Name: Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprenda mutagênese aleatória de gene-alvo para selecionar mutantes do proteassoma que desestabilizam heterocromatina em levedura de fissão. Este método permite investigar genes essenciais e mecanismos epigenéticos.

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Financiamento apoio para este projeto foi fornecido pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (2016R1A2B2006354).

1. preparação dos meios de comunicação
<ol><li>Prepare extracto de levedura com suplementos (Sim), sim sem adenina (Sim Ade de Low), média de Pombe Glutamate (PMG12) e PMG sem adenina (PMG-Ade) misturando os componentes conforme descrito na tabela 1. Sim-Ade (Ade de baixo) e placas de PMG-Ade têm todos os mesmos componentes, mas a adenina é omitida do último.<ol>
<li>Usar o estoque de sal (50 x) a seguir: 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2G/L CaCl2·2H2O, 50 g/L de KCl, 2G/L at2para4 em água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 µm e armazenar a 4 ° C.</li>
		<li>Use a seguinte vitamina (1, 000 x) estoque: pantotenato de 1 g/L, inositol 10 g/L, 10 g/L ácido nicotínico, biotina 10 mg/L em água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 µm e armazenar a 4 ° C.</li>
		<li>Use o seguinte mineral (10, 000 x) estoque: 5 g/L ácido bórico, 4G/L MnSO4, 4G/L ZnSO4·7H2O, 2G/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1G/L de KI, 0,4 g/L de CuSO4·5H2O , 10 g/L ácido cítrico em água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 µm e armazenar a 4 ° C. Nota: Sim líquido de cobertura pode ser feito omitindo o ágar-ágar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Autoclave a médio e resfriá-lo para abaixo de 60 ° C, agitando com uma barra de agitação, à taxa de 200 rpm.</li>
	<li>Para placas de Sim + G418 (geneticin), adicione 1 mL/L G418 de solução para o meio de Sim.<ol>
<li>Use o seguinte G418 (1, 000 x) estoque: 100 mg/mL G418 em água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 µm, alíquota para tubos de centrífuga de 1,5 mL e loja a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mexa por mais 5-10 min e alíquota da mídia em pratos de Petri-90mm (1L de alíquotas médias de aproximadamente 40 pratos de Petri. Armazenar as placas a 4 ° C.</li>
</ol>2. clonagem de rpt4 + e seus 5' / 3' UTRs
<ol><li>Realizar PCR com primers p1 e p2 (figura 1A) usando fissão fermento DNA genômico (gDNA) como o modelo em um volume total de 50 µ l (~ 1 µ g DNA, enzima de U 20, tampão de reação 1x), e aplicando os ciclos de reação descritos na tabela 2 para amplificar uma 3.315-base fragmento de par (bp) compreendendo rpt4 + e seus 5' / 3' UTRs. Purifica o produto do PCR usando um kit de purificação13 conforme indicado pelo fabricante (figura 1A).</li>
	<li>Digerir o pBlueScript KS(-) vector14 e o fragmento de DNA amplificado contendo rpt4 + com sua 5' / 3' UTRs com BamH1 e Xho1 em um volume total de 20 µ l (~ 1 µ g DNA, enzima de U 20, 1 tampão de digestão x) a 37 ° C em banho-maria para 16-18 h (figura 1B).</li>
	<li>Gel de purificar o vetor digerido (gel de agarose 1,2%) e DNA inserir pela realização de eletroforese em gel de agarose TAE-baseado (100 V, 1 h), extirpando as bandas de DNA dos tamanhos desejados e isolar o DNA com um gel de extração kit15.</li>
	<li>Ligam o vetor e inserção de DNA usando T4 DNA ligase realizando uma reação de ligadura de 20 µ l contendo 50-100 ng de DNA, vetor um ~ 3 vezes excesso molar de ligadura tampão 1x, 400 ligase do DNA de T4 U e o DNA de inserção. Incube a mistura a 18 ° C, durante 16-18 h.</li>
	<li>Transformar o DNA ligado em 100 µ l de e. coli DH5α aplicando choque térmico para 70 s a 42 ° C. Adicionar 1 mL de LB e incubar durante 1 h a 37 ° C, para a recuperação. Realizar a centrifugação (13.800 x g), descartar a sobrenadante, placa todos os transformado Escherichia coli células em placas LB-ampicilina (LA) e incubar a 37 ° C, durante 16 h.</li>
	<li>Escolha 4-8 colônias com palitos de dente e crescer durante a noite a 37 ° C, no meio de 3 mL de LA.</li>
	<li>Isolar o plasmídeo com um plasmídeo purificação kit16 usado de acordo com o protocolo do fabricante e executar analítica enzima de restrição digestões com 5 µ l do plasmídeo isolado, 5 U de cada enzima de restrição (BamH1 e Xho1) e 1 x buffer de restrição. Incube a mistura a 37 ° C em banho-maria por 3 h. confirmar a clonagem por sequenciamento plasmídeos de candidato.</li>
</ol>3. introdução da mutação silenciosa (Xho1 Site de restrição)
<ol><li>Desenha um par de primers 33-bp (p3 e p4) que contêm a mutação desejada na sequência de outra forma complementar.</li>
	<li>Realizar o PCR com alta fidelidade do polymerase17 (Figura 1) em um volume total de 25 µ l (10 ng de plasmídeo clonado, 2 µ l de 10 pmol cartilha mix, enzima de U 2, tampão de reação 1x) usar os ciclismo parâmetros listados na tabela 3.</li>
