Name: Geração de células epiteliais nasais humanas esferoides para individualizado fibrose cística condutância transmembrana regulador estudo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprenda a gerar esferoides de células epiteliais nasais humanas para estudos funcionais do CFTR em fibrose cística. Este método permite avaliar respostas individuais a drogas moduladoras do CFTR em modelo ex vivo.

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Este trabalho foi apoiado pela terapêutica de fundação de fibrose cística, conceder número CLANCY14XX0 e através da Fundação de fibrose cística, conceder o número CLANCY15R0. Os autores desejam agradecer a Kristina Ray pela sua assistência no recrutamento de paciente e fiscalização regulamentar. Os autores também desejam agradecer ao grupo de trabalho HNE, apoiado pela Fundação de fibrose cística, que ajudou na geração de recursos de cultura HNE: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Salomão Marty e Katherine Tuggle.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve a geração de culturas de esferoide de paciente-derivado nasal células capazes de produzir um modelo individualizado, específico da função CFTR. Existem várias etapas-chave no processo que deve ser atendido de perto para evitar a dificuldade. Primeiro é uma aquisição de boa amostra do nariz do paciente. Deve ter uma boa amostra > 50.000 células, limitada muco/detritos e estar pronto para processamento dentro de 4 h (apesar de sucesso também é facilmente alcançável com pernoite no gelo do transporte...

