Name: Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprenda sequenciamento com correção de erros para detecção de mutações raras usando química Illumina e identificadores moleculares únicos. Este método permite identificar variantes clonais com sensibilidade de 1 em 10.000.

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Agradecemos os participantes no estudo de AAML1531 do grupo de oncologia infantil e estudo de sanidade das enfermeiras para suas contribuições sob a forma de amostras de doentes. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (CA186107 UM1, RO1 CA49449 e RO1 CA149445), Discovery Institute de Washington University das crianças e St. Louis infantil Hospital (MC-II-2015-461) e Eli Seth Matthews leucemia Fundação.

<ol><li>Hoang, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+rare+somatic+mutations+in+normal+tissues+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).</li>
<li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li>
<li>Young, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+ultra-rare+pre-leukemic+clones+via+targeted+error-corrected+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing.</a> Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).</li>
<li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27546487">Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> NatureCommunications. 7, 12484(2016).</li>
<li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt1486">Next-generation DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Kohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+residual+disease+by+next-generation+deep-sequencing+of+RUNX1+mutations+can+identify+acute+myeloid+leukemia+patients+with+resistant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease.</a> Leukemia. 28, 129-137 (2014).</li>
<li>Luthra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing-based+multigene+mutational+screening+for+acute+myeloid+leukemia+using+MiSeq%3A+applicability+for+diagnostics+and+disease+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring.</a> Haematologica. 99, 465-473 (2014).</li>
<li>Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+rare+mutations+with+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).</li>
<li>Schmitt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).</li>
<li>Vander Heiden, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pRESTO%3A+a+toolkit+for+processing+high-throughput+sequencing+raw+reads+of+lymphocyte+receptor+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires.</a> Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22NatureBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).</li>
<li>Shugay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGERI%3A+Computational+pipeline+for+molecular-barcoded+targeted+resequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOSComputationalBiology%22%5BJournal%5D)">MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing.</a> PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480(2017).</li>
<li>Wong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TP53+mutations+in+the+origin+and+evolution+of+therapy-related+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 518, 552-555 (2014).</li>
<li>Krimmel, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-deep+sequencing+detects+ovarian+cancer+cells+in+peritoneal+fluid+and+reveals+somatic+TP53+mutations+in+noncancerous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).</li>
<li>Phallen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+early-stage+cancers+using+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22ScienceTranslationalMedicine%22%5BJournal%5D)">Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA.</a> ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415(2017).</li>
<li>Egorov, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, vamos demonstrar um conjunto de protocolos de sequenciamento de correção de erro que podem ser facilmente implementados para estudar mutações com baixas VAFs em diferentes doenças. O fator mais importante é a incorporação de UMIs com cada molécula antes de sequenciamento que possibilitam a correção de erros de leituras a cru. Os métodos descritos aqui permitem aos investigadores incorporam UMIs personalizados para painéis de gene comercialmente disponíveis e auto-concebidos oligos gene-específico.
Protocolo padrão de NGS impede a detecção de mutações com VAF inferior a 2% devido a taxa de erro de sequenciamento, e isto limita a aplicação de NGS em estudos onde a detecção de variantes raras é crucial. Contornando a taxa de erro padrão NGS, ECS permite detecção sensível dessas variantes crus. Por exemplo, a detecção de mutações patogénicas quando estas mutações surgem primeiro (portanto, ter baixa VAF) é imperativa para informar a intervenção precoce da doença14,15. Na pesquisa de leucemia, a detecção de residual mínima doença (pós-tratamento de células leucêmicas residuais) informa a estratificação de risco e poderia ser usada para informar as opções de tratamento, de forma que não podem as avaliações cytometric do fluxo binário. Além disso, a ECS é aplicável para detectar tumor circulantes de ácidos nucleicos e avaliar potencial metastático em pacientes de tumor sólido, avaliando a presença/ausência, bem como os encargos variante de certas mutações que são características das primárias tumor de16.
Conforme demonstrado na tabela 1, o poder de usar o modelo de erro de posição-específicos baseados na distribuição binomial para chamar variantes depende em grande parte o número de bibliotecas sequenciados, bem como a profundidade de sequenciamento usado para construir o modelo de erro. A robustez do modelo de erro aumenta com o maior número de amostras e mais profundidade de sequenciamento. É recomendável usar pelo menos 10 amostras sequenciadas com uma média de correção de erro Leia cobertura de 3000 x por amostra para construir um perfil de erro para cada amostra. A posição específica abordagem é semelhante ao MAGERI, mas em vez de usar uma taxa de erro agregado seis tipos diferentes de substituição (A > C/T > G, um > G/T > C, um > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, usamos modelos de cada substituição independentemente em cada posição. Por exemplo, uma taxa de erro de C > T em uma determinada posição genômica é diferente de outra posição. Nossa abordagem também leva em conta um efeito de lote de sequenciamento, como a taxa de substituição de base observada em um sequenciamento de execução pode ser diferente da outra vez. Portanto, é importante modelar cada posição para todos os tipos de substituição, especialmente quando amostras de sequenciamento diferentes execuções são agrupadas para criar o modelo.
Uma consideração importante ao projetar um experimento ECS é o limite de deteção desejado. A beleza de estudos NGS é que eles podem ser facilmente dimensionados em termos de genes/alvos de interesse, deteccao de threshold (ditada pela profundidade de sequenciamento) e número de indivíduos consultados. Por exemplo, se os pesquisadores estão interessados em encontrar raras mutações em dois amplicons com um limite de deteção de 0,0001, eles podem pool màxima 75 amostras em um único sequenciamento executado usando química MiSeq V2 que produz leituras até 15 milhões (2 amplicons * 10.000 moléculas * 10 lê para correção de erros * 75 amostras = 15 milhões de sequenciamento de leituras). Pesquisadores podem variar o número de moléculas em sequenciamento ou o número de amostras combinadas em um único sequenciamento para ajustar o limite de deteção. Em nossos estudos, tivemos como objetivo encontrar mutações com um limite de deteção de 0,0001 VAF (01:10, 000) usando o painel de gene Illumina. Rotineiramente usamos 250 ng de começar o DNA para garantir que as moléculas suficientes são capturadas para atingir o limite de deteção acima mencionados. Pesquisadores podem optar por começar com a menor quantidade de DNA (50 ng é recomendado) se o limite de detecção desejada é > VAF 0,001.
Como os UMIs são acrescentados para os índices de i5, configurações de sequenciamento terá de ser alterada em conformidade. Por exemplo, nós usamos 16 UMIs N, e as configurações de sequenciamento foram emparelhados final 2 x 144 leituras, 8 ciclos de índice 1 e 16 ciclos de índice 2, ao contrário do habituais 8 ciclos de índice 2. O aumento no índice 2 ciclo é compensado por uma diminuição do número total de ciclos alocada para o lê. Se os pesquisadores optam para usar 12N UMIs10,17, as configurações devem ser alteradas para 12 ciclos de índice 2.
Este método de sequenciamento baseado no UMI é otimizado para corrigir erros de sequenciamento. Continua a ser subótimos em lidar com warAre PCR, que é um problema para todos os método baseado em amplificação. Foram realizadas rodadas de post-sequenciamento e post-bioinformática validação usando ddPCR, e dificilmente detectarmos qualquer falsos positivos devido a warAre PCR. No entanto, é recomendável que pesquisadores realizar os experimentos utilizando polymerase de alta fidelidade para garantir erros de amplificação de baixo.

