Name: Microinjeção de Western milho repele, Diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma CRISPR/Cas9 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda microinjeção em embriões de Diabrotica virgifera virgifera para transformação da linha germinal e edição de genoma CRISPR/Cas9. Este método permite estudos funcionais em genômica de pragas agrícolas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do programa de pesquisa Monsanto milho Rootworm conhecimento, conceder número AG/1005 (ao MDL e YC) e fundos de start-up de MDL da NCSU. FC foi apoiado por subsídios do programa de pesquisa de conhecimento para repele de milho da Monsanto (AG/1005) e o National Science Foundation, conceda número MCB-1244772 (MDL). Os autores declaram não interesses concorrentes. FC e MDL concebido e desenhado os experimentos; FC, PW e SP realizaram os experimentos; FC e MDL analisaram os resultados; e FC, NG e MDL escreveram o manuscrito. Agradecemos a Teresa O'Leary, William Klobasa e Stephanie Gorski por sua assistência especializada em triagem WCR. Agradecemos também o Dr. Wade French (USDA-ARS, Laboratório Central de pesquisa agrícola do Norte, Brookings, SD) para remessas de ovos para estabelecer colônias de laboratório e proporcionando a criação de protocolos.

1. nível de colônia de criação dos adultos WCR
<ol><li>Obter uma quantidade suficiente de adultos WCR (500-1.000) de um laboratório confiável de empresa ou de pesquisa (ver Tabela de materiais para obter um exemplo) e coloque em uma gaiola de3 30 cm. Nota: O uso de uma cepa não-diapausing é altamente recomendado.</li>
	<li>Preparar a dieta artificial WCR, seguindo o protocolo do fabricante e despeje uma camada de 1 cm de espessura em um recipiente de 38 oz (ver Tabela de materiais). Após a mistura, armazene dieta não utilizada a 4 ° C por até 2 meses.</li>
	<li>Colocar uma placa de Petri (100 x 15 mm) com dieta adulta (10-15 g) em uma gaiola de3 30 cm. Adicione mais dieta quando a comida é baixo ou seco.</li>
	<li>Colocar um balão (300 mL) com água, coberta com uma bola de algodão, que é usada para segurar no lugar de um rolo de algodão (6 "x 3/8"), para servir como uma fonte de água. Mude a água quando ele é executado baixo.</li>
	<li>Manter WCR a 26 ° C, com 60% de humidade e um 14:10 luz do ciclo em um inseto incubadora de criação.</li>
</ol>2. alinhamento e colheita de embriões
<ol><li>Fazer uma câmara de coleta de ovos usando ágar de 1% em água estéril 100 x 15 mm2 placa de Petri. Armazenar a 4 ° C, após o ágar solidifies.</li>
	<li>Para coletar ovos recém-estabelecidas, coloque uma camada de papel de filtro, seguido de 4 camadas de gaze (cada corte ao tamanho) na superfície do ágar (figura 1A). Nota: Gaze pode ser reutilizado, depois de ser lavado em água sanitária e esterilizada, mas não é necessário fazer isso para a primeira utilização. Papel de filtro não deve ser reutilizado e não precisa ser esterilizado.</li>
	<li>Coloque a placa de coleção de ovo na gaiola WCR mais tarde no dia possível (final do dia de trabalho) e cobrir com uma tenda de papel alumínio. Deixe durante a noite. Nota: Tendo as luzes de 10:00 a postura de ovos 12 A.M. (14 h) atrasos, facilitando assim a recolha dos ovos mais jovens para o microinjection sem a necessidade de pessoal de laboratório colocar a câmara de recolha na gaiola à noite.</li>
	<li>Remova a câmara de recolha de ovos em torno de 8 ou 09:00</li>
	<li>Use fórceps para pegar 1 camada de gaze em tempo e lugar num copo (500 mL) de água. Lave os ovos de gaze agitando suavemente (figura 1B e 1C).</li>
	<li>Use uma pipeta de bulbo para transferir os ovos para outro copo (500 mL) de água. Repita 2-3 x para limpar os ovos.</li>
	<li>Use a pipeta de bulbo para transferir ovos em papel de filtro (Figura 1), minimizando a quantidade de transferência de água.</li>
	<li>Corte papel filtro preto em tiras tão largas como uma lâmina de vidro e a fita firmemente para o slide para certificar-se o papel fixa plana (Figura 2A). Nota: Papel filtro preto ajuda a melhorar a visibilidade sob o microscópio, reduzindo a quantidade de luz refletida.</li>
	<li>Aplicar a cola não-tóxica (ver Tabela de materiais para obter um exemplo) para o papel de filtro em linhas finas (Figura 2B). Manter as linhas de cola mais fino do que o diâmetro de um ovo de modo a evitar os ovos revestidos em cola.</li>
