Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares de adultos Schistosoma japonicum

O objetivo geral deste procedimento é isolar vesículas extracelulares do meio de Schistosoma japonicum adulto cultivado in vitro. Este método pode isolar eficientemente EV em meio de cultura in vitro de Schistosoma japonicum adulto. A principal vantagem desta técnica é capaz de isolar eficientemente a vesícula extracelular do meio de cultura in vitro de curto prazo, o que pode minimizar o estresse potencialmente resultando em secreção não fisiológica de EV.

A demonstração será feita por Juntao Liu, um técnico do meu laboratório. Colete os parasitas em um copo de 500 mililitros e lave-os bem, mas delicadamente, três vezes usando 200 mililitros de PBS quente. Mantenha as lavagens breves e use a sedimentação por gravidade para separar os parasitas.

Em seguida, em pratos de 90 milímetros, coloque cerca de 200 pares de minhocas por prato. No prato, lave os parasitas mais duas vezes usando sedimentação por gravidade. Para essas lavagens, use meio RPMI quente suplementado com caneta-estreptococo.

Substitua a segunda lavagem por 40 mililitros do meio sem antibióticos. Em seguida, cultive os parasitas a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono por duas horas. Após duas horas, transfira o meio das placas para os tubos de centrífuga e, em seguida, acumule os ovos e detritos de vermes a 2.000 g por 30 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, colete e transfira o sobrenadante para um novo tubo. Em seguida, filtre o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,22 mícron e colete a solução filtrada em uma bolsa de diálise com um corte de peso molecular de 3,5 quilodaltons. Em seguida, dialise a solução usando solução de 8% PEG8000 a quatro graus Celsius durante a noite.

Esta etapa é importante para aumentar o rendimento de vesículas extracelulares. No dia seguinte, transfira a solução dialisada para um novo tubo e adicione 0,5 volumes do reagente de isolamento total do exossomo. Misture a solução até ficar homogênea e incube a cerca de cinco graus Celsius durante a noite.

Na manhã seguinte, centrifugue a mistura a 15 000 g durante uma hora a cerca de cinco graus Celsius. Em seguida, aspire e descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de EVs em dois mililitros de PBS. O pellet provavelmente não será visível.

Para análise de western blot, primeiro determine a concentração de proteína da amostra, como com o ensaio BCA. Em seguida, prepare de 10 a 20 microgramas de EVs em 22,5 microlitros de tampão RIPA. Em seguida, adicione 7,5 microlitros de tampão de carregamento 4X e aqueça a mistura a 95 graus Celsius por cinco minutos.

Após o tratamento térmico, separe as proteínas da vesícula extracelular em um gel 12%SDS-PAGE. Depois de executar o gel, as proteínas são transferidas para a membrana de PVDF. Sondar a membrana com anticorpos anti-CD63 numa diluição de um a 1 000.

Em seguida, trate a membrana com IgG-HRP anti-coelho em uma diluição de um a 5.000. Agora, use um reagente de detecção de ECL para desenvolver a membrana e siga com a análise em um sistema de imagem de quimioluminescência. Comece transferindo cinco microgramas de amostra para um tubo de ultracentrífuga de polipropileno e ajuste o volume para 12 mililitros com o meio RPMI-1640.

Em seguida, centrifugue a amostra a 110.000 g por 90 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, aspirar cuidadosamente e rejeitar o sobrenadante. Em seguida, prepare uma suspensão de vesícula extracelular 2X adicionando um mililitro de diluente C ao pellet.

Ressuspenda o pellet com uma pipetagem suave. Agora, prepare uma solução de corante 2X fresca. Adicione dois microlitros do corante etanólico PKH67 a um mililitro de diluente C em um tubo de microcentrífuga e misture bem.

Em seguida, core a amostra misturando as duas soluções e incubando a mistura em temperatura ambiente por quatro minutos. Em seguida, pare a coloração adicionando quatro mililitros de FBS e aguarde mais um minuto. Em seguida, adicione o meio RPMI-1640 para ajustar o volume para 12 mililitros e gire a suspensão para isolar as vesículas manchadas.

Remova e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda os EVs marcados com PKH67 peletizados em 12 mililitros de meio RPMI-1640. Em seguida, repita a centrifugação, mas desta vez colete as vesículas em um mililitro de PBS.

Para o ensaio de captação, preparar culturas de células de mamíferos durante a noite em placas de seis poços. Na manhã seguinte, adicione cinco microgramas de vesículas marcadas com PKH67 em cada poço e continue a cultura por duas a quatro horas. Após a incubação, remova o meio e lave as células com PBS duas vezes.

Em seguida, fixe as células por 15 minutos, lave-as duas vezes com PBS e core-as com DAPI antes da imagem. Esquistossomos no estágio hepático foram coletados de coelhos 28 dias após a infecção. Vesículas extracelulares foram então coletadas dos vermes esquistossomos e analisadas.

Seu tamanho de partícula, conforme determinado pela análise de nanopartículas de Malvern, variou entre 100 e 400 nanômetros, com a maior parte da população perto de 220 nanômetros. A microscopia eletrônica de transmissão revelou que as vesículas extracelulares eram redondas e tinham entre 100 e 200 nanômetros de diâmetro. A análise de Western blotting indicou que as vesículas extracelulares isoladas foram reconhecidas usando anticorpos CD63, que é um marcador típico de vesículas extracelulares.

A microscopia de fluorescência de vesículas extracelulares marcadas com PKH67 internalizadas pelas células do clone 1469 do NCTC mostrou que as vesículas extracelulares estavam distribuídas principalmente no citoplasma das células receptoras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar EV em meio de cultura in vitro de Schistosoma japonicum adulto.