Como nós idade, exposição a agentes mutagénicos e estocásticos erros durante a divisão celular resultado na acumulação de aberrações somáticas no genoma e isto está subjacente a patogênese fundamental de transformação maligna, doenças neuro-desenvolvente, pediátricas doenças e envelhecimento normal1,2. Mutações somáticas com potencial de doença de condução são importantes biomarcadores de diagnósticos e prognósticos para a detecção precoce e de gestão de risco a3,4,5. A fim de entender melhor clonogenesis fisiológica, que irá informar clínica e pesquisa de decisões, a exata quantificação e caracterização destas mutações é de primordial importância. Sequenciamento de próxima geração (NGS) é atualmente usado para estudar mutações clonais em amostras de DNA heterogêneas; no entanto, NGS é limitado para identificar mutações em > 0,02 fração variante alélica (VAF) — devido a taxa de erro inerente de 0.5-2.0% do sequenciamento plataformas6,7,8. Como resultado, rastreamento para diagnóstico e prognóstico significativas variantes somáticas no VAF inferior não podem ser alcançadas usando padrão NGS.
Recentemente, vários métodos foram desenvolvidos a fim de contornar a taxa de erro de NGS8,9,10,11. Estes métodos utilizam a marcação molecular, que permite a correção de erro após o sequenciamento. Cada molécula ou fragmento genômico na biblioteca de sequenciamento é marcado com um aleatório exclusivo Molecular identificador (UMI) que é específico para aquela molécula. Os UMIs são construídos por permutações de uma sequência de nucleotídeos randomizados (N. 8-16). Um segundo amostra específicos código de barras é integrado também o fluxo de trabalho que permite a multiplexação de várias amostras para o sequenciamento de NGS mesmo correr. Amplificação por PCR é realizada na biblioteca molecularmente etiquetada, e posteriormente a biblioteca é enviada para o sequenciamento. Durante a preparação da biblioteca, espera-se que erros serão aleatoriamente introduzidos para o fragmento genômico durante a amplificação por PCR e sequenciamento8. Para remover erros aleatórios de sequenciamento, sequenciamento bruto leituras são agrupadas de acordo com o UMI. Artefatos de sequenciamento não deverão estar presentes em todas as leituras com a mesma UMI na mesma posição genômica devido à natureza estocástica da introdução, Considerando que uma verdadeira variante será fielmente amplificada e sequenciada em todas as leituras que compartilham o mesmo UMI. Os artefatos são bioinformatically removido. Aqui, descrevemos três métodos de correção de erro de sequenciamento (ECS) otimizado no laboratório de DNA identificar variantes de nucleotídeo único (SNVs) e a pequenas inserção-exclusões (puntuais) e para o RNA facilitar a quantificação da expressão gênica abaixo o Limite de erro NGS.
O primeiro método descreve uma maneira de olhar para o raro evento somático utilizando primers específicos de gene desenhados por pesquisadores. Antes da preparação da biblioteca, pesquisadores devem projetar primers para direcionar os fragmentos de interesse. Usamos o Primer3 web-app (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Amplicons de 200 – 250 bp são ideais para reação em cadeia da polimerase (PCR), assim como estes, uma vez que foram incorporadas UMIs, gerar sobreposição leituras final emparelhado com 150 leituras emparelhado-fim de bp. As condições de projeto da primeira demão ideal para ser usado são: tamanho de primeira demão mínimo = 19; Tamanho ideal da primeira demão = 25; Tamanho máximo da primeira demão = 30; Mínimo Tm = 64 ° C; Ideal Tm = 70 ° C; Máxima Tm = 74 ° C; Diferença máxima de Tm = 5 ° C; Teor mínimo de GC = 45; Teor máximo de GC = 80; Número de retorno = 20; Máximo 3' estabilidade final = 100.
No método 2, descrevemos um método combinando o protocolo ECS-DNA com Illumina química para o inquérito sobre a SNVs clonais e tão raros quanto 0,0001 VAF usando painéis de gene comercialmente disponíveis que incluem centenas de amplicons pequeno puntuais. Nós temos usado o painel TruSight de sequenciamento mieloide (Illumina) para a nossa experiência e projetado um painel expandido para incluir genes adicionais de interesse pediátrica doenças mieloides. Estes painéis não ofereceram identificadores moleculares (UMIs) que facilitam a correção de erros, então nós adicionamos nossa própria estratégia de adaptador para estes painéis. ECS deve funcionar igualmente bem com qualquer um dos outros painéis projetados para enriquecer para genes associados com doenças diferentes. Após o isolamento de DNA e posterior quantificação do tecido ou amostra de interesse, é recomendável ter pelo menos 500 ng de DNA de estoque por espécime. Nós rotineiramente fazer uma biblioteca de sequenciamento simples usando 250 ng de DNA a fim de capturar como muito único fragmento genômico quanto possível para a jusante lê duplicação e cálculo do VAF. Uma biblioteca de sequenciamento de replicar opcional pode ser feita com os restantes 250 ng de DNA. Nós sempre fazemos duas bibliotecas replicar por espécime, e consideramos somente os eventos detectados independentemente em ambas as réplicas como verdadeiros positivos. Também implementamos um modelo de erro binomial de genômica posição específica para aumentar a precisão da variante ligando4,13.
Por fim, descrevemos um método de acoplamento ECS para a sequenciação do ARN para quantificação de transcrição usando painéis de QIAseq alvo RNA prateleira (Qiagen). As UMIs necessária para eliminação de duplicação e correção de erro foram incorporadas nos kits, e pesquisadores podem tornar as bibliotecas seguindo as recomendações do fabricante. Bioinformatically, os pesquisadores podem acompanhar o pipeline delineado para ECS-DNA, que será explicado em detalhes na seção de protocolo.