	<li>Use um pincel fino para mover suavemente WCR os ovos um a um de seu papel de filtro para a linha de cola. Para colocar os ovos na cola antes de secar para fora e tentar manter distância de pelo menos um ovo entre cada ovo.</li>
	<li>Maximize a eficiência de injeção, colocando várias linhas de ovos no slide um papel de filtro (Figura 3).</li>
	<li>Depois que todos os ovos para fora o papel de filtro, espere até que toda a cola secar antes de microinjeção. Nota: Para transformação do germline e genoma CRISPR/Cas9-mediada edição, injete todos os embriões do meio-dia (12:00) para que o embrião mais velho é velho não mais de 19 h. No entanto, para RNAi, não há nenhuma limitação de tempo porque, em WCR, dsRNA pode mover entre as células. Na verdade, para RNAi, embriões de envelhecimento podem resultar em melhores taxas de sobrevivência.</li>
</ol>3. preparação de DNAs plasmideo e agulhas de injeção
<ol><li>Prepare-se alta qualidade supercoiled Plasmídeo usando um comercial livre de endotoxinas kit (veja a Tabela de materiais para obter um exemplo).</li>
	<li>Para preparar a solução de injeção, verifique a concentração de cada plasmídeo e então combinar auxiliar do plasmídeo (concentração final de 250 ng / µ l), doador do plasmídeo (concentração final de 750 ng / µ l) e buffer de vermelho de fenol (20% de concentração final). Vórtice brevemente a solução e centrifugar para 3 min na velocidade máxima para precipitar partículas que podem entupir a agulha.</li>
	<li>Puxe agulhas de vidro de borosilicato (O.D. 1 mm, identificação 0,58 mm, comprimento de 10 cm) usando um extrator de micropipeta tipo flamejante/marrom. Para armazenamento, secure agulhas puxadas na fita adesiva dupla-face em uma placa de Petri ou outro recipiente transparente. Nota: Para o sistema extrator de micropipeta, as configurações usadas foram: calor = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.</li>
	<li>Aterramento a agulha de injeção, usando um microcarregador de ponta (ver Tabela de materiais) para pipetar 0,5 - 1,0 µ l para baixo dentro da agulha, perto da extremidade pontiaguda. Remova as bolhas da ponta da agulha se ocorrer qualquer um.</li>
	<li>Introduza o suporte da agulha, a agulha de injeção.</li>
	<li>Abra a ponta da agulha suavemente rompendo com um belo par de pinças, ou suavemente tocar/arrastando a ponta no slide lamela ou vidro. Nota: O objetivo é ter a menor abertura que ainda permite a combinação de injeção para sair (aberturas menores geralmente requerem maior pressão de injeção). Agulhas chanfradas não exigem este passo desde já estão abertas.</li>
</ol>4. microinjection e cuidados pós-injeção
<ol><li>Usando um pincel fino, cuidadosamente molhe a superfície de 1-3 ovos com água estéril, introduza a agulha e injetar a solução. Injete cada ovo antes que seque a superfície. Olha para a aparência uma pequena quantidade de cor vermelha dentro dos ovos durante a injeção para indicar a microinjeção de sucesso. Esmagar ou remover todos os ovos que está danificado, vazio, ou caso contrário não podem ser injetados. Nota: Embora a pressão de injeção varia de acordo com o tamanho de furo de agulha, 10-13 psi é um bom ponto de partida.</li>
	<li>Depois que todos os ovos são injetados, remova a lâmina de vidro o papel de filtro.</li>
	<li>Coloque o papel de filtro sobre a superfície de um prato de 1% de ágar (descrito acima).</li>
	<li>Use filme plástico parafina para selar o prato e coloque em um inseto de 26 ° C criação de incubadora durante 12 dias. Nota: O filme de parafina ajudará a evitar a contaminação cruzada do molde entre pratos. No entanto, qualquer outro tratamento para evitar mofo e crescimento bacteriano poderia reduzir a sobrevivência dos embriões injetados.</li>
</ol>5. cultivo e incubação de embriões
<ol><li>Comece a verificar injeção após 12 dias de embriões para larvas recém-eclodidas e continuar diariamente para as próximas 2 semanas.</li>
	<li>Transferência de larvas, usando um pincel fino, para uma caixa de criação com milho germinado e solo. Nota: Molde pode crescer no prato agar, mas as larvas eclodem ainda na maioria dos casos. Procure larvas cuidadosamente dentro do molde para pegá-los todos. Algumas larvas podem passar para a tampa do prato e podem ficar preso a condensação.</li>
	<li>Larvas a 26 ° C, seguindo o padrão WCR criação métodos25de trás.</li>
</ol>