Fibrose cística (CF) é uma doença fatal, autossômica recessiva, afetando mais de 70000 pessoas em todo o mundo1. Esta doença genética da vida-gordura é causada por mutações na condutância transmembranar de fibrose cística regulador proteína (CFTR)2. CFTR é um membro da família de gaveta de trifosfato de adenosina-ligação e funções como um canal iônico, permitindo a circulação de cloreto e bicarbonato através das membranas apicais de epitélios polarizadas múltiplos, incluindo o trato gastrointestinal, glândulas sudoríparas, respiratória e árvore, entre outros3,4. Como tal, disfuncional CFTR leva à disfunção epitelial multissistêmica, com maior mortalidade decorrente da doença respiratória1. No pulmão CF, perda do CFTR-conduzido as vias aéreas superfície líquida (ASL) regulamento e muco lançamento leva ao muco espessado, obstrução das vias aéreas, infecção crônica e remodelação progressiva das vias respiratórias e perda de função de pulmão1,5.
Apesar da identificação de disfunção CFTR como a causa da doença, terapias em CF tradicionalmente focada na atenuação dos sintomas (por exemplo, terapia de reposição de enzimas pancreáticas, terapias de limpeza das vias respiratórias)1. Esta abordagem foi revolucionada recentemente pelo advento da novela terapêutica, denominado "Moduladores CFTR," que destino diretamente CFTR disfuncional. Esta abordagem mudou a paisagem clínica de gestão sintoma para doença-modificando conta mas carrega várias limitações6,7,8,9,10. Atividade do modulador é específico para o defeito de proteína que acompanham cada mutação CFTR e limitada para selecionar populações genéticas11. Essa limitação é impulsionada pela natureza heterogênea dos defeitos de proteína, mas também pelo impracticality de ensaios clínicos em grupos de rara mutação. Além disso, entre indivíduos com genótipos estudados (por exemplo, F508del/F508del CFTR, o mais comum mutação CFTR), há grande variabilidade na doença fardo e modulador resposta6,7,8 ,9,11.
Para superar esses dois problemas, os investigadores propuseram o uso de modelos personalizados para testes pré-clínicos12. Este conceito utiliza tecido do paciente específico para gerar um sistema individualizado ex vivo modelo para testes de compostos, prevendo na vivo resposta assunto para terapias de forma personalizada. Uma vez validado, tal modelo poderia ser usado por médicos para terapia de precisão unidade independentemente do genótipo CFTR subjacente do paciente.
Brônquico epitelial (HBE) as células humanas obtidas de explant tecido no momento do transplante de pulmão estabeleceram a possibilidade de tal modelo para CF13,14. HBEs crescidos em uma interface ar-líquido (ALI) permitem a quantificação de CFTR funcional diretamente por meio de testes eletrofisiológicos, ou indiretamente através de medidas de ASL homeostase13,15. Este modelo tem sido fundamental para a compreensão de biologia CFTR e foi um impulsionador essencial no desenvolvimento do CFTR moduladores16. Infelizmente, HBE modelos não são defensáveis como um modelo personalizado devido a natureza invasiva da aquisição (transplante de pulmão ou escovagem brônquica) e falta de amostras para aqueles com mutações raras ou doença leve. Por outro lado, tecido intestinal, obtido a partir de espécimes de biópsia retal ou duodenal, pode ser usado para medição de corrente intestinal (ICM) ou um ensaio baseado em inchaço organoides para estudo individualizado CFTR função17,18, 19. ensaios de organoides, em particular, são modelos muito sensíveis de CFTR atividade20,21,22. Ambos os modelos são limitados pela fonte de tecido (tecido intestinal, enquanto a maioria das doenças de patologia é respiratória) e o método semi-invasivo de aquisição. Como alternativa, vários investigadores estudaram nasal epitelial (HNE) as células humanas para modelo CFTR restauração23,24,25. HNEs podem com segurança ser colhidas pelo pincel ou curetagem em indivíduos de qualquer idade e, quando cultivadas em ALI, recapitular muitas características da HBEs25,26,,27,28. Culturas de monocamada HNE tradicionalmente tem sido limitadas pela transformação escamosa e há muito tempo a maturidade29. Além disso, relatou um curto-circuito atuais medições em HNEs são menores do que aqueles em HBEs, sugerindo uma janela menor para detectar a eficácia terapêutica25.
Dada a necessidade de um modelo de cultura de tecidos personalizados, não-invasivo, respiratória da função CFTR, procuramos mesclar a sensibilidade de um ensaio de organoides inchaço-baseado, com carácter invasivo e respiratória da HNEs. Aqui, descrevemos o nosso método de gerar culturas "esferoide" 3-dimensional da HNEs para estudo individualizado de CFTR em um ensaio baseado em inchaço30. Esferoides HNE polarizar confiantemente com o ápice epitelial para o centro da esfera, ou o lúmen. Este modelo recapitula a numerosas características de um epitélio respiratório inferior e amadurece mais rapidamente do que as culturas ALI. Como um ensaio funcional, esferoides HNE confiantemente quantificam uma gama de CFTR função, bem como a modulação em grupos de mutação estudada (por exemplo, F508del CFTR). Este ensaio baseado em inchaço capitaliza sobre as propriedades de transporte de íon/sal de CFTR, indiretamente, medindo influxo de fluidos para o spheroid como água segue apical efluxo de sal. Desta forma, esferoides estimuladas com CFTR funcional incham robustamente, enquanto aqueles com CFTR disfuncional menos incham ou encolhem. Isto é quantificado através de análise de imagens de pré e esferoides pós-estimulação de 1 h, medindo a área luminal e determinar a porcentagem mudam. Esta medida pode ser comparada em seguida através de grupos experimentais para triagem de bioatividade de drogas de forma paciente específico.

