Name: Uma abordagem alternativa para estudar eventos primários na neurodegeneração usando fatias de cérebro de rato Ex Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda uma técnica ex-vivo com hemisférios pareados de cérebro de rato para investigar eventos moleculares iniciais na neurodegeneração. Este método permite comparar diretamente condições tratadas e controle no mesmo contexto anatômico.

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Este trabalho foi financiado pela Neuro-Bio Ltd. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Giovanni Ferrati e Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) para seus comentários e conselhos sobre o manuscrito.

Todos os estudos em animais foram realizados sob protocolos aprovados.
Nota: Nesta seção, a sequência das principais fases executadas durante o procedimento experimental e o intervalo de tempo sugerido é fornecido (Figura 1). Além disso, uma descrição passo a passo do protocolo é complementada por um painel ilustrativo, mostrando ações críticas que variam de remoção do cérebro a homogeneização do tecido após o período de incubação (Figura 2). Os detalhes sobre os materiais e instruções para construir o aparelho e a fase subsequente para a análise de WB são descritas anteriormente22.
1. cirúrgicas ferramentas, configurações de Vibratome e preparação de tratamento
Nota: Execute as etapas a seguir antes de iniciar o procedimento experimental:
<ol><li>Prepare dois diferentes artificiais cerebrospinal fluidos (aCSFs), que usou para cortar o cérebro e o outro para a etapa de incubação como descrito anteriormente29. Brevemente, as concentrações de trabalho (em mmol) dos dois aCSFs são para o "fatiar" aCSF: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2PO4e 10 glicose; 6.7 HEPES sal e ácido HEPES 3.3; pH: 7.1. Tempo para a "gravação" aCSF: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1.3 KH2PO4e 10 glicose; pH: 7.1.</li>
	<li>Misture bem as soluções e colocar no gelo e oxigenar a aCSF corte a fim de tê-lo frio ao remover o cérebro e o seccionamento subsequentes. Manter a temperatura (RT) e fornecimento de oxigênio para a aCSF de gravação.</li>
	<li>Coloque os instrumentos sob a capa de dissecação para a remoção de decapitação e cérebro, ou seja, guilhotina, kit cirúrgico de dissecação (tesouras, pinças, lâminas) e espátula.</li>
	<li>Configure os parâmetros de vibratome, selecionando a espessura da fatia (300 µm nesta preparação) e a frequência às 7 e a velocidade em 6. Inserir a câmara de vibratome no seu espaço apropriado e cercá-lo com gelo.</li>
	<li>Abra a válvula de carbogênio (95% O2, 5% CO2) para oxigenar o "corte" (aCSF) durante o corte do cérebro. Selecione a taxa de vazão mínima, em torno de 2 mL/min.</li>
	<li>Pegue dois tubos de 15 mL para preparar as condições para testar. Adicione em um tubo de 10 mL da "gravação" aCSF sozinho (grupo controle) e no outro, 10 mL da "gravação" aCSF enriquecido com T30 em uma concentração de 2 µM (grupo tratado). Vórtice tanto tubos e mantê-los no gelo até sua utilização na fase de preparação de instalação (secção 3).</li>
</ol>2. anestesia, extração de cérebro e de corte
Nota: Neste estudo, foram usados 9 tipo selvagem P14 ratos machos Wistar. Extração do cérebro e subsequente corte constituem uma parte crítica do protocolo, desde que eles devem ser realizados rapidamente (dentro de 10 min) a fim de evitar ou pelo menos abrandar os processos de degeneração do tecido.
<ol><li>Adicione 1,5 mL de 100% w/w de isoflurano em uma camada de algodão para a câmara de indução, colocar o animal dentro e feche a tampa. Espere até que o animal é anestesiado profundamente, confirmando a ausência do pedal reflexo e então decapitar o animal usando a guilhotina.</li>
	<li>Mantenha a cabeça do animal dentro de um pote contendo gelada corte aCSF durante a etapa de remoção do cérebro (Figura 2A -C).</li>
	<li>Faça uma incisão na pele sobre o crânio com uma lâmina cirúrgica, em seguida, recorte usando a tesoura, seguindo a linha mediana, desde a parte posterior do crânio e proceda anteriormente até atingir o osso acima do OBs (Figura 2A).</li>
	<li>Puxe lateralmente os dois lados do crânio usando um par de pinças para poder ter acesso ao cérebro (Figura 2B). Insira uma espátula ventralmente ao cérebro, colher-se suavemente para fora e mantê-lo hidratado na gelada aCSF "fatiar" por aproximadamente 5 min (Figura 2).</li>
