Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Este método pode ajudar a responder a algumas questões-chave em vários campos de pesquisa, como detecção de clones pré-cancerosos, avaliação prognóstica de pacientes com leucemia após o tratamento e identificação de mutações potencialmente patogênicas em doadores de medula óssea. Demonstrando este procedimento comigo estará Spencer, ele é um técnico no laboratório. Este vídeo descreve como combinar o Protocolo de Sequenciamento Corrigido por Erros com a química Illumina e painéis de genes disponíveis comercialmente para detectar variantes clonais de nucleotídeo único e pequenos indels com sensibilidade de um em 10.000.

Para incorporar os identificadores moleculares exclusivos necessários, os adaptadores 16N i5 e i7 personalizados usam PCR. Primeiro, prepare o Q5 Master Mix, que usa uma polimerase com maior fidelidade do que a alternativa disponível comercialmente. Em seguida, para cada reação, combine 37,5 microlitros de Q5 Master Mix, seis microlitros de cinco adaptadores micromolares 16N i5, que são os identificadores moleculares exclusivos, e seis microlitros de adaptadores i7.

Se o objetivo for multiplexação, use adaptadores i7 diferentes em amostras separadas. Agora, execute o PCR usando os seguintes parâmetros: trinta segundos a 98 graus Celsius, seguidos por quatro a seis ciclos de dez segundos a 98 graus Celsius, trinta segundos a 66 graus Celsius e trinta segundos a 72 graus Celsius. Termine a reação com uma extensão de dois minutos a 72 graus Celsius e mantenha a quatro graus Celsius.

Então, os dois ciclos de PCR que você precisa fazer neles provavelmente dependem do tamanho do painel de genes que você usa, de acordo com nossa experiência, um PCR de quatro ciclos é suficiente se o painel de genes tiver cerca de 1500 caminhos diferentes de oligos específicos de genes, enquanto um painel com cerca de cinco a 600 pares de oligos requer cerca de seis ciclos de PCR. Em seguida, limpe as reações de PCR usando esferas magnéticas, adicione 56,25 microlitros de solução de esferas magnéticas em cada produto de PCR de 75 microlitros e, em seguida, transfira cada reação para um tubo separado de baixa ligação de 1,5 mililitro, misturado por pipetagem para cima e para baixo pelo menos dez vezes, e aguarde cinco minutos. Em seguida, transfira as misturas para um suporte magnético e deixe os sobrenadantes limparem por dois minutos.

Em seguida, remova e descarte os sobrenadantes. Em seguida, adicione 200 microlitros de etanol a 70%, aguarde trinta segundos e remova o etanol. Repita esta etapa de lavagem com etanol uma vez e deixe as esferas secarem ao ar por cinco minutos.

Finalmente, eluir as bibliotecas modificadas das esferas em vinte microlitros de água bidestilada Em seguida, coloque os tubos em um rack magnético para separar as esferas magnéticas do eluente. Primeiro, faça diluições seriais de dez vezes das bibliotecas ECS da etapa anterior, até uma parte por 1.000 em tiras de PCR.

Em seguida, prepare um Master Mix em um tubo de 1,5 mililitro. Para cada reação, combine 10 microlitros de ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 microlitros de primer P5, 0,2 microlitros de primer P7 e 4,6 microlitros de água bidestilada Em seguida, pipete 15 microlitros do EvaGreen Master Mix em um novo conjunto de tubos e, finalmente, adicione cinco microlitros de um a 1.000 ECS de produto limpo ao Master Mix.

Em seguida, faça gotículas de PCR usando o gerador de gotículas. Primeiro, carregue o, pipete 70 microlitros de óleo de geração de gotículas no poço do, óleo rotulado e pipete 20 microlitros da mistura de reação ddPCR na amostra bem rotulada. Em seguida, cubra o com uma junta de borracha e carregue-o no gerador de gotículas e toda a geração de gotículas para prosseguir.