<table><tbody><tr><td>Tubo Eppendorf de 1,5 mL</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de Filtro de 150 mL</td><td>Midsci&nbsp;</td><td>TP99150</td><td>Para filtrar Mídia</td></tr><tr><td>15 mL Tubo Cônico</td><td>Midsci&nbsp;</td><td></td><td></td>TP91015</tr><tr><td>Frasco de Filtro de 1 L</td><td>Midsci&nbsp;</td><td>TP99950</td><td>Para filtrar Mídia</td></tr><tr><td>35 mm Prato com Fundo de Vidro</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-Metilxantina (IBMX)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AC228420010&nbsp;</td><td>Preparar uma solução-mãe de 100 mM de 22,0 mg em 1 ml de DMSO</td></tr><tr><td>Tubo Cônico Midsci de 50 mL</td><td></td><td>&nbsp; </td><td></td>TP91050</tr><tr><td>Accutase</td><td>Tecnologias Celulares Inovadoras, Inc.</td><td>AT-104</td><td>Solução de desprendimento de células</td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2786-25G</td><td>Veja a Tabela 1</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-100MG</td><td>Veja a Tabela 1</td></tr><tr><td>Extrato de Cérebro Bovino (9mg/mL)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4098</td><td>Veja a Tabela 2</td></tr><tr><td>Hidrato de Ceftazidima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3809-1G</td><td>Veja a Tabela 1</td></tr><tr><td>Raspadores de Células 20 cm&nbsp;</td><td>Midsci&nbsp;</td><td></td><td></td>TP99010</tr><tr><td>CFTR Inh172</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3430</td><td>Prepare uma solução estoque de 10 mM de 4,0 mg em 1 mL de DMSO</td></tr><tr><td>Toxina da cólera B (de Vibrio cholerae)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>Veja a Tabela 1</td></tr><tr><td>CYB-1</td><td>Medical Packaging Corporation</td><td>CYB-1</td><td>Escova de citologia</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 Hepes&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp;</td><td>11330-057</td><td>Meio Base; Veja as Tabelas 1 e 2</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Epidérmico (Proteína Humana Recombinante, Livre de Origem Animal)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG6045 Veja a</td><td>Tabela 1</td></tr><tr><td>Epinefrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4250-1G</td><td>Veja a Tabela 2</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0135-500ML</td><td>16,6 mM solução; Veja a Tabela 2</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td> <td>TCI America&nbsp;</td><td>E0084</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS de alto desempenho)</td> <td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10082147</td><td>Consulte a Tabela 1</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886-50</td><td>Prepare uma solução estoque de 10 mM de 4,1 mg em 1 mL de DMSO</td></tr><tr><td>Growth Factor-Reduced Matrigel</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>Matriz de Membrana Basal Reduzida pelo Fator de Crescimento Corning Matrigel (TFG), Sem Vermelho de Fenol, Sem LDEV, 10 mL.</td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Colágeno Humano, Tipo I (VitroCol; 3 mg/mL)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5007-A</td><td>Solução de Colágeno</td></tr><tr><td>HyClone (também conhecido como FetalClone II)&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30066.03HI</td><td>Veja a Tabela 2</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>StemCell Technologies</td><td>07904</td><td>Veja as Tabelas 1 e 2</td></tr><tr><td>Insulina, recombinante humana, solução de zinco</td> Life <td>Technologies&nbsp;</td><td>12585014</td><td>solução de 4 mg/mL; ver Tabela 2</td></tr><tr><td>Prato de fertilização in vitro de 4 poços,</td><td>NUNC não tratado (via Fisher Scientific)</td><td>12566350</td><td>placa de 4 poços para esferoides; tamanho de poço semelhante a uma placa de 24 poços</td></tr><tr><td>MEF-CF1-IRR</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6001G</td><td>Fibroblastos embrionários murinos irradiados</td></tr><tr><td>Metamorfo 7.7</td><td>Dispositivos</td><td></td> <td>MolecularesSoftware de Análise; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software para uma cotação</td></tr><tr><td>Microscópio invertido Olympus IX51</td> Microscópio de imagem <td>descontinuado</td> da <td>Olympus Corporation</td><td>. Substituição: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/&nbsp; para uma cotação</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15140122</td><td>Consulte a Tabela 2</td></tr><tr><td>Phsophoryletheanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0503-5G</td><td>Consulte a Tabela 2</td></tr><tr><td>Ácido retinóico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>Consulte a Tabela 2</td></tr><tr><td>Rhinoprobe</td><td>Arlington Scientific, Inc.</td><td>96-0905 Livro de</td> slides <td>de cureta nasal</td></tr><tr><td>5.5</td><td>3i, Intelligent Imaging Innovations</td> Software <td>de imagem descontinuado</td><td>. Substituição: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook para uma cotação</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>Água Estéril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos 100</td><td>Techno Plastic Products</td><td>93100</td><td>Placa de cultura de tecidos para expansão</td></tr><tr><td>Tobramicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>Veja a Tabela 1</td></tr><tr><td>Transferrina (Transferrina Humana 0,5 mL)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4205</td><td>Veja a Tabela 2</td></tr><tr><td>Triiodotrionine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397-1G</td><td>3,3&prime;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt&nbsp; [T3]; Ver Tabela 2</td></tr><tr><td>Tripsina do Pâncreas Suíno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser-G</td><td>Crescent Chemical (via Fisher Scientific)</td><td>NC0393024</td><td>20 mL de pó lipofilizado; Consulte a Tabela 2</td></tr><tr><td>Cloridrato de vancomicina de Streptomyces orientalis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2002-5G</td><td>Consulte a Tabela 1</td></tr><tr><td>VX770</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1144</td><td>Prepare uma solução-mãe de 1 mM de 0,4 mg em 1 mL de DMSO</td></tr><tr><td>VX809</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1565</td><td>Adquira ou prepare uma solução-mãe de 10 mM de 4,5 mg em 1 mL de</td></tr><tr><td>dicloridrato de DMSO Y-27632&nbsp; Inibidor de ROCK&nbsp;</td><td>Enzo Ciências da Vida&nbsp;</td><td>ALX-270-333-M025&nbsp;</td><td>Veja a Tabela 1</td></tr></tbody></table>

