Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele de esferoide melanoma de organotypic 3D que recapitula os dois a arquitetura e complexidade multicelular de um órgão/tumor na vivo , mas ao mesmo tempo acomoda sistemática experimental intervenção.

O objetivo geral deste modelo de pele esferóide de melanoma organotípico 3D é recapitular a arquitetura e a complexidade multicelular de um órgão ou tumor in vivo, ao mesmo tempo em que acomoda a intervenção experimental sistemática. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa do melanoma, como interação tumor-hospedeiro e intervenção terapêutica. A principal vantagem desta técnica é que podemos imitar a arquitetura 3D de metástases não vascularizadas in vivo.

As implicações desta técnica se estendem ao que terapia do melanoma porque reflete a heterogeneidade do tumor. Em geral, os indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque a qualidade das células primárias é decisiva e nenhum antibiótico é usado durante o processo celular. As implicações desta técnica se estendem ao que terapia do melanoma porque reflete a heterogeneidade do tumor.

A demonstração visual desse método é fundamental porque o manuseio adequado do modelo de pele melanoma 3D é muito importante. Para começar, cultive células de melanoma 451LU usando meio RPMI contendo 10% FCS, de acordo com protocolos gerais de cultura de células. Para gerar esferóides de melanoma, lave as células de melanoma cultivadas em PBS.

Em seguida, adicione cinco mililitros de uma vez tripsina EDTA em PBS. Incube por três a cinco minutos em temperatura ambiente. Adicione cinco mililitros de RPMI contendo 10% FCS para neutralizar a tripsina.

Em seguida, transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga. Centrifugue a 200 vezes g por cinco minutos para colher as células. Suspenda novamente o pellet celular em RPMI contendo 10%FCS.

Em seguida, conte as células e dilua a suspensão celular até uma concentração final de 10.000 células por mililitro. Use uma pipeta eletrônica múltipla para fazer 40 pontos de 25 microlitros de suspensão celular na superfície interna da tampa de uma placa de cultura de células estéril não adesiva de 10 centímetros. Em seguida, vire a tampa com um movimento rápido e suave e coloque-a na placa de cultura de células contendo cinco mililitros de PBS.

Cultive os pratos suspensos a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 10 a 14 dias. Cinco dias após a detecção inicial da gota, use um dispensador eletrônico para adicionar 10 microlitros de RPMI contendo 10% FCS a cada gota. Após 10 a 15 dias, colha os esferóides enxaguando-os suavemente da tampa com PBS.

Recolha os esferóides numa nova placa de cultura de células não adesiva. Para gerar a contraparte dérmica das reconstruções da pele, coloque inserções de membrana de tamanho de poro de oito micrômetros em uma placa de cultura de células de 24 poços. Para cada inserção, ressuspenda 100.000 fibroblastos em solução de neutralização em gel.

Em seguida, misture rapidamente a suspensão de fibroblastos com colágeno tipo um na proporção de um para três em um volume final de 500 microlitros sem formar bolhas. Em seguida, use uma pipeta para adicionar a suspensão a cada inserção. Dentro de um capuz estéril, coloque as inserções em temperatura ambiente sem meio por 30 minutos para permitir que os géis dérmicos assentem.

Em seguida, cubra os géis com o DMEM e incube durante a noite a 37 graus Celsius. Após a incubação noturna, remova o DMEM dos géis dérmicos e desequilibre-os com EGM por duas horas a 37 graus Celsius para gerar a contraparte epidérmica das reconstruções da pele. Em seguida, use uma pipeta para remover o EGM dos géis.

Em seguida, semeie cuidadosamente 100.000 queratinócitos, ressuspensos em 100 microlitros de EGM em cima de cada gel. Incube as reconstruções por uma hora e meia a 37 graus Celsius para permitir que os queratinócitos adiram ao gel dérmico. Usando uma ponta de pipeta, remova cuidadosamente o gel residual da parede de inserção.

Em seguida, cubra cada reconstrução com 800 microlitros de EGM e cultive por sete dias a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Remova cuidadosamente o gel residual da parede interna com uma ponta de pipeta pequena e larga. No oitavo dia, coloque as inserções em poços separados de uma placa de seis poços.

Em seguida, adicione 1,2 a 1,4 de meio de melanoma metastático a cada poço para cobrir apenas a base da reconstrução da pele. Em seguida, incube por 10 a 17 dias a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Adicione apenas 1,2 a 1,4 mL de meio de melanoma metastático a cada poço para que a reconstrução da pele seja fornecida com meio do fundo do poço, mas não seja coberto com meio.

Para integrar os esferoides de melanoma na contraparte dérmica de toda a pele reconstruída, use PBS para enxaguar cuidadosamente os esferoides da tampa de uma placa de cultura de células suspensa. Para cada reconstrução de pele completa, colete de 10 a 20 esferoides em uma placa de cultura de células estéril e não adesiva. Use uma pipeta Pasteur para remover cuidadosamente o excesso de PBS.

Em seguida, aspire os esferóides em um volume mínimo de EGM. Em seguida, transfira-os para o volume necessário de solução de neutralização em gel, contendo 100.000 fibroblastos. Para cada inserção, misture a suspensão esferóide com colágeno tipo um na proporção de um para três em um volume final de 500 microlitros.

Finalmente, gere reconstruções organotípicas de pele completa, conforme descrito no protocolo descrito anteriormente. A pele humana normal é comparada à reconstrução da pele para validar a reconstrução organotípica da pele 3D. A coloração de hematoxilina eosina dos cortes de parafina mostra que a derme e a epiderme da pele reconstruída são comparáveis às da pele normal.

A pele humana normal e a reconstrução da pele são analisadas imuno-histoquimicamente para comparar a diferenciação epidérmica. A imunomarcação contra marcadores de estratificação epidérmica, nomeadamente queratina 14, queratina 10 e involucrina e filagrina, indica níveis semelhantes de diferenciação do queratinosídeo entre a pele reconstruída e a pele normal. A imunomarcação contra a laminina cinco indica que a lâmina basal é formada para conectar fisiologicamente as contrapartes epidérmicas e dérmicas das reconstruções da pele, semelhante à pele normal.

A coloração de hematoxilina eosina da seção de parafina da reconstrução da pele do esferóide de melanoma indica que a distribuição celular dos esferoides de melanoma é semelhante à das metástases cutâneas de melanoma humano não vascularizadas in vivo. O exame histológico revela a presença de uma subpopulação proliferativa periférica e uma subpopulação necrótica central das células de melanoma. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de 40 dias, se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante usar células primárias de melhor qualidade. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores de melanoma explorarem a capacidade de resposta in vitro em um ambiente de imitação in vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar um modelo de pele de melanoma organotípico 3D humano.