Name: Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares de adultos Schistosoma japonicum (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprenda a isolar vesículas extracelulares de Schistosoma japonicum em cultura in vitro com mínimo estresse. Este método eficiente permite estudar a biologia parasitária e a comunicação celular.

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Este estudo foi, em parte ou no todo, suporte Nacional Natural Science Foundation da China (31472187 e 31672550) e a ciência agrícola e programa de inovação de tecnologia da Academia Chinesa de Ciências agrárias.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de ética local do Instituto de investigação veterinária de Shanghai, Academia Chinesa de Ciências agrárias (número de licença: SHVRIAU-14-0101).
1. cultura in Vitro de Schistosomes
Nota: Schistosomes representam um risco biológico. Os trabalhadores devem usar luvas de látex vezes quando manipulação vermes, suspensões esquistossomóticos ou outros relacionados com materiais biológicos. Nova Zelândia coelhos foram infectados com cercárias ~ 2.000 via abdominal exposição. Schistosomes na fase hepática foram coletados de coelhos infectados com cercárias de S. japonicum a pós-infecção 28 dias por perfusão de fígado e veias mesentéricas. Os procedimentos de coleta de verme tem sido referenciados em publicações anteriores, relatórios de estudos em ratos18.
<ol><li>Recolha os parasitas em um copo de 500 mL. Lave-as e delicadamente 3 x 200 ml de pré-aquecido (37 ° C) PBS (pH 7,4).</li>
	<li>Separe pares de worm ~ 200 para cada prato de Petri de 90 mm. Então lave os parasitas e suavemente 2x com 50 mL de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura RPMI 1640 contendo 100 U de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina.</li>
	<li>Manter parasitas em 40 mL de meio de cultura RPMI-1640 pré-aquecido sem antibióticos a 37 ° C, abaixo dos 5% de CO2 em uma densidade de ~ 5 worm pares /mL para 2 h em 90 mm Petri dish. Notas: O meio RPMI 1640 não deve conter soro, caso contrário serão introduzida exógena vesículas extracelulares.</li>
</ol>2. previamente tratada condição Media
<ol><li>Recolher o meio de cultura e centrifugar o médio a 4 ° C, a 2.000 × g por 30 min remover os ovos e detritos tegmental de verme.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para um tubo de fresco e em seguida filtrar a solução através de um filtro de seringa 0,22 µm.</li>
	<li>Recolher a solução filtrada em um saco dializado (corte de peso molecular: 3.5kD) e em seguida Dialize a solução usando solução a 8% PEG8000 a 4 ° C durante a noite. Notas: Este passo é importante para enriquecer SjEVs para aumentar o rendimento de isolamento SjEVs.</li>
</ol>3. isolamento de SjEVs
<ol><li>Transferir a solução dializada para um novo tubo e adicione 0,5 volumes do reagente exossomo total isolamento.</li>
	<li>Misture a solução bem pela utilização do Vortex ou pipetagem para cima e para baixo para garantir a homogeneidade da solução.</li>
	<li>Incube a mistura entre 2 ° C a 8 ° C durante a noite.</li>
	<li>Centrifugue a mistura a 15.000 × g, durante 1 h, 2 ° c e 8 ° c.</li>
	<li>Aspirar e desprezar o sobrenadante. Notas: SVE constam o sedimento no fundo do tubo (não visível na maioria dos casos).</li>
	<li>Resuspenda o pellet EVs em 2 mL de PBS e em seguida armazenar a solução EVs a-80 ° C até uma análise mais aprofundada.</li>
</ol>4. caracterização de EVs pela mancha ocidental
<ol><li>Determine a concentração de proteína da amostra SjEVs, por exemplo, por meio de ensaio BCA.</li>
	<li>Prepare-se 10-20 µ g de EVs no buffer RIPA 22,5 µ l. Em seguida, adicione 7,5 µ l de 4x carregando buffer e calor durante 5 min à 95 ° C.</li>
	<li>Separe as proteínas SjEVs por gel de SDS-PAGE 12%.</li>
	<li>Transferência das proteínas à membrana PVDF e então sonda com anticorpos anti-CD63 (1:1, 000 diluição), seguidos por sondagem com IgG de coelho anti-HRP (1:5, 000 diluição).</li>
	<li>Utilizar o reagente de detecção de ECL para desenvolvimento de membrana e detectar os sinais por uma sistema de imagem de quimioluminescência.</li>
</ol>5. caracterização de EVs por microscopia eletrônica de transmissão
<ol><li>Adicionar 2 µ l de SjEVs isolado para 200 malha revestida formvar grades e depois deixe-o secar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Mancha com 2% de ácido fosfotúngstico por 1 min e depois deixe-o secar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Carregar as grades para porta-amostras de microscópio de elétron da transmissão e exposto a um feixe de elétrons 80 kV para captura de imagem.</li>
</ol>6. SjEVs rótulo com PKH67 e ensaio de absorção de células
Notas: Todas as etapas subsequentes foram realizadas à temperatura ambiente (20-25 ° C), salvo indicação em contrário.