geração de células epiteliais nasais humanas esferoides para individualizado fibrose cística condutância transmembrana regulador estudo

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Enquanto a introdução de medicamentos de modulador de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR) revolucionou a cuidados na fibrose cística (CF), o modelo de terapia genótipo-dirigido, atualmente em uso tem várias limitações. Grupos de primeira, raro ou pouco estudado de mutação são excluídos dos ensaios clínicos definitivos. Além disso, como drogas adicionais modulador entrarem no mercado, ele se tornará difícil de otimizar as escolhas de modulador para um sujeito individual. Estas duas questões são tratadas com o uso de sistemas de paciente-derivado, individualizado pré-clínicos modelo de função CFTR e modulação. Células epiteliais nasais humanas (HNEs) são uma fonte facilmente acessível de tecido respiratório para esse modelo. Aqui, descrevemos a geração de um modelo tridimensional esferoide de função CFTR e modulação usando HNEs primários. HNEs são isolados de indivíduos de uma forma minimamente invasiva, expandiu-se em condições de reprogramação condicionais e semeado na cultura esferoide. Dentro de duas semanas de semeadura, culturas de esferoide geram esferoides HNE que podem ser estimulados com 3', 5'-cíclico adenosina monofosfato (cAMP)-gerando agonistas para ativar a função CFTR. Inchaço de esferoide é então quantificado como um proxy de atividade CFTR. Esferoides HNE capitalizar a origem minimamente invasiva, mas respiratória das células nasais para gerar um modelo acessível e personalizado relevante para um epitélio refletindo a mortalidade e a morbidade da doença. Em comparação com as culturas HNE interface ar-líquido, esferoides são relativamente rápidas amadurecer, que reduz a taxa de contaminação global. Na sua forma atual, o modelo é limitado pela baixa taxa de transferência, mas isso é compensado pela relativa facilidade de aquisição de tecido. Esferoides HNE podem ser usados para confiantemente quantificar e caracterizar a atividade CFTR no nível individual. Um estudo em curso para amarrar esta quantificação na vivo resposta droga irá determinar se esferoides HNE são verdadeiro pré-clínicos preditor de resposta do doente à modulação de CFTR.

HNEs deve anexar para o prato de cultura e formam pequenas ilhas de células dentro de 72 h de semeadura; exemplos de formação de ilha de bom e pobre em uma semana são mostrados na figura 1A e 1B, respectivamente. Estas ilhas devem expandir para cobrir o prato ao longo de 15-30 dias. Amostras de pequenas ou de qualidade inferior podem levar mais tempo e muitas vezes não renderá esferoides útil. Contaminação com agentes infecciosos é evidenciad...

Aqui nós descrevemos um método para gerar culturas esferoide tridimensional de células epiteliais nasais humanas. Esferoides são então estimulados a unidade de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR)-íon dependente e secreção fluida, quantificar a mudança no tamanho luminal esferoide como um proxy para função CFTR.