<ol><li>Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+Invasiveness+of+Western+Corn+Rootworm%3A+Intensifying+Research+on+a+Worsening+Pest%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest.</a> Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).</li>
<li>Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-evolved+resistance+to+Bt+maize+by+western+corn+rootworm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm.</a> PLoS One. 6 (7), e22629(2011).</li>
<li>Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19991107592">Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice.</a> Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).</li>
<li>Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. <a target="_blank" href="https://digitalcommons.unl.edu/entomologyfacpub/87/">Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides.</a> Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).</li>
<li>Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoselle%2C+R+%22Annual+report+for+1959%2C+cooperative+extension+work+in+entomology%22">Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology</a>. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).</li>
<li>Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).</li>
<li>Baum, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+coleopteran+insect+pests+through+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Control of coleopteran insect pests through RNA interference.</a> Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).</li>
<li>Velez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+for+Successful+Parental+RNAi+as+An+Insect+Pest+Management+Tool+in+Western+Corn+Rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Genes (Basel). 8 (1), (2016).</li>
<li>Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+as+a+method+for+target-site+screening+in+the+Western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> J Insect Sci. 10, 162(2010).</li>
<li>Rangasamy, M., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+RNA+interference+in+western+corn+rootworm+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte+%28Coleoptera%3A+Chrysomelidae%29+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults.</a> Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).</li>
<li>Khajuria, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+RNA+interference+of+genes+involved+in+embryonic+development+of+the+western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.</a> Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).</li>
<li>Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+of+the+Drosophila+genome+with+single+P+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements.</a> Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).</li>
<li>Robertson, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+genomic+source+of+P+element+transposase+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).</li>
<li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+Cloned+P+Elements+into+Drosophila+Germ+Line+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes.</a> Science. 218 (4570), 341-347 (1982).</li>
<li>O'Kane, C. J., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+in+situ+of+genomic+regulatory+elements+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).</li>
<li>Lukacsovich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-tagging+gene+trap+of+novel+genes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-based+insertional+mutagenesis+and+enhancer+detection+as+a+tool+for+functional+insect+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics.</a> Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).</li>
<li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501(2009).</li>
<li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li>
<li>Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+breakage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA breakage and repair.</a> Adv Genet. 38, 185-218 (1998).</li>
<li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+mutagenic+chain+reaction%3A+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li>
<li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li>
<li>Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jee/article-abstract/81/1/410/935020">Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae).</a> Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).</li>
<li>Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+superfamily+genes+in+Tribolium+castaneum+and+the+use+of+a+Tubulin+promoter+to+drive+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).</li>
<li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Insect Mol Biol. , (2017).</li>
<li>Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+three+copies+of+the+gene+for+the+major+Drosophila+heat+shock+induced+protein+and+their+flanking+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions.</a> Cell. 21 (3), 669-679 (1980).</li>
<li>Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+marker+for+transgenic+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A universal marker for transgenic insects.</a> Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).</li>
<li>Branson, T. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1570-7458.1976.tb02591.x/abstract">The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).</li>
<li>Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tribolium+embryogenesis%3A+a+SEM+study+of+cell+shapes+and+movements+from+blastoderm+to+serosal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure.</a> Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+transgenesis%3A+methods+and+applications%22">Insect transgenesis: methods and applications</a>. , CRC Press. (2000).</li>
<li>Lorenzen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-based+insertional+mutagenesis+in+Tribolium+castaneum+using+donor%2Fhelper+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids.</a> Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).</li>
<li>Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-mediated+gene+targeting+and+transgene+replacement+in+the+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum.</a> Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).</li>
<li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biol. 5, 11(2007).</li>
<li>Horn, C., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgene-based%2C+embryo-specific+lethality+system+for+insect+pest+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.</a> Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Embora microinjection de WCR com dsRNAs com a finalidade de RNAi tem sido relatado9, este é o primeiro protocolo para estabelecer as melhores práticas para microinjecting precellular embriões WCR, um processo crítico para a realização da linha germinal transformação e/ou CRISPR/Cas9 genoma edição nesta espécie. Sucesso microinjeção de embriões WCR é dependente de muitos fatores, como eficiência de transformação. Discutidas a seguir estão algumas das principais questões impactando o resultado do us...

