Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

O objetivo geral dessa mutagênese aleatória é rastrear mutações que desestabilizam a heterocromatina. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da heterocromatina, como fatores que regulam a formação e manutenção da heterocromatina. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode direcionar especificamente um gene desejado para mutagênese, mesmo que o gene seja essencial.

Para começar, prepare o extrato de levedura com suplementos, ou SIM, sem adenina, Pombe Glutamate Medium, ou PMG, e PMG sem adenina, misturando os componentes conforme mostrado nesta tabela. Depois de autoclavar e adicionar G418, se necessário, mexa o meio por mais cinco a dez minutos. Em seguida, alíquota do meio em placas de Petri de 90 mililitros e armazene as placas a quatro graus Celsius.

Utilizando o rpt4 positivo clonado, com seus cinco UTRs primos e três primos e mutação silenciosa, bem como os primers p5 e p6 e uma polimerase especial, projetada para gerar uma alta taxa de erro, realizar PCR propensa a erros em um volume total de 50 microlitros. Depois de gerar uma construção de transformação-fusão, de acordo com o protocolo de texto, inocular dez mililitros de meio YES com levedura e incubá-lo por mais de 16 horas até a saturação. Use 200 mililitros de meio SIM para diluir as células para um OD600 de 0,2 e incube a cultura a 30 graus Celsius com agitação por cinco a seis horas para um OD600 de 0,6 a 0,8.

Calcule o volume de células que somam OD600 de 30. Em seguida, dispense as células em quatro tubos cônicos de 50 mililitros e leve à geladeira por 10 minutos. Colha as células por centrifugação a 1050 G e quatro graus Celsius por três minutos.

Em seguida, coloque os tubos de microcentrífuga com o DNA do e 10 eletrocubetas no gelo. Ainda no gelo, descarte o sobrenadante e adicione 15 mililitros de sorbitol 1,2 molar, agite suavemente os tubos para ressuspender as células e, em seguida, centrifugue as células a 1050 G e quatro graus Celsius por três minutos. Rejeitar o sobrenadante e efectuar uma segunda lavagem com sorbitol.

Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células e colete-as todas em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione 1,2 molar sorbitol até 2,4 mililitros.

Mantenha o tubo de células no gelo. Em seguida, adicione 200 microlitros de células suspensas por sorbitol a um tubo contendo a construção de PCR de fusão, misture bem e transfira a amostra para uma eletrocubeta. É importante não usar uma quantidade excessiva de PCR, pois isso dará erros de descarga.

Eletroporar as células usando as seguintes opções: adicione 600 microlitros de sorbitol 1,2 molar a cada cubeta elétrica para um volume total de 800 microlitros. Em seguida, espalhe as células em quatro placas SIM. Incube as placas a 30 graus Celsius por 24 horas.

Em seguida, execute a réplica do revestimento em YES mais G418 antes de incubar as placas por mais três dias. Para cada placa SIM mais G418, execute o revestimento de réplica para SIM sem adenina e PMG sem placas de adenina. Incube as placas de réplica a 30 graus Celsius por um a dois dias até que algumas das colônias no SIM sem placas de adenina mostrem uma coloração branca.

Compare SIM sem adenina e PMG sem placas de adenina e selecione células que mostram rosa ou branco no SIM sem placa de adenina, e também crescem no PMG sem placa de adenina. Não selecione colônias sem crescimento em PMG sem adenina, pois são falsos positivos. Escolha cada colônia e adicione-a a 10 microlitros de solução de SPZ contendo 2,5 miligramas por mililitro de zimolia 100T.

Em seguida, incube as colônias a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Após a incubação, use um microlitro desta solução como modelo inicial para a PCR da colônia. Depois de digerir as colônias selecionadas e realizar a eletroforese em gel de acordo com o protocolo de texto, marque as colônias cujos produtos de PCR foram cortados por XHO1 e remendo-as para placas SIM mais G418.

Após o isolamento do gDNA das células de levedura de fissão e o sequenciamento dos produtos de PCR de acordo com o protocolo de texto, comparar a sequência obtida com a sequência do tipo selvagem para identificar mutações. Uma vez que as mutações são reintroduzidas em células do tipo selvagem, use spotting para confirmar o fenótipo nas células mutantes recém-produzidas. Os mutantes rpt4 gerados usando o protocolo demonstrado neste vídeo podem ser analisados avaliando as cores das colônias.

Conforme mostrado nesta figura, as colônias foram localizadas nas placas relevantes em número decrescente de células. O repórter de adenina inserido na região da heterocromatina é silenciado em células do tipo selvagem e produz colônias vermelhas em YES sem placas de adenina. Uma vez que a heterocromatina é desestabilizada e o repórter de adenina é expresso, colônias brancas podem ser observadas no SIM sem placas de adenina, como visto com o mutante clr4-delta.

Os mutantes rpt4 rastreados são mostrados com o mutante rpt4-1 exibindo a desestabilização de heterocromatina mais grave. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas semanas para obter os mutantes desejados. Ao tentar este procedimento, é importante eliminar os falsos positivos, pois eles são mais frequentes do que o esperado.

Após este procedimento, outros métodos, como purificação de proteínas e testes de atividade enzimática, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a natureza das proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar mutantes em um gene alvo com o fenótipo desejado.