiva 63X movendo manualmente o revólver da lente.Em seguida, clique na guia localizar para alternar para a microscopia de epifluorescência. Centralize as células a serem ablacionadas pelo olho e clique na guia de aquisição para voltar à microscopia de varredura a laser. Na guia do modo de aquisição, defina o tamanho do quadro para 256 por 256.Clique ao vivo e observe os neurônios de interesse. Então, começando pelo lado mais dorsal, encontre um plano focal no qual as células a serem abladas estejam em foco. Usando a função de regiões, marque uma pequena área circular com cerca de 1/3 do tamanho da célula em diâmetro em cada neurônio como uma ROI.Defina a velocidade de varredura para 13,9 segundos por 256 por 256 pixels, o que corresponde a um tempo de permanência do laser de aproximadamente 200 microssegundos por pixel ou 200 microssegundos por meio mícron. Além disso, defina o ciclo de iteração para quatro repetições. Clique em iniciar experimento para executar as funções de série temporal e branqueamento.Compare a imagem antes da ablação com a imagem após a ablação no ciclo da série temporal para garantir que a fluorescência nas células-alvo tenha desaparecido. Em seguida, mova o plano focal um pouco mais fundo e escolha o próximo plano focal onde as células não abladas aparecem. Execute a função de branqueamento como acabamos de demonstrar e repita o processo até que todas as células da estrutura neural de interesse tenham sido abladas.Após a ablação, verifique as células quanto à fluorescência abolida e repita a irradiação do laser, se necessário. Após a irradiação, as larvas precisam ser recuperadas. Faça cuidadosamente pequenos cortes perpendiculares na agarose ao redor das larvas.Em seguida, espere que o peixe nade para fora da agarose por conta própria quando o anestésico passar. Depois de cultivar paramécia e anestesiar uma larva de peixe-zebra de acordo com o protocolo de texto, coloque as larvas em agarose de baixo ponto de fusão a 2% e remova imediatamente qualquer excesso de agarose para que a superfície da agarose pareça ligeiramente convexa. Usando uma agulha de dissecação, oriente rapidamente as larvas na posição vertical.Em seguida, usando uma faca cirúrgica, faça alguns pequenos cortes na agarose para remover a agarose ao redor da cabeça do peixe-zebra, o que abre espaço para o paramécio nadar. Remova cuidadosamente a agarose residual despejando suavemente a água do sistema na câmara. Em seguida, coloque um paramécio na câmara de gravação para servir como estímulo visual.Em seguida, coloque a câmara de gravação sob um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera CMOS científica e selecione uma lente objetiva de 2,5X. Inicie o aplicativo de aquisição de imagem para a câmera equipada. Clique no painel de sequência e selecione o registro do disco rígido no painel.Na seção de configuração de varredura, defina a contagem de quadros para 900 ou qualquer outro número total de quadros desejado. No painel de captura, defina o tempo de exposição em 30 milissegundos e o compartimentalização como dois por dois. Clique ao vivo no painel de captura para localizar as larvas na visualização e foco da câmera e, em seguida, clique em parar ao vivo e clique no botão Iniciar.Salve o filme no formato cxd e analise os dados de acordo com o protocolo de texto. Depois de configurar o sistema de registro comportamental e colocar uma larva em uma câmara de gravação de acordo com o protocolo de texto, use uma micropipeta para coletar 50 paramécios e colocá-los na câmara de gravação. Para colocar uma lamínula em cima da câmara de gravação, coloque uma pequena gota de água na lamínula antes de colocá-la na superfície da água da câmara de gravação para evitar a introdução de ar na câmara.Coloque a câmara de gravação no sistema de iluminação. Em seguida, inicie a gravação de lapso de tempo a 10 quadros por segundo por 11 minutos. Por fim, realizar a análise de acordo com o protocolo de texto.Neste experimento com a linha Gal4 que rotula núcleos na área pré-tectal e uma subpopulação de neurônios do bulbo olfatório. Os neurônios pré-tectais foram ablacionados a laser bilateralmente. Os neurônios olfatórios foram ablacionados como controle.Os resultados mostram que o laser de dois fótons pode ablar as células-alvo, deixando os neuritos adjacentes inalterados. Neste experimento, a conectividade funcional de neurônios pré-tectais que projetam seus axônios em direção ao ILH ipsilateralmente foi investigada. Tanto o pretectum quanto o ILH mostraram atividade neuronal na presença proximal da presa, sugerindo que ambas as atividades neuronais são visualmente conduzidas.A imagem de cálcio também foi usada para observar a atividade neuronal no pré-tecto e o ILH em larvas de ablação de neurônios pré-tectais. O pré-teto esquerdo que foi ablacionado a laser mostrou atividade neuronal residual ou inexistente. Além disso, a ILH ipsilateral exibiu atividade neuronal dramaticamente deslocada, sugerindo que a principal entrada para a ILH vem do pretectum ipsilateral.Em contraste, a ILH do outro lado do pré-teto ablacionado a laser mostrou atividade neuronal comparável à atividade neuronal no pré-teto ipsilateral, o que sugere que a ILH direita está recebendo informações do pré-teto direito. Uma vez dominada, a ablação a laser pode ser feita em cerca de uma hora para cada larva de peixe-zebra. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ablação apenas dos neurônios-alvo com irradiação a laser adequada, evitando danos causados pelo calor pelo laser.Após este procedimento, a ablação de neurônios em outras áreas do cérebro, como prosencéfalo ou rombencéfalo, pode ser realizada para responder a perguntas adicionais, como como esses neurônios estão envolvidos nas funções cognitivas ou motoras. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência comportamental explorarem circuitos neurais funcionais em modelos de peixe-zebra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como ablação específica de neurônios no cérebro das larvas do peixe-zebra e avaliar as consequências funcionais e comportamentais.Não se esqueça de que trabalhar com um laser pode ser extremamente perigoso e sempre cumpra as instruções do fabricante ao realizar este procedimento.