Repele do milho ocidental (RPT), Diabrotica virgifera virgifera, é uma praga importante do milho1. Curiosamente, WCR aparece superar o controle mede mais rapidamente do que as pragas mais agrícolas, desde que eles não só se adaptar fisiologicamente mas também comportamentalmente2,3,4,5, 6. na última década, o RNA de interferência (RNAi), uma poderosa ferramenta de genômica funcional, foi investigado como um método de controle potencial para WCR7,8e também tem sido usado como um meio para o estudo de função do gene9. No entanto, enquanto RNAi é frequentemente realizada por microinjeção de RNA double-stranded (dsRNA) em outras espécies, baseado na injeção de RNAi é raro em WCR. Na verdade, existem apenas alguns relatos de RNAi através de microinjeção de dsRNA em WCR9. A razão é que WCR pode atingir alto-níveis de gene "knockdown" através de ingestão de dsRNA7,10, mesmo permitindo o estudo dos efeitos embrionários alimentando dsRNA para a mãe11. Enquanto este método torna WCR um excelente assunto para análise genômica funcional via RNAi,-retardou o progresso no desenvolvimento de metodologias para o embrionário microinjection nesta espécie.
Apesar do poder de RNAi, existem alguns inconvenientes. Por exemplo, nem todos os genes respondem igualmente a RNAi. Esta variabilidade pode fazer a interpretação dos resultados de um ensaio de genómica funcional mais difícil. Além disso, RNAi é transitória e não gera mutações hereditárias. Por outro lado, a transformação da linha germinal, outra ferramenta genômica funcional, pode gerar mutações hereditárias através de inserção de um elemento marcado transponíveis no genoma12,13. Isto faz a transformação do germline uma excelente ferramenta para a criação de cepas mutantes para uso em estudos de genéticos a longo prazo. Transformação também pode ser usada para resgatar uma mutação, entregando uma cópia funcional do gene de um genoma mutante14. Além disso, a transformação do germline é a pedra angular de uma grande variedade de técnicas de genéticas moleculares. Além de bater para fora e/ou resgatar a função do gene, germline transformação pode ser usada para realçador de armadilhagem15, gene armadilhagem16, expressão ectópica baseada em Gal417e mutagênese genoma-largo18.
Mais recentemente, foram desenvolvidas ferramentas que permitem a edição sofisticada do genoma. Essas ferramentas incluem transcrição Activator-Like Effector Nucleases (TALEN) e o sistema CRISPR/Cas9-nuclease19,20. A vantagem dessas novas ferramentas é que eles oferecem a capacidade de induzir uma quebra de DNA dupla-hélice em quase qualquer local dentro de quase qualquer genoma para pesquisadores. Uma vez que induzida, estas quebras podem ser reparadas através das extremidades não-homóloga juntar-se, que podem apresentar deleções ou inserções no gene alvo, ou através de reparação homologia-dirigido, que na presença de uma construção projetada, pode catalisar a substituição de genes inteiras ou regiões genéticas21,22. No entanto, esses métodos exigem microinjeção de DNA, RNA e/ou proteína em embriões muito jovens.
Importante, ao contrário do dsRNAs usado para RNAi, os ácidos nucleicos e proteínas usadas para germline transformação e edição de genoma não podem facilmente cruzar as membranas celulares. Portanto, microinjeção de DNAs plasmideo, mRNAs e/ou proteínas deve ser efectuada durante a fase de Drosophila sincicial (ou seja, antes do embrião inseto cellularizes). Isso faz com que o timing de injeções um fator crítico. Por exemplo, em Drosophila melanogaster, embriões precisam ser injetado dentro de duas horas depois de ovo colocar12. Portanto, desenvolvimento de um protocolo bem sucedido microinjeção embrionárias para WCR deve levar em conta as melhores condições para a colocação de óvulo feminino, assim como o melhor método para coletar uma quantidade suficiente de embriões precellular.
Um esforço para trazer uma ampla gama de ferramentas de genéticas moleculares sobre Biologia WCR requer desenvolver métodos de recolha e microinjecting precellular embriões WCR. Aqui nós fornecemos instruções detalhadas, juntamente com dicas e truques, para ajudar os outros a usar técnicas baseadas em transformação na pesquisa WCR. Além de estender as tecnologias transgênicas para WCR para uso em estudos de genômicos funcionais, estas técnicas também permitem poderosas novas estratégias de controle de pragas tais como gene unidade23,24 a ser testado neste economicamente importante pragas.