	<li>Digeri o plasmídeo de modelo com DpnI em um volume total de 20 µ l (20 U enzima, 1x tampão de digestão) a 37 ° C em uma água de banho para 1 h.</li>
	<li>Transformar, propagar, isolar e sequenciar o plasmídeo contendo a mutação silenciosa, conforme descrito nas etapas 2.5-2.7. Nota: A mutação silenciosa também pode ser introduzida usando um método de clonagem que permite a junção de vários fragmentos de DNA em uma única reação de18.</li>
</ol>4. random Mutagenesis de rpt4 + pelo PCR propensa
<ol><li>Realizar PCR propensa, usando o plasmídeo com a mutação silenciosa (Xho1 site) como o modelo de primeiras demão p5 e p6, um volume total de 50 µ l (a quantidade de modelo definido na etapa 4.1.1, 2 µ l de mistura de primeira demão 10 pmol, enzima de U 2.5, 1 amortecedor da reação x) , e uma polimerase especial que foi projetada para gerar um erro de alto taxa19 (Figura 1). Realize PCR conforme descrito na tabela 2.<ol>
<li>Use 4-5 µ g de plasmídeo de modelo para controlar a frequência de mutação para 1 bp/kb (quilobase). Nota: Uma alta concentração (> 500 ng / µ l) de plasmídeo, que pode ser obtido usando um prep mini kit20, é necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use a electroforese do gel para confirmar um produto do PCR da bp 2670 (gel de agarose 1,2%). Gel de purificar este produto PCR conforme descrito na etapa 2.5.</li>
</ol>5. preparação de fragmentos PCR de fusão (KAN, 3' UTR)
<ol><li>Realizar PCR usando pFA6a-KANMX621 como o modelo, as primeiras demão p7 e p8, e as condições listadas na tabela 4 para obter o fragmento de marcador (KAN). Gel de purificar o fragmento resultante de 1.480-bp, conforme descrito na etapa 2.5 (Figura 1E).<ol>
<li>Verifique se o códon de parada do gene alvo de mutação e região codificante do gene sua adjacente são separados por mais de 500 bp. O terminador endógeno não pode ser utilizado quando esta região é inferior a 500 bp; em vez disso, o exterminador de ADH deve ser usado em vez do Exterminador do futuro endógena. As mudanças de protocolo necessárias para usar o terminador de ADH são apresentadas na tabela 5. Nota: Essas alterações só se aplicam quando o exterminador de ADH , que está disponível no plasmídeo pFA6a-3HA-KANMX6, é usado em vez do Exterminador do futuro endógena.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar PCR com o clonado rpt4 +-contendo o vetor como o modelo e as primeiras demão p9 e p10 em um volume total de 50 µ l (20 ng do plasmídeo clonado, 2 µ l de 10 pmol cartilha mix, enzima de U 2, tampão de reação 1x), usando as condições apresentadas na tabela 6. Gel de purificar obtidos 506-bp 3' UTR fragmento (Figura 1E).</li>
</ol>6. geração de construção de transformação pela fusão do PCR (Figura 1E)
<ol><li>Prepare os 3 fragmentos (mutagenized + rpt4, KAN e os 3' UTR) em 50 ng / µ l.</li>
	<li>Realize fusão que PCR dos três fragmentos usando as primeiras demão p11 e p12, conforme descrito na tabela 7. (O protocolo para fusão do PCR é uma modificação do protocolo original22). Purifica o principal produto do PCR 4.398-bp.<ol>
<li>Usar rpt4 +: KAN:3'UTR fragmentos na proporção de 1:3:1 para obter melhores resultados. Nota: A quantidade total de DNA da inserção não deve exceder 500 ng. A quantidade recomendada de rpt4 +: KAN:3'UTR é 50 ng:150 ng:50 ng. A região mutagenized é aproximadamente 1,6 kb, então o número mínimo de colônias de levedura que seriam responsáveis por todas as combinações possíveis de cada base, sendo uma mutação para os outros três é 1.600 x 3 = 4.800 colônias. Como uma reação de transformação normalmente produz colônias de 400-500, pelo menos 10 reações vale de fusão PCR construir é necessária. Esta necessidade pode ser satisfeita, simplesmente aumentando a quantidade de reação (isto é, o número de tubos PCR) por um fator de dez.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. transformação de leveduras de fissão por eletroporação (Figura 1F)
<ol><li>Inocule o fermento para 10 mL de meio de sim a saturação incubando-o por mais de 16 h.</li>
	<li>Diluir as células de uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de 0,2 em 200 mL de meio de Sim e incubar a 30 ° C, com agitação por 5-6 h, a OD600 = 0.6 - 0.8.</li>
	<li>Concentre-se em células para OD600 = 30, dispense a quatro tubos de Erlenmeyer de 50 mL e relaxar no gelo por 10 min.</li>
	<li>As células da colheita, realizando a centrifugação a 1.050 x g por 3 min a 4 ° C. Coloque os tubos e 10 electro-cubetas no gelo. Execute as etapas 7.3-7,8 no gelo.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e adicionar 15 mL de sorbitol de 1,2 M. Agite os tubos para Ressuspender as células.</li>
	<li>Centrifugar as células a 1050 x g, durante 3 min a 4 ° C.</li>
	<li>Repita os passos de 7.4 e 7.5. Desprezar o sobrenadante. Adicionar 500 µ l de sorbitol 1,2 M para cada tubo, Ressuspender as células e coletar todas as células em um tubo cônico de 15 ml.</li>