<table><tbody><tr><td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de Ensaio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>Sequências adaptadoras FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>UMI i5</td><td>Integrado DNA</td> <td>Technologies-NEBNext</td><td></td></tr> <tr><td>Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Gotícula Geração de Óleo para Sistema</td> de PCR Digital de Gotículas EvaGreen <td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200</td><td>Placas de</td> 96 poços Bio-Rad <td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR</td> Cartuchos <td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>DG8 para gerador de gotículas QX200/QX100</td><td>Juntas Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 para gerador de gotículas QX200/QX100 Bioanalisador</td><td>1863009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Painel de Sequenciamento Mielóide TruSight</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr> Gravata borboleta 2 <tr><td>Painel de RNA direcionado QIAseq personalizado</td><td></td><td></td> pela Universidade Johns Hopkins Mini Kit Qiagen-Rneasy <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Plus (50)Qiagen 74134 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

deteção de evento raro usando o dna de correção de erro e a sequenciação do arn

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Técnicas convencionais sequenciamento de próxima geração (NGS) permitiram imensa caracterização genômica para mais de uma década. Especificamente, NGS tem sido usado para analisar o espectro de mutações clonais em malignidade. Embora muito mais eficiente do que os tradicionais métodos de Sanger, NGS lutas com identificação de raras mutações clonais e subclonal devido a sua taxa de erro elevada de ~0.5–2.0%. Assim, a NGS padrão tem um limite de detecção de mutações que são > 0,02 fração variante alélica (VAF). Enquanto o significado clínico de mutações raras em pacientes sem doença conhecida permanece obscura, pacientes tratados para leucemia têm melhorado significativamente os resultados quando doença residual é < 0,0001 por citometria de fluxo. Para mitigar este fundo artefactual de NGS, inúmeros métodos têm sido desenvolvidos. Aqui nós descrevemos um método para correção de erro de DNA e RNA Sequencing (ECS), que envolve as moléculas individuais com um índice de bp 16 aleatório para correção de erros e um índice de paciente específico bp 8 para multiplexação de marcação. Nosso método pode detectar e rastrear mutações clonais na variante alélica fracções (VAFs) duas ordens de grandeza menores do que o limite de detecção da NGS e tão raras quanto 0,0001 VAF.