<table><tbody><tr><td>Papel de Filtro Qualitativo (Preto)</td><td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>Para microinjeção de ovo</td></tr><tr><td>Recipientes de 1 oz&nbsp;</td><td>Talheres de Plástico Anny's</td><td>ASET101</td><td>Recipiente para ovos</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Tipo II</td><td>Apex</td><td>66-103</td><td>Substrato para prato de postura de ovos WCR</td></tr><tr><td>Fórceps Featherweight&nbsp;</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>Manuseio de larvas e pupas&nbsp;</td></tr><tr><td>Clorox Regular-Bleach1</td><td>Clorox</td><td>44600-30770</td><td>Lave milho e pratos</td></tr><tr><td>Trucker's Favorite Yellow</td><td>Coor Farm Supply</td><td>502</td><td>Milho para alimentação Sistema</td></tr> de <tr><td>Microinjeção WCR (Caseiro)</td><td>NA</td><td>Peças e instruções disponíveis mediante solicitação</td><td>Controla a pressão de injeção (0-20 psi)</td></tr><tr><td>Elmer's Non-toxic Glue</td><td>Elmer's Products, Inc.</td><td>E304</td><td>Cole ovos em papel de filtro</td></tr><tr><td>epTIPS Microloader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>Pontas de carregamento de agulhas de aterro</td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates</td><td>Falcon</td><td>25383-103</td><td>Milho germinado /150 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Círculos de Papel de Filtro de Grau Quantitativo</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47576C</td><td>Prato de Fazer ágar para postura de ovos/9cm</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-320-4</td><td>Lavar pratos</td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio Simples</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549-3</td><td>Segurando papel de filtro e ovos para microinjeção</td></tr><tr><td>Verme da Raiz do Milho Ocidental sem Substituto de Pólen</td><td>Frontier Agricultural Sciences&nbsp;</td><td>F9766B</td><td>WCR Bolas de Algodão para Dieta Artificial para Adultos</td></tr><tr><td>, Grandes</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>Feche o frasco</td></tr><tr><td>Pipetas de Transferência de Bulbo Pequeno Globe Scientific 3.0 mL</td><td>Globe Scientific</td><td>137035</td><td>Colete e transfira ovos</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio de Fluorescência Leica M165 FC&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M165 FC&nbsp;</td><td>Triagem WCR</td></tr><tr><td>Conjunto de Filtros DsRed para Estereomicroscópio de Fluorescência</td><td>Leica</td><td>DSR</td><td>Filtro de excitação: 510-560 nm, filtro de emissão: 590-650 nm</td></tr><tr><td>Filtro EGFP</td><td>Leica</td><td>GFP2</td><td>Filtro de excitação: 440&ndash; 520 nm, filtro de emissão: 510 nm</td></tr><tr><td>BugDorm</td><td>MegaView Science</td><td>DP1000_5P</td><td>Cage para colônia adulta</td></tr><tr><td>Pincel de pintura miniatura</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>Liner 2/0&nbsp;</td></tr><tr><td>Micromanipulador de Joystick</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>Micromanipulador e porta-agulha</td></tr><tr><td>Microscópio XY Stage</td><td>Olympus</td><td>265515</td><td>Microscópio stage (adaptado para uso com estereoscópio)</td></tr> <tr><td>Gaze de Grau 90</td><td>Loja Online de Tecidos</td><td>CHEE90</td><td>Para Egg-Lay</td></tr><tr><td>Filme de parafina de plástico&nbsp;</td><td>Embalagem Plástica Pechiney</td><td>PM-996</td><td>Selar prato de ágar após microinjeção/Tamanho do rolo 4 in. x 125 pés</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Percival&nbsp;</td>Câmara <td>de Crescimento WCR I41VLH3C8 (incubadora de criação de insetos)</td><td></td></tr> <tr><td>Frascos Erlenmeyer de Boca Estreita</td><td>VWR</td><td>4980-300-PK</td><td>Recipiente de água para colônia adulta&nbsp;</td></tr><tr><td>Copos de Forma Baixa Griffin</td><td>VWR</td><td>1000-600-PK</td><td>Para Lavagem</td></tr> de <tr><td>Ovos Rolos de Algodão Trançado</td><td>Richmond Dental Cotton Co.</td><td>605-3599</td><td>Uso no abastecimento de água para colônias de adultos&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de Petri (35x10mm)</td><td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>Para placas de dieta</td></tr><tr><td>Fenol Vermelho</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>Tampão de microinjeção</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta baseado em laser</td><td>Instrumento Sutter</td><td>P-2000/G</td><td>Extrator de agulhas/Calor = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td></tr><tr><td>Solo superficial premium</td><td>The Scotts Company</td><td>71130758</td><td>Solo para cultivo</td></tr> <tr><td>de cronSacos com zíper Reloc Zippit 2 Mil</td><td>United States Plastic Corporation</td><td>48342</td><td>Saco de ágar após microinjeção/5x7</td></tr><tr><td>Placas de Petri (100x15m)</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>Fazendo prato de ágar para postura de ovos/ Recipientes de 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>6 oz</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCR câmara de acoplamento de par único&nbsp;</td></tr><tr><td>Recipientes de 38 oz</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td><td>Caixa de criação de larvas/38 oz</td></tr><tr><td>ChoiceHD 16 oz. Recipiente de plástico translúcido para micro-ondas</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td><td>Caixa de criação de larvas/16 oz</td></tr><tr><td>Escopo de microinjeção&nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td><td>Escopo de microinjeção equipado com um estágio XY</td></tr><tr><td>Capilares de vidro padrão</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Agulhas de microinjeção</td></tr><tr><td>Vermes da raiz do milho ocidental</td><td>adulto North Centeral Pesquisa aquícola Laboratório</td><td>Cepa não diapase</td><td>Solicitação do laboratório do Dr. Bryan Wade French</td></tr><tr><td>Kit Midi de DNA de plasmídeo</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Purificação de DNAs de plasmídeo prontos para injeção</td></tr></tbody></table>

