Microinjeção de Western milho repele, Diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma CRISPR/Cas9

O objetivo geral deste protocolo de microinjeção é modificar o genoma do verme da raiz do milho ocidental. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a biologia da lagarta da raiz do milho ocidental e sua capacidade de superar rapidamente os métodos de controle de pragas, como a toxina BT e a RANI. Além dos vermes da raiz do milho ocidental, este método também pode ser aplicado a espécies semelhantes, como os vermes do sul e do norte.

Tive a ideia desse método pela primeira vez quando me pediram para ajudar com RANI baseado em injeção no Western Corn Rootworm nos anos 90. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades. Porque a criação de vermes da raiz do milho ocidental em laboratório é trabalhosa.

E as taxas de sobrevivência permanecem baixas usando a tecnologia atual. Obtenha entre 500 e 1.000 adultos vermes da raiz não diapausados de uma empresa confiável ou laboratório de pesquisa. E abrigá-los em gaiolas de 30 centímetros cúbicos.

Armazene a dieta artificial padrão do verme da raiz em recipientes de armazenamento de alimentos com cerca de um centímetro de profundidade. A dieta não utilizada pode ser armazenada a quatro graus Celsius por até dois meses. Para alimentar o verme da raiz, carregue placas de Petri de 100 centímetros com 10 a 15 gramas de dieta.

Coloque um prato de comida em cada gaiola de verme. E reabasteça-o quando o suprimento acabar ou a dieta secar. Mantenha também um reservatório de água de 300 mililitros, coberto por uma bola de algodão, em cada gaiola para servir como fonte de água.

Troque a água quando ela estiver baixa. Mantenha o verme da raiz enjaulado a 26 graus Celsius com 60% de umidade e um ciclo de luz 14/10 em uma incubadora de criação de insetos. Defina o horário de apagar as luzes no final do dia, como à meia-noite, para que os ovos sejam postos antes do horário de trabalho matinal.

Primeiro, colete os embriões. Para uma superfície de coleta de ovos, carregue uma placa de Petri de 100 milímetros com 30 mililitros de ágar 1% e água. Em seguida, coloque uma única camada de papel de filtro no ágar, seguida de quatro camadas de pano de queijo.

Cada camada deve ser cortada no tamanho certo. Em seguida, o mais tarde possível, coloque o prato de coleta de ovos na gaiola do verme da raiz e cubra-o com uma tenda de papel alumínio. Então, na manhã seguinte, remova a câmara de coleta de ovos.

Use uma pinça para pegar uma camada de pano de queijo de cada vez e coloque em um copo de 500 mililitros carregado com água. Lave os ovos do pano de queijo girando na água. Em seguida, use uma pipeta de bulbo para transferir os ovos para outro copo de água como etapa de lavagem.

Execute duas ou três lavagens dessa maneira. Em seguida, deposite os ovos limpos em papel de filtro com o mínimo de água possível. Em seguida, prepare um slide colando um pedaço de papel de filtro preto no slide para melhorar o contraste.

Em seguida, regue linhas finas de cola não tóxica no papel que será usado para prender os ovos. Mantenha a cola abaixo da circunferência de um ovo. Enquanto a cola estiver molhada, use um pincel fino para colocar os ovos na linha de cola.

Mantenha pelo menos a distância de um ovo entre cada ovo. Prepare várias linhas de ovos por lâmina. Os óvulos devem agora ser injetados em 30 minutos.

Agora, combine o plasmídeo auxiliar, o plasmídeo doador e o tampão vermelho de fenol. Use plasmídeos super enrolados de alta qualidade feitos com um kit comercial livre de endotoxinas. Fortex brevemente para misturar.

E então gire as partículas por três minutos na velocidade máxima. Em seguida, o preenchimento puxou as agulhas de vidro borossilicato com 0,5 a 1 microlitros de solução injetável. Se alguma bolha se formar, certifique-se de removê-la.

Em seguida, conecte a agulha de injeção ao micromanipulador. Agora, se necessário, sob o microscópio, quebre suavemente a ponta da agulha selada usando uma pinça fina ou tocando suavemente a ponta em uma barreira de vidro. Tente fazer a menor abertura possível que libere a solução de injeção.

Antes de injetar os ovos do verme, use um pincel fino para molhar cuidadosamente a superfície de um a três ovos preparados com água estéril. Em seguida, injete os embriões molhados. Insira suavemente a agulha no meio do embrião e injete um pequeno volume de solução.

Comece usando 10 a 13 psi de pressão e ajuste a pressão conforme necessário. Os embriões secos têm uma forma redonda distinta, ao pré-umedecer cada embrião com água mudará sua forma e amolecerá a casca do ovo, permitindo que a agulha penetre facilmente. Um embrião injetado com sucesso terá uma pequena quantidade de cor vermelha.

Se um ovo foi danificado, parece peculiar ou não pode ser injetado, esmague-o ou remova-o da lâmina. Depois que todos os ovos forem injetados, mova o papel de filtro com os ovos para uma placa de ágar 1%. Em seguida, sele o prato com filme de parafina e incube-o a 26 graus Celsius até que as larvas eclodam.

12 dias após a injeção, comece a verificar se há larvas todos os dias nas próximas duas semanas. Transfira as larvas usando uma escova fina para uma caixa de criação com milho germinado e solo para criá-las em condições padrão. A transformação germinativa do verme da raiz foi tentada co-injetando um plasmídeo portador de transposase com um plasmídeo transportador de transposon em embriões pré-celulares.

Nos 26 sobreviventes, cada expressão de PFE foi usada para rastrear a inserção do elemento doador. Embora a progênie torácente tenha sido identificada, a triagem de embriões de vermes da raiz com a fonte de luz intensa provou ser letal. A próxima rodada de transformação da linha germinativa utilizou um gene de proteína fluorescente vermelha impulsionado por um promotor constitutivamente ativo de Drosophila melanogaster.

As taxas de sobrevivência melhoraram, mas apenas uma larva vermelha positiva para DS foi registrada. Em seguida, os embriões foram microinjetados com tampão sozinho ou com plasmídeos de DNA de doadores auxiliares e marcados com toque. Uma proporção semelhante de embriões eclodiu quando injetado apenas com plasmídeos ou tampão.

E, curiosamente, apenas cerca de metade dos embriões não injetados eclodiram. Isso colocou a letalidade de manipular os embriões para a injeção tão alta quanto realizar a injeção. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como microinjetar embriões de parede radicular de milho ocidental.

Uma vez dominado, duzentos a trezentos embriões podem ser injetados por hora usando esta técnica. Este método é devido às técnicas desenvolvidas para a transformação da linha germinativa de Drosophila melanogaster, que servem como modelos aplicáveis a muitas outras espécies. Seguindo este procedimento, outros métodos, como a edição do genoma baseada em CRISPR / Cas9, podem ser realizados para fazer mutações direcionadas no genoma da parede da raiz do milho ocidental.

A fim de responder a perguntas específicas sobre a função do genoma.