Geração de células epiteliais nasais humanas esferoides para individualizado fibrose cística condutância transmembrana regulador estudo

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

O geral deste procedimento é gerar esferóides de células nasais humanas que podem ser usados como um ensaio para estudos funcionais de CFTR. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fibrose cística, como avaliar a resposta de um indivíduo a medicamentos que alteram o CFTR em um sistema de modelo ex vivo. A principal vantagem dessa técnica é que um grande número de esferóides é gerado em um período de tempo relativamente rápido a partir de uma pequena amostra de células nasais, permitindo testes extensivos.Demonstrando o procedimento estarão Lauren Strecker e Jessica Moncivaiz, técnicas do meu laboratório. Depois de processar e expandir as células epiteliais nasais humanas ou HNE em fibroblastos alimentadores de acordo com o protocolo de texto, leve o meio de expansão previamente preparado, o meio de diferenciação, a solução de 0,1% de tripsina EDTA e o PBS estéril à temperatura ambiente por mais de 30 minutos. Em seguida, use etanol 70% para limpar os recipientes e transferi-los para um gabinete de biossegurança limpo.No gabinete de biossegurança, use uma pipeta Pasteur conectada a uma linha de vácuo para aspirar e descartar o meio da cultura de HNE. Em segu

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Células epiteliais nasais, obtidas através de biópsia superficial raspar de voluntários humanos, são expandidas e transferido para tecido inserções de cultura. Ao atingir a confluência, as células são cultivadas na interface ar-líquido, obtendo-se culturas de células ciliadas e não ciliadas. Culturas de células epiteliais nasais diferenciados fornecem modelos experimentais para o estudo de viáveis ​​da mucosa respiratória.

A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido

Esta publicação demonstra métodos para amostragem e cultura bem-sucedidas da mucosa epitelial nasal de crianças e reprogramação dessas células para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).

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Este protocolo descreve um ensaio para medir a função do CFTR e as respostas do modulador do CFTR em tecido cultivado de indivíduos com fibrose cística (FC). Os organoides intestinais derivados de biópsia incham de forma impulsionada pelo AMPc, uma resposta que é defeituosa (ou fortemente reduzida) nos organoides da FC e pode ser restaurada pela exposição a moduladores de CFTR.

Inchaço na Organóides intestinal induzida por forscolina: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para a Avaliação de Medicamentos Response na Fibrose Cística Os pacientes

Descrevemos um protocolo simples para desenvolver organoides epiteliais mucociliais a partir de células ectoderm profundas isoladas dos embriões Xenopus laevis. Os progenitores multipotentes regeneram precursores de células de cálice epitelial e permitem o acompanhamento ao vivo da iniciação e progressão das transições celulares na superfície dos organoides.

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Um protocolo detalhado é apresentado aqui para descrever um modelo organoide in vitro de células epiteliais nasais humanas. O protocolo tem opções de medições que requerem equipamentos de laboratório padrão, com possibilidades adicionais de equipamentos e softwares especializados.

Cultura e Imagem de Organoides Epiteliais Nasais Humanos

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Aqui descrevemos o isolamento, amplificação e diferenciação das células epiteliais nasais primárias (HNE) na interface ar-líquido e um protocolo de biobanco permitindo congelar com sucesso e, em seguida, descongelar HNE amplificada. O protocolo analisa propriedades eletrofisiológicas de células HNE diferenciadas e correção de secreção de cloreto relacionada ao CFTR em diferentes tratamentos moduladores.

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Os recentes avanços nos protocolos de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidos pelo homem permitem a derivação stepwise de tipos celulares específicos de órgãos. Aqui, fornecemos etapas detalhadas para a manutenção e expansão das células basais derivadas das vias aéreas derivadas do iPSC e sua diferenciação em um epitélio mucociliary em culturas de interface ar-líquido.

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A reabilitação pulmonar é amplamente reconhecida no tratamento de doenças respiratórias. Um componente-chave para a reabilitação pulmonar bem sucedida é a aderência ao treinamento físico recomendado. O objetivo do presente protocolo é descrever como a tecnologia de rastreamento de dados contínua pode ser usado para medir com precisão a adesão a uma intensidade de treinamento aeróbio prescrito.

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Aprenda a gerar esferoides de células epiteliais nasais humanas para estudos funcionais do CFTR em fibrose cística. Este método permite avaliar respostas individuais a drogas moduladoras do CFTR em modelo ex vivo.

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Geração de células epiteliais nasais humanas esferoides para individualizado fibrose cística condutância transmembrana regulador estudo

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