microinjeção de western milho repele, diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma crispr/cas9

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Repele o milho (RPT) é uma importante praga do milho e é conhecida por sua capacidade de rapidamente se adaptar às estratégias de manejo de pragas. Embora o RNA de interferência (RNAi) provou para ser uma poderosa ferramenta para estudar Biologia WCR, tem suas limitações. Especificamente, RNAi em si é transitório (ou seja, não resulta em longo prazo mendeliana do fenótipo associado), e exige saber a sequência de DNA do gene alvo. Este último pode ser um fator limitante se o fenótipo de interesse é controlado por genes mal conservados, ou mesmo romance, porque identificar alvos úteis ia ser um desafio, se não impossível. Portanto, o número de ferramentas caixa de ferramentas genômicas do WCR deve ser expandido pelo desenvolvimento de métodos que pode ser usada para criar cepas mutantes estáveis e permitir pesquisas independentes de sequência do genoma WCR. Neste documento, detalhamos os métodos usados para coletar e microinjeção precellular WCR os embriões com ácidos nucleicos. Enquanto os protocolos descritos visam a criação de transgénico WCR, edição de CRISPR/Cas9-genoma poderia também ser realizada utilizando os mesmos protocolos, com a única diferença é a composição da solução injetada os embriões.

Uma consideração importante ao desenvolver este protocolo foi palco do desenvolvimento embrionário no momento da microinjeção. Especificamente, o germline transformação requer microinjeção de DNAs antes celularização embrionária. Isso ocorre porque o DNAs facilmente não podem atravessar as membranas celulares. Tenta visualizar os estágios do desenvolvimento embrionário WCR, usando uma mancha nuclear não tiveram sucesso porque dechorionation de embriões WCR essencialmente dissolve todas as...

Aqui nós apresentamos protocolos para coletando e microinjecting precellular milho ocidental embriões repele com a finalidade de realizar ensaios funcionais-genômica como germline transformação e edição de CRISPR/Cas9-genoma.

Microinjeção de Western milho repele, Diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