	<li>Adicionar o sorbitol 1,2 M a 2,4 mL (OD600 = 10 / 0,2 mL). Mantenha o tubo no gelo.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l de células de sorbitol-suspenso (certifique-se que eles são totalmente suspensos) para um tubo novo EP contendo a fusão do PCR construir, misture bem e transferir a amostra para um electro-cubeta.</li>
	<li>Electroporate as células com as seguintes opções: fungos, ShS (2.00kV, 1 pulso).</li>
	<li>Adicionar 600 µ l de sorbitol 1,2 M para cada electro-cubeta para um volume total de 800 µ l e em seguida, espalhe as células em quatro placas Sim (200 µ l/placa). Electro-10 cubetas dispensará a 40 sim placas.</li>
	<li>Incube as placas a 30 ° C por 24 h.</li>
	<li>Executar o chapeamento de réplica para Sim + G418 e incubar as placas a 30 ° C durante 3 dias.</li>
</ol>8. seleção de heterocromatina-desestabilizando mutantes e verificação de falsos positivos
<ol><li>Para cada placa de Sim + G418, execute o chapeamento de réplica para Sim-Ade (Ade baixo) e placas de PMG-Ade (Ade n). Incube as placas réplica por 1-2 dias a 30 ° C, até algumas das colônias nas placas Sim-Ade mostram uma coloração vermelha (Figura 1).</li>
	<li>Compare placas Sim-Ade e PMG-Ade e selecione células que mostram rosa ou branco na placa sim-Ade e também crescem na placa PMG-Ade. Não selecione colônias sem crescimento na PMG-Ade, como eles são falsos positivos (por exemplo, refletindo que a gaveta de KAN foi integrada em um local não-alvo Noutras partes do genoma).</li>
	<li>Pegue aproximadamente 1 x 105 células de cada colônia e incubar em 10 µ l de solução SPZ contendo 2,5 mg/mL zymolyase 100 T a 37 ° C durante pelo menos 30 min. utilizar 1 µ l desta solução para executar como o modelo inicial para colônia PCR (Figura 1 H).<ol>
<li>Fazer SPZ (50 mL) pela mistura de 30 mL de sorbitol 2m, 4,05 mL de 1 M Na2HPO4, 0,95 mL NaH2PO4 e 15 mL de água destilada (pH final, 7,5). Amostras (5 mL) podem ser suplementadas com zymolyase e armazenadas em alíquotas de 500 µ l a-20 ° C até o uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize a eletroforese em gel (gel de agarose 1,2%, 180V, 20 min) para visualizar os resultados de + a PCR de colônia. Selecione as reações que apresentam bandas PCR de tamanho adequado e digerem 5 µ l de cada produto da reação com XhoI (4 enzima U, 1 tampão de digestão x, banho-maria a 37 ° C, 1 h) para filtrar falsos positivos (Figura 1 H).</li>
	<li>Realize a eletroforese em gel para visualizar os sumários de XhoI (gel de Agarose 1,2%, 180 V, 20 min). Marca as colônias cujos produtos PCR são cortados por XhoIe passe-os para Sim + G418 placas (Figura 1I).</li>
	<li>Isolar gDNA partir de células de levedura de fissão e realizar o sequenciamento da PCR produtos23. Compare a sequência obtida com sequência de tipo selvagem para identificar mutações (Figura 1I).</li>
	<li>Diretamente Re-Introduza o mutation(s) de células de tipo selvagem, transformando-os com construções de fusão amplificadas por PCR de células mutantes23. Use a mancha para confirmar o fenótipo nas células mutantes recém-feitos (Figura 1J).<ol>
<li>Construção de transformação de fusão pode ser facilmente amplificada por PCR com primers p1 e p10 usando o DNA genômico de mutantes como o modelo em um volume total de 50 µ l (~ 1 µ g DNA, enzima de U 20, tampão de reação 1x) e aplicando os ciclos de reação descritos no tabela 2 . Transformação da construção pode ser feita seguindo as etapas 7.1-7.13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Seo, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+19S+proteasome+is+directly+involved+in+the+regulation+of+heterochromatin+spreading+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast.</a> J Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Tang, N. H., et al. <a target="_blank" href="https://peerj.com/preprints/3377/">Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body.</a> PeerJ Preprints. 5, e3377v3371(2017).</li>
<li>Rasooly, A., Weisz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antibacterial+activities+of+phloxine+B+and+other+halogenated+fluoresceins+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).</li>
<li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+mutagenesis+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Random mutagenesis by PCR.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 8. Unit 8 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Mutagénese aleatória através de PCR propensa é uma ferramenta poderosa para gerar um pool diversificado de mutantes em uma determinada região. Esta técnica é especialmente útil para estudos que visam avaliar a função de uma proteína em uma circunstância específica. Por exemplo, usamos aqui PCR propensa para avaliar a função da subunidade de proteossomo 19S, Rpt4, em manutenção de heterocromatina. Variando a região alvo de PCR propensa e ajustando as condições de triagem, fomos capazes de transformar células na região gen...