	<li>Elimine o cérebro no filtro de papel e cortar o cerebelo usando uma lâmina (Figura 2D). Cola o cérebro verticalmente sobre o disco de vibratome e inseri-lo no interior da câmara de corte, preenchê-lo com aCSF "fatiar" gelada e fornecer oxigênio (Figura 2E).</li>
	<li>Ajustar o intervalo de corte e prosseguir com o seccionamento do cérebro (Figura 2F). Recolha as seções que contém a região de interesse, tais como o septo medial (MS), a banda diagonal de Broca (DBB) e substância innominata (SI), como descrito anteriormente,22. De cima para baixo, as três fatias contêm o rostral (R), intermediário (I) e caudal (C) parte do BF (Figura 2).</li>
	<li>Dividir ao longo da linha mediana de cada seção com uma pequena tesoura, obtendo dois hemislices especulares (Figura 2 H), usado individualmente como o controle e a condição tratada no mesmo plano anatômico.</li>
	<li>Manter o hemisections na câmara de vibratome por 5-10 min, em seguida, transferi-los com uma pipeta de vidro em um subida pote contendo gravação aCSF. Mantenha a RT para cerca de 30 min para recuperar.</li>
	<li>Preencha, entretanto, três frascos de vidro com 3 ml de solução de gravação aCSF sozinho (anteriormente na etapa 1.6 para o grupo de controle) e três tubos de ensaio com 3 mL de aCSF enriquecido com T30 (previamente preparado no passo 1.6) para o grupo tratado.</li>
</ol>3. preparação da instalação
<ol><li>Transferir o hemisections para seus frascos de vidro correspondente (Figura 2I) a fim de ter três hemislices consecutivos (incluindo a região BF rostral, intermediária e caudal) para o grupo de controle (quadro verde, Figura 2J) e suas correspondência de contrapartes para o grupo tratado (quadro vermelho, Figura 2J).</li>
	<li>Transferi o tecido cerebral com duas escovas diferentes, uma para o controle hemislices e outro para as contrapartes tratadas, para evitar qualquer contaminação entre as condições.</li>
	<li>Sele cada frasco de vidro com a tampa correspondente, apresentando a agulha oxigenação (21G) (Figura 2J). Ligar o tubo principal do aparelho para a fonte de carbogênio (Figura 2 K). Entrega oxigênio para a hemislices durante todo o período de incubação com um caudal mínimo de 2 mL/min para evitar qualquer movimento do tecido cerebral e possíveis danos mecânicos durante o experimento. Inicie a incubação de 5h. Execute as etapas de 3.1-3.3 dentro de 5 min. Nota: Verifique frequentemente (cada 15-20 min) se o oxigênio é fornecido em todos os frascos e que seu fluxo não está se movendo o tecido do fundo.</li>
</ol>4. homogeneização da amostra
<ol><li>Parar o fluxo de oxigênio após a incubação e remover todas as tampas dos frascos. Transferi o hemislices, usando os pincéis adequados, para tubos de 1,5 mL, contendo 250 µ l de tampão de Lise, manter os tubos em gelo (Figura 2 L). Para fazer a lise de tampão, misturar PBS 1 x com cocktails de inibidores da fosfatase e protease tanto diluído a 1: 100 e homogeneizar o tecido com macacos diferentes para evitar a contaminação entre as amostras. Conclua essas ações dentro de 10-15 min.</li>
	<li>Centrifugue o cérebro lisado a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para tubos novos e manter as amostras a-80 ° C.</li>
</ol>5. leitura da concentração de proteínas e análise ocidental do borrão
<ol><li>Determinar a concentração de proteína de cada amostra e posteriormente, preparar as alíquotas para análise ocidental do borrão como descrito anteriormente,22.</li>
	<li>Realizar análise estatística para avaliar os efeitos do tratamento na expressão da proteína.</li>
</ol>

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<li>Schmitz, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+forebrain+degeneration+precedes+and+predicts+the+cortical+spread+of+Alzheimer%27s+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology.</a> Nature Communications. 7, 13249(2016).</li>
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<li>Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ex+Vivo+Model+to+Investigate+the+Underlying+Mechanisms+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291(2017).</li>
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</ol>

Os autores declaram concorrentes interesses financeiros. Susan A. Greenfield é o fundador e presidente da Neuro-Bio Limited, uma empresa canadense e detém ações da empresa. Emanuele Brai e Antonella Cogoni são empregados da Neuro-Bio Ltd.