O objetivo geral deste protocolo de microinjeção é modificar o genoma do verme da raiz do milho ocidental. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a biologia da lagarta da raiz do milho ocidental e sua capacidade de superar rapidamente os métodos de controle de pragas, como a toxina BT e a RANI. Além dos vermes da raiz do milho ocidental, este método também pode ser aplicado a espécies semelhantes, como os vermes do sul e do norte.Tive a ideia desse método pela primeira vez quando me pediram para ajudar com RANI baseado em injeção no Western Corn Rootworm nos anos 90. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades. Porque a criação de vermes da raiz do milho ocidental em laboratório é trabalhosa.E as taxas de sobrevivência permanecem baixas usando a tecnologia atual. Obtenha entre 500 e 1.000 adultos vermes da raiz não diapausados de uma empresa confiável ou laboratório de pesquisa. E abrigá-los em gaiolas de 30 centímetros cúbicos.Armazene a dieta artificial padrão do verme da raiz em recipientes de armazenamento de alimentos com cerca de um centímetro de profundidade. A dieta não utilizada pode ser armazenada a quatro graus Celsius por até dois meses. Para alimentar o verme da raiz, carregue placas de Petri de 100 centímetros com 10 a 15 gramas de dieta.Coloque um prato de comida em cada gaiola de verme. E reabasteça-o quando o suprimento acabar ou a dieta secar. Mantenha também um reservatório de água de 300 mililitros, coberto por uma bola de algodão, em cada gaiola para servir como fonte de água.Troque a água quando ela estiver baixa. Mantenha o verme da raiz enjaulado a 26 graus Celsius com 60% de umidade e um ciclo de luz 14/10 em uma incubadora de criação de insetos. Defina o horário de apagar as luzes no final do dia, como à meia-noite, para que os ovos sejam postos antes do horário de trabalho matinal.Primeiro, colete os embriões. Para uma superfície de coleta de ovos, carregue uma placa de Petri de 100 milímetros com 30 mililitros de ágar 1% e água. Em seguida, coloque uma única camada de papel de filtro no ágar, seguida de quatro camadas de pano de queijo.Cada camada deve ser cortada no tamanho certo. Em seguida, o mais tarde possível, coloque o prato de coleta de ovos na gaiola do verme da raiz e cubra-o com uma tenda de papel alumínio. Então, na manhã seguinte, remova a câmara de coleta de ovos.Use uma pinça para pegar uma camada de pano de queijo de cada vez e coloque em um copo de 500 mililitros carregado com água. Lave os ovos do pano de queijo girando na água. Em seguida, use uma pipeta de bulbo para transferir os ovos para outro copo de água como etapa de lavagem.Execute duas ou três lavagens dessa maneira. Em seguida, deposite os ovos limpos em papel de filtro com o mínimo de água possível. Em seguida, prepare um slide colando um pedaço de papel de filtro preto no slide para melhorar o contraste.Em seguida, regue linhas finas de cola não tóxica no papel que será usado para prender os ovos. Mantenha a cola abaixo da circunferência de um ovo. Enquanto a cola estiver molhada, use um pincel fino para colocar os ovos na linha de cola.Mantenha pelo menos a distância de um ovo entre cada ovo. Prepare várias linhas de ovos por lâmina. Os óvulos devem agora ser injetados em 30 minutos.Agora, combine o plasmídeo auxiliar, o plasmídeo doador e o tampão vermelho de fenol. Use plasmídeos super enrolados de alta qualidade feitos com um kit comercial livre de endotoxinas. Fortex brevemente para misturar.E então gire as partículas por três minutos na velocidade máxima. Em seguida, o preenchimento puxou as agulhas de vidro borossilicato com 0,5 a 1 microlitros de solução injetável. Se alguma bolha se formar, certifique-se de removê-la.Em seguida, conecte a agulha de injeção ao micromanipulador. Agora, se necessário, sob o microscópio, quebre suavemente a ponta da agulha selada usando uma pinça fina ou tocando suavemente a ponta em uma barreira de vidro. Tente fazer a menor abertura possível que libere a solução de injeção.Antes de injetar os ovos do verme, use um pincel fino para molhar cuidadosamente a superfície de um a três ovos preparados com água estéril. Em seguida, injete os embriões molhados. Insira suavemente a agulha no meio do embrião e injete um pequeno volume de solução.Comece usando 10 a 13 psi de pressão e ajuste a pressão conforme necessário. Os embriões secos têm uma forma redonda distinta, ao pré-umedecer cada embrião com água mudará sua forma e amolecerá a casca do ovo, permitindo que a agulha penetre facilmente. Um embrião injetado com sucesso terá uma pequena quantidade de cor vermelha.Se um ovo foi danificado, parece peculiar ou não pode ser injetado, esmague-o ou remova-o da lâmina. Depois que todos os ovos forem injetados, mova o papel de filtro com os ovos para uma placa de ágar 1%. Em seguida, sele o prato com filme de parafina e incube-o a 26 graus Celsius até que as larvas eclodam.12 dias após a injeção, comece a verificar se há larvas todos os dias nas próximas duas semanas. Transfira as larvas usando uma escova fina para uma caixa de criação com milho germinado e solo para criá-las em condições padrão. A transformação germinativa do verme da raiz foi tentada co-injetando um plasmídeo portador de transposase com um plasmídeo transportador de transposon em embriões pré-celulares.Nos 26 sobreviventes, cada expressão de PFE foi usada para rastrear a inserção do elemento doador. Embora a progênie torácente tenha sido identificada, a triagem de embriões de vermes da raiz com a fonte de luz intensa provou ser letal. A próxima rodada de transformação da linha germinativa utilizou um gene de proteína fluorescente vermelha impulsionado por um promotor constitutivamente ativo de Drosophila melanogaster.As taxas de sobrevivência melhoraram, mas apenas uma larva vermelha positiva para DS foi registrada. Em seguida, os embriões foram microinjetados com tampão sozinho ou com plasmídeos de DNA de doadores auxiliares e marcados com toque. Uma proporção semelhante de embriões eclodiu quando injetado apenas com plasmídeos ou tampão.E, curiosamente, apenas cerca de metade dos embriões não injetados eclodiram. Isso colocou a letalidade de manipular os embriões para a injeção tão alta quanto realizar a injeção. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como microinjetar embriões de parede radicular de milho ocidental.Uma vez dominado, duzentos a trezentos embriões podem ser injetados por hora usando esta técnica. Este método é devido às técnicas desenvolvidas para a transformação da linha germinativa de Drosophila melanogaster, que servem como modelos aplicáveis a muitas outras espécies. Seguindo este procedimento, outros métodos, como a edição do genoma baseada em CRISPR / Cas9, podem ser realizados para fazer mutações direcionadas no genoma da parede da raiz do milho ocidental.A fim de responder a perguntas específicas sobre a função do genoma.