<ol><li>Transferência de 5 µ g SjEVs solução para um tubo de polipropileno de fundo cónico e ajustar o volume de 12 mL pela adição de meio RPMI 1640.</li>
	<li>Centrifugue a SjEVs a 110.000 × g por 90 min a 4 ° C para SjEVs de Pelotas.</li>
	<li>Após a centrifugação, Aspire cuidadosamente o sobrenadante. Nota: A tintura de etanol PKH67 não deve ser adicionada diretamente para a pelota de SjEV, pois isso iria resultar em coloração heterogênea e viabilidade celular reduzida.</li>
	<li>Preparar uma solução a suspensão EV 2x, adicionando 1 mL de diluente C ao pellet SjEV; para garantir a completa dispersão, resuspenda com suave pipetagem.</li>
	<li>Antes de coloração em diluente C, prepare um fresco 2 x tintura solução adicionando 2 µ l da solução etanólica de tintura de PKH67 para 1 mL de diluente C num tubo de centrífuga de polipropileno e mistura bem para dispersar.</li>
	<li>Adicione rapidamente a 1 mL de 2x suspensão EV (etapa 6.4) a 1 mL de 2 x solução corante (passo 6.5) e imediatamente misture a amostra por pipetagem.</li>
	<li>Incube a mistura à temperatura ambiente durante 4 min.</li>
	<li>Parar a coloração adicionando 4 mL de FBS e então incubar durante 1 min.</li>
	<li>Adicione meio RPMI1640 para ajustar o volume de 12 mL e então centrifugar a 110.000 × g a 4 ° C por 90 min.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e adicionar meio RPMI1640 para Ressuspender o PKH67 rotulado SjEV Pelotas.</li>
	<li>Centrifugar a 110.000 × g a 4 ° C por 90 min lavar uma vez e então adicione o PBS para Ressuspender as pelotas de SjEVs.</li>
</ol>7. ensaio de absorção de células SjEVs
<ol><li>Células de mamíferos de semente como NCTC clonagem células 1469 ou HEK293T em placas boas 6 (2 × 105 células por poço) e cultura das células durante a noite.</li>
	<li>Adicionar 5 µ g SjEVs PKH67-rotulados e cultura então células a 37 ° C, durante 2-4 h.</li>
	<li>Após a incubação, remover o meio e lavar as células com PBS duas vezes.</li>
	<li>Consertar as células com solução de formol 4% por 15 min e lavado duas vezes mais com PBS.</li>
	<li>Mancha do núcleo de células com 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
	<li>Observe as células usando microscopia de fluorescência.</li>
</ol>

<ol><li>Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication.</a> Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).</li>
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<li>Sotillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+secreted+by+Schistosoma+mansoni+contain+protein+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates.</a> Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).</li>
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<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-like+vesicles+derived+by+Schistosoma+japonicum+adult+worms+mediates+M1+type+immune-+activity+of+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage.</a> Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).</li>
<li>Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+enrichment+by+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).</li>
<li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).</li>
<li>Livshits, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26616523">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Sci Rep. 5, 17319(2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+extracellular+vesicles+containing+small+RNAs+from+the+eggs+of+Schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 574(2016).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+S.+japonicum+exosome-like+vesicles+reveals+their+regulatory+roles+in+parasite-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions.</a> Sci Rep. 6, 25885(2016).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 11(2001).</li>
<li>Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miRNAs%3A+roles+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Estudos recentes sobre EVs têm demonstrado que esquistossomíase que EVS desempenham um papel importante nas interações patógeno-hospedeiro3,9,12,de16. Para endereço ainda mais suas funções reguladoras, é essencial para isolar EVs de schistosomes. Aqui, descrevemos um método alternativo para SjEV isolamento. Este método produz um tamanho de ampla gama de SjEVs, de 100 nm a 400 nm, em adultos <em...