Com Targeted Error-Corrected de sequenciamento de DNA, que temos realizado uma prova do experimento de princípio diluindo mutante paciente DNA no DNA genômico comercial. O paciente teve uma mutação em GATA1 (chrX:48650264, C &gt; G) com VAF original de 0,19. Demonstramos na Figura 1 que a ECS é quantitativa para um nível de 1:10,000 para a variante de nucleotídeo único.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> Figura 1: série de diluição do SNV GATA1 demonstrando que a ECS é quantitativa para o nível de 1:10,000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Também mostramos que o ECS-DNA confiantemente detecta raras clonais mutações em genes recorrentemente em adulto leucemia mieloide aguda (LMA) em indivíduos idosos saudáveis4. Obtivemos a amostras de buffy casaco de 20 indivíduos saudáveis no estudo da saúde da enfermeira bancados aproximadamente ~ 10 anos de diferença. Nós aplicamos o protocolo de painel ECS-DNA destas amostras. Para este experimento, temos adaptado a Illumina TruSight mieloide sequenciamento painel que consiste de 568 amplicons (mais informações na lista de gene no https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html) e sequenciado 80 bibliotecas de 20 indivíduos (2 coleções em pontos de tempo diferentes, 2 repetições por indivíduo por tempo ponto) usando plataforma Illumina NextSeq, o que gerou uma média de 47,7 milhões de emparelhado-fim de leituras e uma média de 3,4 milhões Corrigido erro sequências de consenso por biblioteca4. A cobertura média nucleotídeo por biblioteca foi aproximadamente 6.000 x (3,4 milhões divididos por 568). Para cada amostra, nós construímos um perfil de erro de posição-específicos usando sequenciadas bibliotecas que não são da mesma amostra. Encontramos 109 mutações somáticas clonais que estavam presentes em ambas as réplicas de pelo menos uma hora de recolha. Estas mutações têm VAF variando de 0.0003 – 0.1451. Selecionamos 21 mutações com representações cósmicas e validado todos os 21 mutações em um ou dois pontos de tempo de coleta usando ddPCR (n = 34, Figura 2, adaptada de jovem et al . 20164).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> Figura 2: mutações identificadas pelo ECS foram verificadas através de ddPCR com altamente concordantes VAFs. (n = 34, modificado do jovem et al . 20164). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Em relação ao nível de expressão de correção de erro usando o protocolo ECS-RNA, personalizamos um painel de gene usando química de QIAseq que consiste de 416 genes conhecidos para ser associado a vários cancros (adaptados de QIAseq humano câncer Transcriptome painel) e nós amplificou o exon mais comumente expressado de um determinado gene (lista de Gene no Material complementar 1). Nós sequenciado as bibliotecas usando plataforma Illumina MiSeq em formato de emparelhado-final que deu uma média de 8,3 milhões de leituras por biblioteca, e conseguimos capturar uma média de 0,417 milhões sequências consenso de correção de erro. Nós mostramos que o nível de expressão de transcrição de baixa abundância (&lt; 1.000 transcrição contagem em 50 ng do RNA total) é altamente reprodutível entre repetições (dados ponto n = 300, Figura 3). Validação por ddPCR (seis genes selecionados de graus variados de expressão) demonstrou que o nível de expressão dos genes tinha sido corretamente capturado pelo protocolo de ECS, sem a necessidade de normalização.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> Figura 3: Top, correlação de transcrição conta ECS-RNA entre repetições da mesma amostra (n = 300). Fundo, transcrição contagens identificadas pelo ECS foram verificadas por ddPCR (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Sequenciamento de próxima geração (NGS) é uma poderosa ferramenta para a caracterização do genoma que é limitada pela taxa de erro elevada da plataforma (~0.5–2.0%). Descrevemos os nossos métodos de sequenciamento de correção de erro que permitam obviar a taxa de erro NGS e detectar mutações em fracções de alelo variante tão raras como 0,0001.