Genética para a frente é um método clássico em que pesquisadores buscam naturalmente mutantes que exibem um fenótipo específico e realizar análises genéticas. Em genética reversa, mutações são introduzidas em um gene de interesse e o fenótipo é examinado. Neste último caso, mutagênese aleatória de um gene alvo muitas vezes é usado para gerar um grupo de mutantes que posteriormente são selecionados para desejado fenótipos, tais como a sensibilidade à temperatura ou alterado a atividade enzimática. Podem ser utilizados vários métodos para alcançar o mutagenesis aleatório, incluindo propenso a PCR1; De irradiação UV2; mutagênicos químicos, tais como Metanossulfonato de etila (EMS) ou ácido nitroso3; o uso de cepas de modificador temporário, tais como aqueles excesso expressando mutD5 4; e DNA baralhar5.
Aqui, descrevemos uma estratégia reverso-genética em que utilizamos PCR propensa para gerar piscinas mutantes para um gene alvo no fermento a fissão. Como se pode adivinhar seu nome, este método gera mutações deliberadamente introduzindo erros durante a PCR. Ao contrário de outros métodos de mutagénese, propenso a PCR permite ao usuário definir a região a ser mutagenized. Isto o torna particularmente útil nos esforços para estudar a função de um domínio/proteína de interesse.
Para demonstrar este procedimento de mutagênese aleatória, aqui usamos o rpt4 +, que codifica a subunidade de proteossomo 19S, como exemplo. Rpt4 tem sido demonstrado que têm funções independente de proteólise em organismos que não sejam fissão fermento6,7,8,9, e um defeito na proteólise pode causar efeitos indiretos, alterando as proteínas níveis. Nós, portanto, selecionados para mutantes que desencadeou mudanças de proteólise-independente, com o objetivo de investigar a função da Proteassoma em heterocromatina.
Propenso a PCR pode ser aplicado a qualquer região do gene ajustando o local em que as primeiras demão vincular. Mutantes que apresentam a mudança fenotípica desejada podem ser identificados com repórteres apropriados. Aqui, utilizamos um repórter ade6 + inserido no Centrómero 1 exterior repetição (otr) região10. Heterocromatina constitutiva é formada nesta região11, então o repórter ade6 + é silenciado na condição de tipo selvagem; Isto é indicado por colônias vermelho10. Uma mutação que desestabiliza a heterocromatina constitutiva no Centrómero conduzirá à expressão do repórter ade6 + , que é visualizada como colônias brancas.