microinjection-western-corn-rootworm-diabrotica-virgifera-virgifera

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo descreve a microinjeção, um método comum de criação de cepas transgênicas de C. elegans. No exemplo, veremos a microinjeção usada para introduzir um complexo de ribonucleoproteína (RNP) para edição de genes baseados em CRISPR.

Microinjeção de gônadas: um método de entrega de compostos diretamente na linha germinativa de C. elegans

A mosca-das-frutas do Mediterrâneo Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) é uma praga mundial da agricultura. Uma compreensão mais profunda de sua biologia é fundamental para controlar as populações de moscas e, assim, reduzir o impacto econômico. A microinjeção de embriões é uma ferramenta fundamental que permite tanto a transformação da linha germinativa quanto os estudos genéticos reversos nesta espécie.

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Microinjeção de Nasonia vitripennis embriões é um método essencial para gerar modificações hereditárias do genoma. Aqui descrito é um procedimento detalhado para microinjeção e transplante de embriões Nasonia vitripennis , que facilitará grandemente a manipulação futura do genoma deste organismo.

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

Este protocolo descreve procedimentos de microinjeção para embriões culex quinquefasciatus que são otimizados para trabalhar com ferramentas de edição de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica pode gerar eficientemente mutações de germes específicas, hereditárias e germinais que podem ser usadas para a construção de tecnologias genéticas neste vetor de doença subestudado.

Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus

Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.

Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat

Aqui, descrevemos métodos para injeções pupais eficientes e adultas em Nasonia vitripennis como alternativas acessíveis à microinjeção de embriões, permitindo a análise funcional de genes de interesse usando RNA-silenciamento via interferência de RNA (RNAi) ou nocaute genético via edição de genoma CRISPR/Cas9.

Injeções de pupal e adultos para edição de genes RNAi e CRISPR em Nasonia vitripennis

Este protocolo detalha as etapas da mutagênese direcionada do CRISPR/Cas9 em moscas de areia: coleta de embriões, injeção, criação de insetos e identificação, bem como seleção de mutações de interesse.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9

Muitas características da eussocialidade dos insetos dependem da comunicação dentro da colônia e da divisão do trabalho. A manipulação genética de genes-chave reguladores em embriões de formigas via microinjeção e mutagênese mediada por CRISPR fornece insights sobre a natureza do comportamento altruísta em insetos eussociais.

Injeções embrionárias para mutagênese mediada por CRISPR no saltador de formigas Harpegnathos

Apresentado aqui está um protocolo de microinjeção de embrião Helicoverpa armigera (Hübner) e identificação mutante nocaute criada pela edição do genoma CRISPR/Cas9. Insetos mutantes permitem mais pesquisas sobre a função genética e a interação entre diferentes genes in vivo.

Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

Trata-se de protocolos de coleta e microinjeção de embriões pré-celulares de cigarrinhas de milho com a finalidade de modificar seu genoma via edição genômica baseada em CRISPR/Cas9 ou para a adição de elementos transponíveis marcados por meio de transformação germinativa.

Microinjeção de cigarrinha de milho, Peregrinus maidis, Embriões para edição do genoma CRISPR/Cas9

Este artigo demonstra a engenharia genômica mediada por CRISPR-Cas9 em Steinernema hermaphroditum, um nematoide entomopatogênico (EPN: parasita inseto) e um modelo genético emergente. A tecnologia descrita é útil para criar mutantes, permitindo a elucidação das funções gênicas na biologia dos nematoides relevantes para simbiose mutualista e parasitária.

Mutagênese baseada em CRISPR-Cas9 no Nematoide Entomopatogênico Steinernema hermaphroditum e a Manutenção de Linhas Mutantes

Aprenda microinjeção em embriões de Diabrotica virgifera virgifera para transformação da linha germinal e edição de genoma CRISPR/Cas9. Este método permite estudos funcionais em genômica de pragas agrícolas.

Microinjeção de Western milho repele, Diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma CRISPR/Cas9 (Vídeo) | JoVE Journal

Microinjeção de Western milho repele, Diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma CRISPR/Cas9

Explorar mais vídeos