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Este método pode ajudar a responder a algumas questões-chave em vários campos de pesquisa, como detecção de clones pré-cancerosos, avaliação prognóstica de pacientes com leucemia após o tratamento e identificação de mutações potencialmente patogênicas em doadores de medula óssea. Demonstrando este procedimento comigo estará Spencer, ele é um técnico no laboratório. Este vídeo descreve como combinar o Protocolo de Sequenciamento Corrigido por Erros com a química Illumina e painéis de genes disponíveis comercialmente para detectar variantes clonais de nucleotídeo único e pequenos indels com sensibilidade de um em 10.000.Para incorporar os identificadores moleculares exclusivos necessários, os adaptadores 16N i5 e i7 personalizados usam PCR. Primeiro, prepare o Q5 Master Mix, que usa uma polimerase com maior fidelidade do que a alternativa disponível comercialmente. Em seguida, para cada reação, combine 37,5 microlitros de Q5 Master Mix, seis microlitros de cinco adaptadores micromolares 16N i5, que são os identificadores moleculares exclusivos, e seis microlitros de adaptadores i7.Se o objetivo for multiplexação, use adaptadores i7 diferentes em amostras separadas. Agora, execute o PCR usando os seguintes parâmetros: trinta segundos a 98 graus Celsius, seguidos por quatro a seis ciclos de dez segundos a 98 graus Celsius, trinta segundos a 66 graus Celsius e trinta segundos a 72 graus Celsius. Termine a reação com uma extensão de dois minutos a 72 graus Celsius e mantenha a quatro graus Celsius.Então, os dois ciclos de PCR que você precisa fazer neles provavelmente dependem do tamanho do painel de genes que você usa, de acordo com nossa experiência, um PCR de quatro ciclos é suficiente se o painel de genes tiver cerca de 1500 caminhos diferentes de oligos específicos de genes, enquanto um painel com cerca de cinco a 600 pares de oligos requer cerca de seis ciclos de PCR. Em seguida, limpe as reações de PCR usando esferas magnéticas, adicione 56,25 microlitros de solução de esferas magnéticas em cada produto de PCR de 75 microlitros e, em seguida, transfira cada reação para um tubo separado de baixa ligação de 1,5 mililitro, misturado por pipetagem para cima e para baixo pelo menos dez vezes, e aguarde cinco minutos. Em seguida, transfira as misturas para um suporte magnético e deixe os sobrenadantes limparem por dois minutos.Em seguida, remova e descarte os sobrenadantes. Em seguida, adicione 200 microlitros de etanol a 70%, aguarde trinta segundos e remova o etanol. Repita esta etapa de lavagem com etanol uma vez e deixe as esferas secarem ao ar por cinco minutos.Finalmente, eluir as bibliotecas modificadas das esferas em vinte microlitros de água bidestilada Em seguida, coloque os tubos em um rack magnético para separar as esferas magnéticas do eluente. Primeiro, faça diluições seriais de dez vezes das bibliotecas ECS da etapa anterior, até uma parte por 1.000 em tiras de PCR.Em seguida, prepare um Master Mix em um tubo de 1,5 mililitro. Para cada reação, combine 10 microlitros de ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 microlitros de primer P5, 0,2 microlitros de primer P7 e 4,6 microlitros de água bidestilada Em seguida, pipete 15 microlitros do EvaGreen Master Mix em um novo conjunto de tubos e, finalmente, adicione cinco microlitros de um a 1.000 ECS de produto limpo ao Master Mix.Em seguida, faça gotículas de PCR usando o gerador de gotículas. Primeiro, carregue o, pipete 70 microlitros de óleo de geração de gotículas no poço do, óleo rotulado e pipete 20 microlitros da mistura de reação ddPCR na amostra bem rotulada. Em seguida, cubra o com uma junta de borracha e carregue-o no gerador de gotículas e toda a geração de gotículas para prosseguir.Agora, usando uma pipeta multicanal, lentamente, ao longo de cinco segundos, carregue 45 microlitros de gotículas retiradas de cada poço de, em uma nova placa de PCR. Em seguida, sele a placa PCR com uma folha de alumínio. Agora, amplifique o sinal nas gotículas usando as seguintes condições: cinco minutos a 95 graus Celsius, seguidos por 40 ciclos de trinta segundos a 95 graus Celsius e um minuto a 63 graus Celsius, então, resfrie a reação a quatro graus Celsius por cinco minutos antes de