Vesículas extracelulares (EVs) são uma população de pequenas vesículas de membrana-limite encapsulado com várias proteínas, lípidos e ácidos nucleicos. Estudos recentes demonstraram que EVs desempenham um papel crucial na comunicação célula-célula e estão envolvidos na regulação de numerosos processos fisiológicos, incluindo desenvolvimento de célula, regulamento imune, angiogênese e da migração celular2, 3,4,5. Acumular evidências indica que EVs, circulando exosomes e sua carga de miRNA representa potenciais biomarcadores de determinadas doenças6.
Vários protozoários como Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzie Leishmania spp., foram mostrados para ser capaz de secretar EVs; Além disso foram encontrados helmintos de secretar EVs em vivo hospeda7. EVs parasitárias foram mostrados para ser envolvido na manutenção da infecção, patogenicidade8e imune regra9. Recentes estudos em schistosomes ambos Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 e S. japonicum12 têm indicado que adultos schistosomes secretam exossomo como vesículas que podem ser envolvidos na regulamentação funcional de processos biológicos específicos.
Até à data, vários métodos têm sido utilizados para isolar vesículas extracelulares, tais como ultracentrifugação, ultrafiltração13, o uso de reagentes baseado em polímero, cromatografia de exclusão-tamanho e isolamento de immunoaffinity. Esses métodos diferentes possuem suas próprias vantagens e limitações de14. Geralmente, a ultracentrifugação é considerada o método padrão-ouro para isolamento de vesículas. No entanto, este método sofre a limitação do potencial de agregação de EV14.
Em schistosomes, foram relatados alguns métodos para isolamento de EV: Estes incluem ultracentrifugação11,12,10 e o uso de comerciais EV isolamento kit16 para vários estágios (ovos16, schistosomula11, schistosomes adulto10,12,17). Dado que aumentada é de uma vasta gama de tamanho de várias centenas de nanômetros a mil nanômetros, desenvolvemos um método alternativo que combina com o uso de centrífuga de bancada e um kit de isolamento comercial EV para isolar o SVE de ultrafiltração adultos de Schistosoma japonicum. O SVE isolado normalmente possuía um diâmetro de 100-400 nm e com êxito foram internalizado pelas células destinatários.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Reagente de isolamento de exossomos totais (a partir de meios de cultura de células)</td><td>ThermoFisher 4478359 CIENTÍFICO</td><td></td><td>Para isolar vesículas extracelulares de S. japonicum</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-aldrich</td><td>MINI67</td><td>Para rotulagem Evs</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11875119</td><td>Para cultura de parasitas</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0.22&mu; Filtro de seringa M</td> Tubo de Diálise <td>Merck</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100159&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore&trade; Imóveis&comércio; Substrato de HRP Quimioluminescente Ocidental (ECL)</td><td>Fisher scientific</td><td>WBKLS0100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DAPI Cell Signaling Technology</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>CD63 anticorpos</td><td>Sangon Biotech</td><td>D160973-0025</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1704273</td><td></td></tr><tr><td>Formvar / Carbon 400 mesh</td><td>Ted Pella</td><td>01754-F</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfotúngstico</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>clone anti-camundongo IgG-HRP</td><td>CWBIO</td><td>CW0102</td><td></td></tr><tr><td>NCTC 1469 células</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CCL-9.1&trade;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30087.02</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td>GE sistema de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>imagem de imagem de quimioluminescência</td><td>GE</td><td>ImageQuant LAS4000mini</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia eletrônica de transmissão</td><td>Hitachi</td><td>H-7600</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q água</td><td>Milli-Q