<table><tbody><tr><td><forte>1. Mídia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Extrato de levedura Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de adenina</td><td>ACR</td><td>16363-0250</td><td></td></tr><tr><td>Uracila&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JUNSEI</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Ftalato</td><td>de potássio Sigma-Aldrich</td><td>P6758-500g</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508-50G</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7634-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&bull; 7H2O&nbsp;</td><td>JUNSEI</td><td>83060-031</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&bull; 4H2O</td><td>KANTO</td><td>CB8943686</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de sódio di-hidratado</td><td>YAKURI</td><td>31621</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>JUNSEI</td><td>80090-0301</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&bull; 5H2O</td><td>YAKURI</td><td>09605</td><td></td></tr><tr><td>D-mio-inositol</td><td>MP biomedicals</td><td>102052</td><td></td></tr><tr><td>Pantotenato</td><td>YAKURI</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Nicotínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4126-500G</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td></td></tr><tr><td>G418, geneticina</td><td>LPS</td><td>G41805</td><td></td></tr><tr><td>2. Reações enzimáticas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td><td>Aglient</td><td>600380</td><td>Para mutagênese dirigida ao local</td></tr><tr><td>GeneMorphII Kit de mutagênese aleatória</td><td>Aglient</td><td>200500</td><td>Para PCR propenso a erros</td></tr><tr><td>Phusion DNA Polimerase de alta fidelidade</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530L</td><td>Para PCR de fusão</td></tr><tr><td>Ex Taq&nbsp; DNA Polimerase</td><td>Takara</td><td>RR001b</td><td>Para PCR geral</td></tr><tr><td>BamH1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Xho1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>3. Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Velveteen quadrado, preto</td><td>VWR</td><td>89033-116</td><td>Para réplica</td></tr><tr><td>Replica-chapeamento ferramenta</td><td>VWR</td><td>25395-380</td><td>Para réplica</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Biorad</td><td>1652100&nbsp;</td><td>Para transformação de levedura de fissão</td></tr><tr><td>Cubetas de Eletroporação, 0,2 cm de folga</td><td>Biorad</td><td>1652086&nbsp;</td><td>Para transformação de levedura de fissão</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bioer</td><td>BYQ6078</td><td>Para reação de rampa de PCR de fusão</td></tr></tbody></table>