Agora, usando uma pipeta multicanal, lentamente, ao longo de cinco segundos, carregue 45 microlitros de gotículas retiradas de cada poço de, em uma nova placa de PCR. Em seguida, sele a placa PCR com uma folha de alumínio. Agora, amplifique o sinal nas gotículas usando as seguintes condições: cinco minutos a 95 graus Celsius, seguidos por 40 ciclos de trinta segundos a 95 graus Celsius e um minuto a 63 graus Celsius, então, resfrie a reação a quatro graus Celsius por cinco minutos antes de aumentá-la para 90 graus Celsius por cinco minutos, e depois segurando a quatro graus Celsius.

Em seguida, prepare a máquina de leitura de gotículas de modelo ddPCR. Selecione os parâmetros para quantificação absoluta e o uso do QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. Em seguida, execute as reações no leitor de gotículas.

Quando a análise ddPCR estiver concluída, aplique os mesmos limites divisivos a cada amostra. Em seguida, normalize cada biblioteca para o número desejado de moléculas. Comece fazendo reações de 50 microlitros, consistindo em 25 microlitros de Q5 Master Mix, dois microlitros de um primer P5 micromolar, dois microlitros de um primer P7 micromolar e 21 microlitros de biblioteca de DNA normalizada.

Em seguida, execute o PCR usando os seguintes parâmetros: 30 segundos a 98 graus Celsius, seguidos por 16 ciclos de 10 segundos a 98 graus Celsius, trinta segundos a 66 graus Celsius e trinta segundos a 72 graus Celsius, depois dois minutos a 72 graus Celsius e mantenha a quatro graus Celsius. Em seguida, quantifique a concentração de DNA nas bibliotecas e agrupe as bibliotecas em quantidades molares iguais para sequenciamento, visando aproximadamente quatro nanomolares. Agora, sequencie a biblioteca ECS agrupada usando a plataforma de sequenciamento Illumina, com as seguintes configurações de sequenciamento: duas vezes 144 leituras de extremidade emparelhada, oito ciclos de índice um e 16 ciclos de índice dois.

O DNA de um paciente com uma mutação em GATA1 foi diluído em DNA genômico comercial no VAF original de 0,19. Usando o protocolo descrito, o ECS provou ser quantitativo a um nível de um a 10.000 para a variante de nucleotídeo único. Em seguida, amostras de pelagem leucocitária de vinte indivíduos saudáveis foram analisadas usando um painel de sequenciamento comercial que consiste em 568 amplicons.

Em resumo, 109 mutações somáticas clonais estavam presentes em ambas as réplicas de pelo menos um ponto de tempo de coleta com frações alélicas variantes variando de 0,0003 a 0,1451.21 das mutações com representações cósmicas conhecidas foram selecionadas e cada uma foi validada usando PCR de gotículas digitais. Para demonstrar o nível de expressão corrigido por erros do protocolo, um painel de genes personalizado composto por 415 genes conhecidos por estarem associados a vários tipos de câncer foi usado para produzir uma biblioteca construída a partir do exon mais comumente expresso de cada gene. O nível de expressão do transcrito de baixa abundância foi altamente reprodutível entre as repetições.

A PCR digital de gotículas foi então usada para validar seis genes selecionados com expressão variável. Uma comparação mostra que o nível de expressão dos genes foi capturado corretamente pelo protocolo ECS, sem a necessidade de normalização. Depois de dominar a técnica, essa técnica pode ser feita confortavelmente em um dia e meio.

A maior parte do tempo será incubação, e o manuseio manual ocupa cerca de 30-40% do tempo total necessário, dependendo de quantas amostras os pesquisadores estão processando ao mesmo tempo. Ao tentar este procedimento, é muito importante ter uma biblioteca de sequenciamento replicado para a mesma amostra. Isso lhe dará mais confiança de que uma mutação de baixa frequência é verdadeiramente positiva se a mutação em si for independentemente do núcleo em ambas as replicações.

Após esse procedimento, outros assuntos, como o RNA do ECS, podem ser realizados para responder a perguntas como detecção de transcrito de baixa abundância ou transcrito de fusão. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores principalmente no campo de malignidades hematológicas, e usamos essa técnica para explorar clones pré-leucêmicos em indivíduos saudáveis, bem como para detectar doença residual mínima em pacientes com leucemia que estão em remissão.