Geração de células epiteliais nasais humanas esferoides para individualizado fibrose cística condutância transmembrana regulador estudo

O geral deste procedimento é gerar esferóides de células nasais humanas que podem ser usados como um ensaio para estudos funcionais de CFTR. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fibrose cística, como avaliar a resposta de um indivíduo a medicamentos que alteram o CFTR em um sistema de modelo ex vivo. A principal vantagem dessa técnica é que um grande número de esferóides é gerado em um período de tempo relativamente rápido a partir de uma pequena amostra de células nasais, permitindo testes extensivos.

Demonstrando o procedimento estarão Lauren Strecker e Jessica Moncivaiz, técnicas do meu laboratório. Depois de processar e expandir as células epiteliais nasais humanas ou HNE em fibroblastos alimentadores de acordo com o protocolo de texto, leve o meio de expansão previamente preparado, o meio de diferenciação, a solução de 0,1% de tripsina EDTA e o PBS estéril à temperatura ambiente por mais de 30 minutos. Em seguida, use etanol 70% para limpar os recipientes e transferi-los para um gabinete de biossegurança limpo.

No gabinete de biossegurança, use uma pipeta Pasteur conectada a uma linha de vácuo para aspirar e descartar o meio da cultura de HNE. Em seguida, com uma pipeta sorológica limpa, use cinco mililitros de PBS para lavar o prato, adicionando, girando e aspirando o tampão. Adicione cinco mililitros de solução de EDTA a 0,1% de tripsina à cultura e devolva-a à incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco minutos.

Em seguida, sob um microscópio invertido de quatro a 10X, verifique se as células se desprendem do prato, tornam-se redondas e flutuam. Bata suavemente na lateral da placa de cultura para desalojar as células e, se necessário, incube novamente a placa por mais cinco minutos até que a maioria das células seja descolada. Em seguida, usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros, adicione cinco mililitros de meio de expansão ao prato e colete todo o líquido em um tubo cônico estéril de 50 mililitros rotulado.

Se as células permanecerem aderentes à placa de cultura após três rodadas de tripsinização, use um raspador de células estéreis para liberar suavemente as células restantes e, com cinco mililitros de meio de expansão, lave o raspador e a placa e colete o conteúdo no mesmo tubo cônico rotulado. Centrifugue o tubo a 360 vezes g em quatro graus Celsius por cinco minutos. Aspirar o sobrenadante e utilizar um mililitro de meio de expansão para ressuspender o sedimento celular.

Em seguida, use um hemocitômetro para contar as células. Descongele a matriz da membrana basal no gelo de acordo com as instruções do fabricante. Separe um número apropriado de células de passagem diferencialmente tripsinizadas para uma concentração final de 500.000 células por mililitro da matriz.

Para uma placa de quatro poços, use 200.000 células e colete-as em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue a mistura de células a no máximo 360 vezes g por cinco minutos. Em seguida, usando uma pipeta de um mililitro, aspire e descarte o meio completa e cuidadosamente, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular.

Mantenha o tubo de células no gelo quando não estiver manuseando-o ativamente. Use uma ponta de pipeta de um mililitro para adicionar 100 microlitros da matriz da membrana basal por poço planejado às células. Embora não esvazie completamente a ponta da pipeta para evitar a introdução de bolhas de ar, pipete para cima e para baixo para ressuspender as células com cuidado e completamente.

Mova-se rapidamente para evitar a solidificação da matriz. Para semear alíquotas de matriz de 100 mililitros em cada poço de uma placa de cultura de fertilização in vitro de quatro poços, use uma tesoura limpa para aparar os três a quatro milímetros distais de uma ponta de pipeta de 200 microlitros. Pipete cuidadosa e lentamente uma gota de 100 microlitros de mistura de matriz celular no centro de cada poço, garantindo que a gota permaneça esférica e não toque nas laterais do poço.

Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos até ficar sólida. Em seguida, pipete cuidadosamente 500 microlitros de meio de diferenciação em cada poço, tomando cuidado para não perturbar a queda da matriz. Certifique-se de que o meio cubra apenas a gota e adicione mais, se necessário.

Para cultivar esferóides HNE, usando uma ponta de pipeta de um mililitro, aspire suavemente todo o meio do poço, evitando a matriz que destruirá os esferóides. Em seguida, com uma nova ponta de pipeta de um mililitro e evitando tocar ou perturbar a matriz, adicione suavemente 500 microlitros de meio de diferenciação ao poço ao redor da matriz. Continue a incubar os esferóides, substituindo o meio de diferenciação três vezes por semana, como acabamos de demonstrar.

Sob um microscópio invertido com ampliação de 20X, avalie a morfologia esferóide diariamente. Os esferoides devem se formar dentro de três a cinco dias após o plaqueamento e atingir a maturidade em aproximadamente 10 dias. Os HNEs devem se prender à placa de cultura e formar pequenas ilhas dentro de 72 horas após a semeadura.

Exemplos de formação de ilhas boas e ruins em uma semana são mostrados aqui. As ilhas devem se expandir para cobrir o prato ao longo de 15 a 30 dias. Nos primeiros três a quatro dias de cultura, pequenas estruturas císticas devem começar a se formar na matriz e amadurecer em aproximadamente 10 dias.

Se plaqueadas na densidade descrita, as culturas bem-sucedidas conterão de 50 a 100 esferoides por gota de matriz. Os lúmens podem ser relativamente claros, como no CFTR do tipo selvagem, ou cheios de detritos celulares e muco, como nos esferoides da FC. O mascaramento para delinear a área luminal dos esferoides é demonstrado nesses dois painéis.

Aqui são mostrados exemplos de culturas esferóides mal formadas e malsucedidas. Conforme ilustrado nesses gráficos de ensaios funcionais, os esferoides de indivíduos com CFTR do tipo selvagem devem inchar por mais de uma hora quando estimulados e devem inchar menos ou encolher se estimulados na presença do inibidor de CFTR inh-172. Os esferoides de um indivíduo homozigoto para F508del-CFTR devem encolher ou inchar muito ligeiramente com aumento do inchaço ou menos encolhimento quando corrigidos farmacologicamente com os moduladores CFTR VX809 e VX770.

Uma vez dominada, a semeadura de esferóides de células nasais pode ser feita em 15 a 20 minutos, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter procedimentos operacionais limpos dentro do gabinete de biossegurança para minimizar o risco de contaminação da amostra e evitar quaisquer riscos à sua própria saúde. Após este procedimento, outros métodos como fixação, coloração e microscopia podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a morfologia e composição celular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar esferóides primários de células nasais humanas que podem ser utilizados como um ensaio personalizado da função CFTR. Não se esqueça de que trabalhar com tecidos humanos primários pode ser perigoso e precauções como o uso adequado de equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.