O principal aspecto do presente protocolo, baseado na técnica cérebro bem-estabelecida ex vivo , permite testar sincronicamente duas hemislices especulares, obtidas no mesmo plano anatômico, monitorando sua resposta após a aplicação de um determinado condição (controlar ou tratados); Este, portanto, oferece uma paradigma experimental tão rigidamente controlada quanto possível. A possibilidade de avaliar em um tempo - dose- e site-specific maneira diferente neuroquímicos relacionados com comprometimento neuronal,...

AD é que uma patologia crônica caracterizada por imparidade neurodegenerativa progressiva, afetando áreas diferentes do cérebro, tais como o córtex entorhinal (CE), BF, hipocampo (HC) e bulbo olfatório (OB)1,2,3, 4,5. Estágios finais de desenvolvimento AD conduzem a um progressivo declínio cognitivo, tornando esta doença, a forma mais comum de demência, representando aproximadamente 70% de todos os casos6. Apesar das tentativas extensas para entender os estágios iniciais, causando AD, não há atualmente uma indicação experimental definida elucidá-los. Além disso, a teoria mais popular - a "hipótese amiloide" - é cada vez mais questionada desde que ele não fornece um perfil completo em explicar o Patobiológico AD, nem um alvo farmacêutico que se revelou eficaz7,8 ,9.
Uma teoria alternativa que está recebendo atenção crescente sugere que os mecanismos iniciais ocorrem durante neurodegeneração estão relacionados a um cluster neuronal principalmente sensível no AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. este hub celular heterogênea englobada no âmbito dos projectos BF, mesencéfalo e tronco cerebral, para várias regiões, tais como o CE, HC e OB15,16. Apesar de sua diversidade na morfologia neuronal e síntese de neurotransmissor, esse núcleo de células compartilha uma característica comum em expressar a dor, que também pode ter uma função não-enzimática de17,18. Este papel não-clássica como um romance de sinalização molécula Medeia o fluxo de cálcio (Ca2 +) em neurônios que pode passar por eventos tróficos ou tóxicos em relação à dose de Ca2 + , disponibilidade e idade neuronal17,18 , 19.
Durante neurodegeneração, a perda celular observada pode ser, portanto, associada a esta função não enzimáticos17,18,20, que é atribuível a um peptídeo 30mer (T30) clivado de dor C-terminal 20. em consonância com os resultados anteriores, realizados na cultura de pilha e óptico de imagem18,21 preparações, temos demonstrado, através de uma nova abordagem baseada em ex vivo fatias cérebro rato contendo estruturas BF, que induziu T30 um perfil AD22. Especificamente, esta nova metodologia oferece um cenário mais fisiológico do que cultura celular desde que ele mantém muitas das características de um tecido intacto, variando de anatômica para preservação de circuitos, embora para uma janela de tempo de horas. Aplicamos este protocolo para explorar os eventos que ocorrem durante as primeiras fases de neurodegeneração, monitoramento da resposta aguda a T30 pedido.
Apesar da grande corpus de literatura sobre o uso do cérebro fatias para investigar as vias moleculares implícita no dano neuronal ou neurogênese23,24, este protocolo fornece pela primeira vez uma mais imediata e sensível à leitura comparada para o uso comum de organotypic fatias. No entanto, como é o caso de organotypic seções do cérebro, este procedimento de fatia aguda pode também ser adotado para fins diversos, tais como a avaliação de neuroprotective ou moléculas neurotóxicas, descoberta de mudanças moleculares primárias que ocorrem em um processo específico, a análise imuno-histoquímica e ensaios farmacológicos para o sistema nervoso central relacionadas com patologias.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>S7653</td><td>Reagente para preparação de aCSF</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>P9333</td><td>Reagente para preparação de aCSF</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>S5761</td><td>Reagente para preparação de aCSF</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4 (7H2O))</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>63138</td><td>Reagente para preparação de aCSF</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>P5655</td><td>Reagente para preparação de aCSF</td></tr><tr><td>Sal de hepes</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>H7006</td><td>Reagente para preparação de aCSF</td></tr><tr><td>Ácido de hepese</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>H3375</td><td>Reagente para preparação de aCSF</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>G7528</td><td>Reagente para preparação de aCSF</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio desidratado</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>223506</td><td>Reagente para preparação de aCSF</td></tr><tr><td>Peptídeo T30</td><td>Genosphere Biotechnologies, França</td><td></td><td>Peptídeo derivado de AChE testado</td></tr><tr><td>Kit de dissecação cirúrgica</td><td>World Precision Instruments, EUA</td><td>Item #: MOUSEKIT</td><td>Etapa de remoção do cérebro</td></tr><tr><td>Lâminas cirúrgicas</td><td>Swann-Morton, Reino Unido</td><td>BS 2982</td><td>Etapa de remoção do cérebro</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Fisher Scientific, EUA</td><td>11566873</td><td>Preparação do cérebro para fatiar</td></tr><tr><td>Cola</td><td></td><td></td><td>Preparação do cérebro para fatiar</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Alemanha</td><td>VT1000 S</td><td>Escovas</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> de corte <td>Manuseio de tecidos</td></tr><tr><td>Recipiente</td><td></td><td></td> <td>de oxigênioFase de seccionamento e incubação</td></tr><tr><td>1x Tampão fosfato salino (PBS)</td><td>Fisher Scientific, EUA</td><td>BP2438-4</td><td>Etapa de homogeneização</td></tr><tr><td>Inibidores de fosfatase</td><td>Fisher Scientific, EUA</td><td>1284-1650</td><td>Etapa de homogeneização</td></tr><tr><td>Inibidores de protease</td><td>Roche complete PIC, EUA</td><td>4693116001</td><td>Etapa de homogeneização</td></tr><tr><td>Pilões</td><td>Starlab, Reino Unido</td><td>I1415-5390</td><td>Etapa de homogeneização</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660 nm Protein Assay</td><td>Thermo Scientific, EUA</td><td>22660</td><td>Concentração de proteína</td></tr></tbody></table>