gene-alvo mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando proteassoma mutantes no fermento de fissão

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Mutagénese aleatória de um gene alvo é comumente usado para identificar as mutações que produzem o fenótipo desejado. Dos métodos que podem ser usados para alcançar o mutagenesis aleatório, propenso a PCR é uma estratégia eficiente e conveniente para a geração de um pool diversificado de mutantes (i. e., uma biblioteca de mutante). Propenso a PCR é o método de escolha quando um pesquisador procura para transformar uma região pré-definidos, tais como a região da codificação de um gene, deixando outras regiões genômicas não afetado. Depois que a biblioteca mutante é amplificada por PCR propensa, isso deve ser clonado em um plasmídeo adequado. O tamanho da biblioteca gerada pelo PCR propensa é restringido pela eficiência da etapa de clonagem. No entanto, no fermento de fissão, Schizosaccharomyces pombe, passo a clonagem pode ser substituído pelo uso de uma fusão de uma etapa altamente eficiente do PCR para gerar construções para transformação. Mutantes de fenótipos desejados então podem ser selecionados usando repórteres apropriados. Aqui, descrevemos esta estratégia em detalhe, tomando como exemplo, um repórter inserido no heterocromatina centromérica.

Os mutantes Rpt4 adquiridos, seguindo os procedimentos descritos na Figura 1 podem ser analisados, avaliando as cores das colônias. As cores das colônias são vistas nas chapas de relevantes na diminuição do número de células na Figura 2. O repórter ade6 + inserido na região de heterocromatina é silenciado no selvagem-tipo e mostra vermelhas colônias em placa de Sim-Ade. Uma vez que a heterocromatina é desestabilizada e o...

Este artigo descreve uma metodologia detalhada para o mutagenesis aleatório de um gene alvo no fermento de fissão. Como exemplo, temos como alvo rpt4 +, que codifica uma subunidade do proteossomo 19S e tela para as mutações que desestabilizam a heterocromatina.

Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

O objetivo geral dessa mutagênese aleatória é rastrear mutações que desestabilizam a heterocromatina. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da heterocromatina, como fatores que regulam a formação e manutenção da heterocromatina. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode direcionar especificamente um gene desejado para mutagênese, mesmo que o gene seja essencial.Para começar, prepare o extrato de levedura com suplementos, ou SIM, sem adenina, Pombe Glutamate Medium, ou PMG, e PMG sem adenina, misturando os componentes conforme mostrado nesta tabela. Depois de autoclavar e adicionar G418, se necessário, mexa o meio por mais cinco a dez minutos. Em seguida, alíquota do meio em placas de Petri de 90 mililitros e armazene as placas a quatro graus Celsius.Utilizando o rpt4 positivo clonado, com seus cinco UTRs primos e três primos e mutação silenciosa, bem como os primers p5 e p6 e uma polimerase especial, projetada para gerar uma alta taxa de erro, realizar PCR propensa a erros em um volume total de 50 microlitros. Depois de gerar uma construção de transformação-fusão, de acordo com o protocolo de texto, inocular dez mililitros de meio YES com levedura e incubá-lo por mais de 16 horas até a saturação. Use 200 mililitros de meio SIM para diluir as células para um OD600 de 0,2 e incube a cultura a 30 graus Celsius com agitação por cinco a seis horas para um OD600 de 0,6 a 0,8.Calcule o volume de células que somam OD600 de 30. Em seguida, dispense as células em quatro tubos cônicos de 50 mililitros e leve à geladeira por 10 minutos. Colha as células por centrifugação a 1050 G e quatro graus Celsius por três minutos.Em seguida, coloque os tubos de microcentrífuga com o DNA do e 10 eletrocubetas no gelo. Ainda no gelo, descarte o sobrenadante e adicione 15 mililitros de sorbitol 1,2 molar, agite suavemente os tubos para ressuspender as células e, em seguida, centrifugue as células a 1050 G e quatro graus Celsius por três minutos. Rejeitar o sobrenadante e efectuar uma segunda lavagem com sorbitol.Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células e colete-as todas em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione 1,2 molar sorbitol até 2,4 mililitros.Mantenha o tubo de células no gelo. Em seguida, adicione 200 microlitros de células suspensas por sorbitol a um tubo contendo a construção de PCR de fusão, misture bem e transfira a amostra para uma eletrocubeta. É importante não usar uma quantidade excessiva de PCR, pois isso dará erros de descarga.Eletroporar as células usando as seguintes opções: adicione 600 microlitros de sorbitol 1,2 molar a cada cubeta elétrica para um volume total de 800 microlitros. Em seguida, espalhe as células em quatro placas SIM. Incube as placas a 30 graus Celsius por 24 horas.Em seguida, execute a réplica do revestimento em YES mais G418 antes de incubar as placas por mais três dias. Para cada placa SIM mais G418, execute o revestimento de réplica para SIM sem adenina e PMG sem placas de adenina. Incube as placas de réplica a 30 graus Celsius por um a dois dias até que algumas das colônias no SIM sem placas de adenina mostrem uma coloração branca.Compare SIM sem adenina e PMG sem placas de adenina e selecione células que mostram rosa ou branco no SIM sem placa de adenina, e também crescem no PMG sem placa de adenina. Não selecione colônias sem crescimento em PMG sem adenina, pois são falsos positivos. Escolha cada colônia e adicione-a a 10 microlitros de solução de SPZ contendo 2,5 miligramas por mililitro de zimolia 100T.Em seguida, incube as colônias a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Após a incubação, use um microlitro desta solução como modelo inicial para a PCR da colônia. Depois de digerir as colônias selecionadas e realizar a eletroforese em gel de acordo com o protocolo de texto, marque as colônias cujos produtos de PCR foram cortados por XHO1 e remendo-as para placas SIM mais G418.Após o isolamento do gDNA das células de levedura de fissão e o sequenciamento dos produtos de PCR de acordo com o protocolo de texto, comparar a sequência obtida com a sequência do tipo selvagem para identificar mutações. Uma vez que as mutações são reintroduzidas em células do tipo selvagem, use spotting para confirmar o fenótipo nas células mutantes recém-produzidas. Os mutantes rpt4 gerados usando o protocolo demonstrado neste vídeo podem ser analisados avaliando as cores das colônias.Conforme mostrado nesta figura, as colônias foram localizadas nas placas relevantes em número decrescente de células. O repórter de adenina inserido na região da heterocromatina é silenciado em células do tipo selvagem e produz colônias vermelhas em YES sem placas de adenina. Uma vez que a heterocromatina é desestabilizada e o repórter de adenina é expresso, colônias brancas podem ser observadas no SIM sem placas de adenina, como visto com o mutante clr4-delta.Os mutantes rpt4 rastreados são mostrados com o mutante rpt4-1 exibindo a desestabilização de heterocromatina mais grave. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas semanas para obter os mutantes desejados. Ao tentar este procedimento, é importante eliminar os falsos positivos, pois eles são mais frequentes do que o esperado.Após este procedimento, outros métodos, como purificação de proteínas e testes de atividade enzimática, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a natureza das proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar mutantes em um gene alvo com o fenótipo desejado.