aumentá-la para 90 graus Celsius por cinco minutos, e depois segurando a quatro graus Celsius.Em seguida, prepare a máquina de leitura de gotículas de modelo ddPCR. Selecione os parâmetros para quantificação absoluta e o uso do QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. Em seguida, execute as reações no leitor de gotículas.Quando a análise ddPCR estiver concluída, aplique os mesmos limites divisivos a cada amostra. Em seguida, normalize cada biblioteca para o número desejado de moléculas. Comece fazendo reações de 50 microlitros, consistindo em 25 microlitros de Q5 Master Mix, dois microlitros de um primer P5 micromolar, dois microlitros de um primer P7 micromolar e 21 microlitros de biblioteca de DNA normalizada.Em seguida, execute o PCR usando os seguintes parâmetros: 30 segundos a 98 graus Celsius, seguidos por 16 ciclos de 10 segundos a 98 graus Celsius, trinta segundos a 66 graus Celsius e trinta segundos a 72 graus Celsius, depois dois minutos a 72 graus Celsius e mantenha a quatro graus Celsius. Em seguida, quantifique a concentração de DNA nas bibliotecas e agrupe as bibliotecas em quantidades molares iguais para sequenciamento, visando aproximadamente quatro nanomolares. Agora, sequencie a biblioteca ECS agrupada usando a plataforma de sequenciamento Illumina, com as seguintes configurações de sequenciamento: duas vezes 144 leituras de extremidade emparelhada, oito ciclos de índice um e 16 ciclos de índice dois.O DNA de um paciente com uma mutação em GATA1 foi diluído em DNA genômico comercial no VAF original de 0,19. Usando o protocolo descrito, o ECS provou ser quantitativo a um nível de um a 10.000 para a variante de nucleotídeo único. Em seguida, amostras de pelagem leucocitária de vinte indivíduos saudáveis foram analisadas usando um painel de sequenciamento comercial que consiste em 568 amplicons.Em resumo, 109 mutações somáticas clonais estavam presentes em ambas as réplicas de pelo menos um ponto de tempo de coleta com frações alélicas variantes variando de 0,0003 a 0,1451.21 das mutações com representações cósmicas conhecidas foram selecionadas e cada uma foi validada usando PCR de gotículas digitais. Para demonstrar o nível de expressão corrigido por erros do protocolo, um painel de genes personalizado composto por 415 genes conhecidos por estarem associados a vários tipos de câncer foi usado para produzir uma biblioteca construída a partir do exon mais comumente expresso de cada gene. O nível de expressão do transcrito de baixa abundância foi altamente reprodutível entre as repetições.A PCR digital de gotículas foi então usada para validar seis genes selecionados com expressão variável. Uma comparação mostra que o nível de expressão dos genes foi capturado corretamente pelo protocolo ECS, sem a necessidade de normalização. Depois de dominar a técnica, essa técnica pode ser feita confortavelmente em um dia e meio.A maior parte do tempo será incubação, e o manuseio manual ocupa cerca de 30-40% do tempo total necessário, dependendo de quantas amostras os pesquisadores estão processando ao mesmo tempo. Ao tentar este procedimento, é muito importante ter uma biblioteca de sequenciamento replicado para a mesma amostra. Isso lhe dará mais confiança de que uma mutação de baixa frequência é verdadeiramente positiva se a mutação em si for independentemente do núcleo em ambas as replicações.Após esse procedimento, outros assuntos, como o RNA do ECS, podem ser realizados para responder a perguntas como detecção de transcrito de baixa abundância ou transcrito de fusão. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores principalmente no campo de malignidades hematológicas, e usamos essa técnica para explorar clones pré-leucêmicos em indivíduos saudáveis, bem como para detectar doença residual mínima em pacientes com leucemia que estão em remissão.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Seqüenciamento de DNA pool é uma estratégia rápida e de custo eficaz para detectar variantes raras associadas com fenótipos complexos em grandes grupos. Aqui descrevemos a análise computacional de pool, o seqüenciamento da próxima geração de 32 genes relacionados ao câncer, utilizando o pacote de software SPLINTER. Este método é escalável, e aplicável a qualquer fenótipo de interesse.

