Um isoinokosterone baseado no Receptor Singular Gene interruptor para deliberada expressão do Transgene com robustez, reversibilidade e insignificante Leakiness

O objetivo geral deste experimento é modular a expressão de transgenes pela administração do indutor químico tebufenozida. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular e molecular, como quando você precisa estimular a expressão de um gene de interesse em um momento desejado com a força desejada. A principal vantagem desta técnica é que, ao combinar todos os elementos necessários para a expressão do transgene em um único vetor, a expressão do transgene pode ser estimulada pela administração do indutor químico tebufenozida.

Após a subclonagem dos transgenes EGFP ou ANKRD13A de acordo com o protocolo de texto, prepare quatro placas de cultura de células contendo células HEK 293 recém-passadas em cinco mililitros de DMEM suplementado com cinco a 10% de FBS e antibióticos, que doravante serão referidos como meio de cultura. Mantenha as células a 37 graus Celsius. Quando as células atingirem 50 a 60% de densidade, adicione três microlitros de reagente de transfecção a 200 microlitros de diluente contendo o DNA.

Depois de incubar a reação à temperatura ambiente por 30 minutos, adicione a mistura às células HEK 293. Use dois pratos para transfecção e deixe os outros dois sem tratamento como controles. Incube as células a 37 graus Celsius por 12 a 24 horas.

Após a incubação, adicionar Teb a uma das amostras transfectadas e a um dos controlos não transfectados. Deixar as outras duas amostras sem tratamento como controlos experimentais. Incube as placas por 12 a 48 horas.

Se estiver usando o inserto EGFP, analise a expressão do EGFP sob um microscópio fluorescente. Caso contrário, para colher as células para immunoblotting, use PBS gelado para enxaguar as células duas vezes. Em seguida, use um raspador de células para removê-los da placa e transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, gire os tubos a 21.000 vezes g e 18 a 25 graus Celsius por dois minutos. Em seguida, depois de descartar o PBS, adicione 0,5 mililitros de reagente de extração de proteína de mamífero gelado, ou M-PER, e inibidor de protease ao pellet. Ressuspenda as células com várias rodadas de pipetagem.

Em seguida, incube a suspensão celular a 18 a 25 graus Celsius e temperatura ambiente por 15 minutos. Gire o lisado celular a 21.000 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante aquoso para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e analise-o por immunoblotting com os anticorpos apropriados.

Para extinguir os estímulos de Teb, remova o meio de cultura contendo Teb das células e use PBS pré-aquecido para enxaguar as células duas vezes. Em seguida, adicione um mililitro de 0,25% de tripsina / EDTA e incube as células a 37 graus Celsius por um minuto. Adicione 10 mililitros de meio de cultura pré-aquecido e sem Teb às células e use um raspador de células para colhê-las.

Transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, gire as células a 21.000 vezes g e 18 a 25 graus Celsius por dois minutos. Ressuspenda as células em 50 mililitros de meio de cultura pré-aquecido e sem Teb e transfira cinco mililitros das células para três placas de cultura de células frescas de 60 milímetros.

Incube as células a 37 graus Celsius por 24, 48 e 72 horas, respectivamente. Finalmente, colha as células em diferentes pontos de tempo e meça os níveis de expressão do transgene usando immunoblotting. Neste experimento que avaliou a atividade e o vazamento de pEUI-plus-EGFP, os transfectantes de vetor simulado não apresentaram sinal fluorescente, independentemente do tratamento com Teb.

No entanto, os transfectantes pEUI-plus-EGFP tornaram-se progressivamente sensibilizados à quantidade crescente de Teb. Mais importante, os transfectantes pEUI-plus-EGFP não tratados com Teb não provocaram nenhum sinal EGFP detectável. O ANKRD13A marcado com FLAG foi usado para validar ainda mais a capacidade de resposta do pEUI-plus ao Teb.

Como mostrado neste western blot usando anticorpos anti-FLAG, as células HEK 293 transfectadas exibiram forte expressão de ANKRD13A após um tratamento de 24 horas com Teb. Além disso, a depleção de Teb demonstrou a reversibilidade da troca do gene pEUI-plus, pois ANKRD13A não era mais detectável em células cultivadas sem Teb. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar quase todo o experimento em condições livres de germes. Seguindo este procedimento, outros métodos, como o sistema Tet-On ou Tet-Off, podem ser aplicados para expressar diferencialmente dois transgenes distintos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular explorarem a fisiologia molecular no nível celular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o vetor de troca de genes pEUI-plus com o objetivo de induzir a expressão do transgene no momento desejado com a força desejada. Não se esqueça de que trabalhar com tebufenozida pode ser perigoso e precauções, como usar jaleco, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.