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Aqui demonstramos um protocolo simples para criar uma biblioteca aleatória mutante para uma seqüência alvo. Nós mostramos como esse método, que é realizado in vivo em Escherichia coli, pode ser acoplado com seleções funcional para evoluir novas atividades enzimáticas.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

Aqui apresentamos um método econômico para definir interações químico-genéticas em leveduras em brotamento. A abordagem é construída sobre técnicas fundamentais em biologia molecular de leveduras e é adequada para o interrogatório mecanicista de pequenas e médias coleções de produtos químicos e outros ambientes de mídia.

Identificação rápida de químicos Genéticos Interações em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Apresentamos um protocolo detalhado para construir e rastrear bibliotecas mutantes para campanhas de evolução dirigida em Saccharomyces cerevisiae.

Dirigido Método Evolução<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Criação e Triagem

Nós apresentamos um protocolo para a avaliação funcional de bibliotecas de um único site saturação mutagênese abrangentes de proteínas utilizando sequenciamento de alto rendimento. É importante ressaltar que essa abordagem usa pares de primers ortogonais multiplex construção da biblioteca e sequenciamento. Os resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamase seleccionado a uma dosagem clinicamente relevante de ampicilina são fornecidos.

Um Protocolo de Avaliação Funcional da Whole-Protein saturação mutagênese Bibliotecas Utilizando-High Throughput Sequencing

Geneticamente codificado histona-miniSOG induz mutações hereditárias do genoma de uma forma dependente da luz azul. Este método de mutagénese é simples, rápido, livre de produtos químicos tóxicos, e bem adequada para triagem genética para a frente e integração do transgene.

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Uma estratégia para gerar mutações em genes de histonas em sua localização endógena em Saccharomyces cerevisiae é apresentada.

Visadas<em&gt; In Situ</em&gt; mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

Aqui, apresentamos um método para engenheiro do genoma de c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas e modelos de reparo dependente de homologia.

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

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Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

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Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

Mutantes letais sensíveis à temperatura (ts) são ferramentas valiosas para identificar e analisar funções essenciais. Aqui descrevemos métodos para gerar e classificar seus mutantes letais em alto rendimento.

Alto Throughput Robotically Isolamento Assistida da temperatura sensível Lethal Mutantes em<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Aprenda mutagênese aleatória de gene-alvo para selecionar mutantes do proteassoma que desestabilizam heterocromatina em levedura de fissão. Este método permite investigar genes essenciais e mecanismos epigenéticos.

Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

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