ablation-neuronal-population-using-two-photon-laser-its-assessment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós descrevemos um método para a montagem de embriões zebrafish de longo prazo de imagem, de dois fótons de imagem e tecidos de danos técnicas e lapso de tempo de imagem confocal.

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Este vídeo descreve o ensaio de captura de presas. O vídeo discute o método para estudar o comportamento de captura de presas de larvas de peixe-zebra após a ablação a laser de neurônios específicos.

Ensaio de captura de presas: um método para estudar o comportamento de captura de presas de larvas de peixe-zebra

Este vídeo descreve o método para ferir axônios em embriões de peixe-zebra usando axotomia a laser de dois fótons e observando a recuperação axonal de lesões.

Axotomia a laser de dois fótons: um método para ferir axônios em embriões de peixe-zebra e observar a recuperação axonal

Este vídeo demonstra o método para estudar a detecção visual de presas em larvas de peixe-zebra transgênicas usando imagens fluorescentes baseadas em indicadores de cálcio com seus neurônios expressando complexos indicadores de cálcio fluorescentes.

Analisando a atividade neuronal evocada por presas em uma larva de peixe-zebra transgênica

Source: Morsch, M.,  et. al., Triggering Cell Stress and Death Using UV Laser Confocal Microscopia Convencional. J. Vis. Exp. (2017) Neste vídeo, exploramos a técnica de ablação a laser UV de alta intensidade para direcionar e estudar com precisão neurônios individuais em peixes-zebra transgênicos. Demonstramos como preparar, imobilizar e visualizar respostas neuronais, destacando a dinâmica celular da lesão e recuperação.

Ablação seletiva a laser de neurônio único em uma larva de peixe-zebra usando um microscópio confocal

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57485/ ablação-neuronal-população-usando-dois-fótons-laser-sua-avaliação'&gt;Muto, A., et al. Ablação de uma população neuronal usando um laser de dois fótons e sua avaliação usando imagens de cálcio e registro comportamental em larvas de peixe-zebra. J. Vis. exp. (2018) Neste vídeo, é demonstrado um procedimento de ablação a laser de dois fótons, permitindo a destruição seletiva de neurônios fluorescentes em larvas de...

Ablação neuronal direcionada usando microscopia de dois fótons em uma larava de peixe-zebra

Embora o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa após a lesão, pouco se sabe sobre os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando vivo, zebrafish transgênicos e um teste de secção do nervo reprodutível, podemos estudar os comportamentos de células gliais dinâmicas durante a degeneração do nervo e regeneração.

Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

A ablação a laser é uma tecnologia amplamente aplicável para estudar a regeneração em sistemas biológicos. O protocolo apresentado descreve o uso de um microscópio confocal padrão de varredura a laser para ablação a laser e imagens subsequentes de lapso de tempo de células interneuromast regeneradoras na linha lateral do zebrafish.

Ablação e Regeneração a laser baseada em microscópio confocal em células interneuromast baseadas em zebrafish

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar imagens de cálcio de dois fótons no prosencéfalo dorsal de zebrafish adultos.

Imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento

Este protocolo descreve uma abordagem de ablação a laser de dois fótons realizada em larvas de peixe-zebra, que serve como modelo para estudar a regeneração óssea e os efeitos da resposta imune à ablação.

Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para examinar a atividade neural em regiões cerebrais de peixes-zebra transgênicos que expressam indicadores de cálcio GCaMP usando microscopia confocal.

In vivo Imagem de fluorescência confocal da atividade neural induzida por estimulação sensorial em peixes-zebra larvais parcialmente contidos

Aprenda a ablação de neurônios pré-tectais usando laser de dois fótons em larvas de Danio rerio. Este método permite estudar circuitos neurais e comportamentos de captura de presas com alta resolução espacial.

Ablação de uma população Neuronal, usando um Laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal

Ablação de uma população Neuronal, usando um Laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de Zebrafish

Explorar mais vídeos