uma abordagem alternativa para estudar eventos primários na neurodegeneração usando fatias de cérebro de rato ex vivo

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Apesar de numerosos estudos que tentam desenvolver modelos animais confiáveis que refletir o primário processa neurodegeneração subjacente, muito poucos foram amplamente aceites. Aqui, propomos um novo procedimento adaptado de conhecidos ex vivo cérebro fatia técnica, que oferece um mais perto na vivo-como cenário do que em vitro preparações para investigar os eventos iniciais provocando degeneração celular, como observada na doença de Alzheimer (AD). Esta variação consiste em etapas simples e facilmente reproduzíveis, que permitem a preservação do cytoarchitecture anatômica da região selecionada do cérebro e sua funcionalidade local em um ambiente fisiológico. Diferentes áreas anatômicas podem ser obtidas o mesmo cérebro, proporcionando a oportunidade de realizar várias experiências com os tratamentos em questão em um local-, dose e tempo-dependente. Limitações potenciais que poderiam afetar os resultados relacionados com esta metodologia estão relacionadas com a conservação do tecido, ou seja, a manutenção da sua integridade anatômica durante as etapas de corte e a incubação e a espessura de corte, que pode influenciar a análise bioquímica e imuno-histoquímica. Esta abordagem pode ser utilizada para diferentes fins, tais como explorar mecanismos moleculares envolvidos em condições fisiológicas ou patológicas, triagem de drogas ou ensaios de dose-resposta. Finalmente, este protocolo também poderia reduzir o número de animais utilizados em estudos comportamentais. O aplicativo aqui relatado foi recentemente descrito e testado pela primeira vez na ex vivo fatias cérebro rato contendo o prosencéfalo basal (BF), que é uma das regiões cerebrais afetadas principalmente no AD. Especificamente, foi demonstrado que a administração de um peptídeo tóxico derivado do C-terminal da acetilcolinesterase (AChE) poderia solicitar um AD-como o perfil, provocando, ao longo do eixo antero-posterior do BF, uma expressão diferencial de proteínas alteradas na AD, como o receptor nicotínico alpha7 (α7-nAChR), fosforilada Tau (p-Tau) e beta amiloide (Aβ).