Detecção de variantes raras genômico de Seqüenciamento combinados usando SPLINTER

Este vídeo demonstra a PCR digital baseada em chip — uma variação da técnica de PCR digital que é útil na detecção de variantes raras de transcrição. A reação de PCR é particionada nas câmaras de um chip nanofluídico, cada um dos quais atua como uma reação independente. A detecção de sinais de fluorescência das câmaras com alvos amplificados confirma a presença de variantes raras de transcrição na amostra.

PCR digital baseado em chip para detectar variantes raras de transcrição usando um chip nanofluídico

A PCR de bloqueio do tipo selvagem seguida de sequenciamento direto oferece um método altamente sensível de detecção de mutações somáticas de baixa frequência em uma variedade de tipos de amostra.

De tipo selvagem Bloqueio de PCR combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de Baixa Frequência mutações somáticas

Aqui, apresentamos um protocolo para rastreamento genômica contaminação de DNA (gDNA) em amostras de RNA. O método apresentado utiliza primers específicos para a região de espaçador transcrito interno (ITS) de genes ribossomais de DNA (rDNA). O método é adequado para detecção fiável e sensível de contaminação de DNA na maioria dos eucariontes e procariontes.

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Este manuscrito descreve uma técnica para a detecção de mutações de baixa frequência em ctDNA, ER-Seq Este método é diferenciado pela sua utilização exclusiva de correção de erros de bi-direcional, um filtro de fundo especial e eficiente aquisição molecular.

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Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

A detecção rápida e a quantificação confiável dos eventos de edição de RNA em escala genômica permanecem desafiadoras e atualmente dependem de métodos de sequenciamento direto de RNA. O protocolo descrito aqui usa a eletroforese de gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como um método simples, rápido e portátil de detectar a edição de RNA.

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sequenciamento de uma única célula é uma ferramenta cada vez mais popular e acessível para lidar com alterações genômicas em alta resolução. Nós fornecemos um protocolo que utiliza a sequenciação de célula única para identificar alterações no número de cópias em células individuais.

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

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