O protocolo aqui apresentado indica que a administração de um peptídeo tóxico, T30, modula de forma local-dependente da expressão do nAChR, α7-p-Tau e Aβ nas seções contendo BF (Figura 3A). O receptor nicotínico mostra um aumento significativo no hemislice rostral-tratados, comparado ao seu homólogo de controle (fatia 1, p = 0.0310) (Figura 3B), enquanto a fatia intermediária não revela qualquer alteração entre o (duas c...

Apresentamos um método que pode fornecer mais insights sobre os primeiros eventos subjacentes a neurodegeneração e baseia a técnica de cérebro estabelecido ex vivo , combinando as vantagens dos experimentos in vivo e in vitro . Além disso, representa uma oportunidade única para comparação directa do grupo tratado e não tratado no mesmo plano anatômico.

Uma abordagem alternativa para estudar eventos primários na neurodegeneração usando fatias de cérebro de rato Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar simultaneamente duas hemifatias especulares obtidas do mesmo plano anatômico e observar os efeitos após um tratamento. Este método pode ajudar a responder a questões cruciais no campo da neurociência molecular, como os eventos primários que afetam as moléculas-chave envolvidas em processos neurodegenerativos. A principal vantagem desta técnica é que ela pode fornecer um meio realizado de cascatas moleculares subjacentes a eventos neurodegenerativos.Embora esse método possa fornecer informações sobre eventos primários que ocorrem na neurodegeneração, ele também pode ser aplicado para investigar modelos animais de diferentes distúrbios ou outras propriedades de órgãos e tecidos. Comece preparando dois fluidos cefalorraquidianos artificiais diferentes. Um usado para o corte do cérebro e o outro para a etapa de incubação.Depois de preparar o ACSF fatiado, misture a solução e mantenha-a no gelo. Da mesma forma, prepare o ACSF de gravação, mas mantenha-o em temperatura ambiente. Oxigenar ambas as soluções.Em seguida, prepare os instrumentos para a decapitação e remoção do cérebro no capuz de dissecação. Em seguida, configure os parâmetros do vibratomo. Defina a espessura da fatia conforme necessário.Como trezentos mícrons. Defina a frequência em sete e a velocidade em seis. Em seguida, insira a câmara do vibratomo e envolva-a com gelo.Para o seccionamento do cérebro, abrindo a válvula de carbogênio para oxigenar o ACSF de corte. Selecione a vazão mínima de cerca de dois mililitros por minuto. Agora em dois tubos de 15 mililitros, prepare as condições do tus.Carregue um tubo com 10 mililitros do ACSF de gravação como controle. Carregue o outro com os 10 mililitros de gravação ACSF enriquecidos com o tratamento. Neste caso, dois micromolares de T30.Vortex ambos os tubos e mantenha-os no gelo até que sejam necessários. Incise a pele sobre o crânio com uma lâmina cirúrgica. Em seguida, usando uma tesoura, corte o crânio ao longo da linha média, da parte posterior ao osso, acima dos bulbos olfatórios.Em seguida, puxe lateralmente os dois lados do crânio usando uma pinça para acessar o cérebro. Insira uma espátula ventralmente no cérebro. Retire delicadamente e mantenha-o hidratado em fatias ACSF geladas por cerca de cinco minutos.Após o descanso em ACSF frio, transfira o cérebro para um papel de filtro. E depois de remover o cerebelo, cole o cérebro verticalmente no disco vibratomo. Em seguida, transfira-o para a câmara de corte cheia de ACSF de fatiamento gelado.Agora inicie o fluxo de oxigênio para a solução da câmara. Em seguida, ajuste o intervalo de corte e prossiga com o seccionamento cerebral. Colete as seções que contêm a região de interesse usando métodos padrão.Agora divida cuidadosamente cada seção com uma pequena tesoura ao longo da linha média para obter duas hemifatias especulares. Use cada par de hemifatias para a condição de controle e tratada. Depois de divididas, deixe as hemissecções descansarem na câmara vibratomo por cinco a dez minutos.Após o resto, transfira suavemente as hemissecções usando uma pipeta de vidro para uma panela borbulhante contendo ACSF de gravação em temperatura ambiente. Em seguida, deixe as hemissecções se recuperarem por cerca de 30 minutos antes de prosseguir. Durante o intervalo, coloque três frascos de vidro com três mililitros de ACSF de registro para o grupo controle e três frascos com três mililitros de ACSF enriquecido com T30 para o grupo tratado.Após o descanso de 30 minutos, em cinco minutos, transferir a amostra para os banhos. Primeiro, coloque as hemifatias consecutivas na solução de controle usando um pincel. Em seguida, usando uma escova diferente, transfira as hemissecções contralaterais para a solução de tratamento.Em seguida, feche os frascos com rolhas de plástico contendo agulhas de calibre 21 para a entrega de carbogênio à amostra. Forneça oxigênio a uma taxa de fluxo mínima, como dois mililitros por minuto para evitar qualquer movimento do tecido cerebral que resulte em possíveis danos mecânicos ao tecido. Isso conclui a configuração.Agora comece uma incubação de cinco horas. Após a incubação, interrompa o fluxo de oxigênio e destampe os frascos. Em seguida, transfira suavemente as hemifatias usando a escova apropriada para tubos de 1,5 mililitro contendo 250 microlitros de tampão de lise mantido no gelo.Em seguida, usando pilões separados, homogeneizar cada tecido. Conclua as etapas de transferência e homogeneização dentro de 10 a 15 minutos para todas as seis amostras. Agora centrifugue as amostras homogeneizadas a 1.000 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, transfira os sobrenadantes para novos tubos e armazene as amostras a 80 graus Celsius negativos. A administração de um peptídeo tóxico, T30, no prosencéfalo contendo hemissecções de manjericão teve três efeitos específicos no tecido. Ele modulou a expressão do receptor nicotínico alfa sete, a fosforilação de Tau e a expressão de beta-amilóide.O receptor nicotínico apresentou aumento significativo no hemiscorte tratado rostral, enquanto o corte intermediário não revelou nenhuma alteração entre as duas condições. Na seção posterior, houve redução significativa na porção exposta ao T30. Os níveis de Tau fosforilada estavam significativamente aumentados na região anterior.Por outro lado, as outras duas seções do procéfalo de manjericão não mostram nenhuma diferença significativa entre as condições. A beta-amiloide foi significativamente aumentada após a exposição ao T30 nas hemissecções rostral e intermediária. No entanto, na lâmina codal, não houve efeito mensurável na expressão da beta amilóide.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em sete horas, se executada corretamente.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Cultura Slice organotípicas de E18 cérebros de ratos

Este artigo descreve procedimentos para preparar fatias do hipocampo de ratos e camundongos transgênicos para o estudo de alterações sinápticas do cérebro associadas ao envelhecimento e relacionadas com a idade as doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer.

Preparação de fatias do hipocampo aguda de ratos e camundongos transgênicos para o Estudo das Alterações Synaptic durante o envelhecimento e amilóide Patologia

Este relatório demonstra uma técnica para isolamento mecânico de cada um dos neurônios viáveis ​​retenção anexado boutons pré-sináptica. Neurônios Vibrodissociated têm as vantagens de rápida produção, controle farmacológico excelente e melhor espaço grampo sem a influência das células vizinhas. Este método pode ser usado para imagens de elementos sináptica e patch-clamp gravação.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

Este vídeo demonstra o procedimento para preparar e tratar hemifatias de cérebro de rato com um peptídeo neurotóxico para imitar a neurodegeneração. O protocolo permite analisar eventos neurodegenerativos comparando diretamente os cortes controle e tratados no mesmo plano anatômico.

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Tráfico de membrana neuronal controla dinamicamente membrana disponibilidade de proteína plasmática e significativamente impactos neurotransmissão. Até à data, tem sido um desafio para medir tráfico endocítico neuronal em neurônios adultos. Aqui, descrevemos um método altamente eficaz, quantitativo para medir as mudanças rápidas na expressão de proteínas de superfície ex vivo em fatias cerebrais agudas.

Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios

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Nós descrevemos procedimentos para processar o tecido recém-nascido do cérebro do rato para obter micrografias de elétron high-resolution para a Análise morfométrica da distribuição sináptica do vesícula em terminais do nervo. As micrografias obtidas com esses métodos também podem ser utilizadas para estudar a morfologia de uma série de outros componentes celulares e suas relações estruturais dimensionais.

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