Milli-Q</td><td>Elix</td><td></td></tr><tr><td>Eppendor Centrífuga</td><td>Centrífuga Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP Incubadora de Ultracentrífuga</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ESCO</td><td>CCL-107B</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axin Observer Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização de vesículas extracelulares de adultos schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas membranosas lançadas por uma variedade de células no microambiente extracelular. SVE representa uma população de vesículas heterogêneas, cujo intervalo de tamanho entre 40 e 1.000 nm. Evidências acumuladas indicaram que EVs desempenham importantes funções reguladoras em interações patógeno-hospedeiro. Uma compreensão profunda da esquistossomíase EVs deve fornecer insights sobre os mecanismos subjacentes interações esquistossomíase-host, permitindo o desenvolvimento de novas estratégias contra a esquistossomose. Aqui, pretendemos estudar mais EVs funções em schistosomes apresentando um protocolo para o isolamento e caracterização de EVs de adultos Schistosoma japonicum (S. japonicum). SVE foram isolados em vitro o meio de cultura usando centrifugação combinada com um kit de isolamento exossomo comercial. Os isolados de S. japonicum EVs (SjEVs) normalmente possuem um diâmetro de 100-400 nm e são caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e mancha ocidental. O uso de PKH67 SjEVs de tingir-etiquetados demonstrou que SjEVs são internalizados pelas células destinatários. No geral, o nosso protocolo fornece um método alternativo para isolar EVs de schistosomes adultos; o SjEVs isolado pode ser adequado para análise funcional.

Para quantificar o rendimento de SjEVs isolado usando o protocolo descrito, costumávamos ensaio da proteína BCA para acessar a concentração de proteína da SjEVs isolada de adultos schistosomes 28 dias. Conforme mostrado na tabela 1, a concentração de proteína SjEV variou de 208 µ g a 250 µ g por 100 mL de meio (tabela 1). O tamanho de partícula, conforme determinado pela análise de nanopartículas de Malvern, indicou que o isolado SjEVs variou de 100 nm a ...

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever o isolamento de vesículas extracelulares (EVs) em vitro culta médio de adultos Schistosoma japonicum.

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares de adultos Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar vesículas extracelulares do meio de Schistosoma japonicum adulto cultivado in vitro. Este método pode isolar eficientemente EV em meio de cultura in vitro de Schistosoma japonicum adulto. A principal vantagem desta técnica é capaz de isolar eficientemente a vesícula extracelular do meio de cultura in vitro de curto prazo, o que pode minimizar o estresse potencialmente resultando em secreção não fisiológica de EV.A demonstração será feita por Juntao Liu, um técnico do meu laboratório. Colete os parasitas em um copo de 500 mililitros e lave-os bem, mas delicadamente, três vezes usando 200 mililitros de PBS quente. Mantenha as lavagens breves e use a sedimentação por gravidade para separar os parasitas.Em seguida, em pratos de 90 milímetros, coloque cerca de 200 pares de minhocas por prato. No prato, lave os parasitas mais duas vezes usando sedimentação por gravidade. Para essas lavagens, use meio RPMI quente suplementado com caneta-estreptococo.Substitua a segunda lavagem por 40 mililitros do meio sem antibióticos. Em seguida, cultive os parasitas a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono por duas horas. Após duas horas, transfira o meio das placas para os tubos de centrífuga e, em seguida, acumule os ovos e detritos de vermes a 2.000 g por 30 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, colete e transfira o sobrenadante para um novo tubo. Em seguida, filtre o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,22 mícron e colete a solução filtrada em uma bolsa de diálise com um corte de peso molecular de 3,5 quilodaltons. Em seguida, dialise a solução usando solução de 8% PEG8000 a quatro graus Celsius durante a noite.Esta etapa é importante para aumentar o rendimento de vesículas extracelulares. No dia seguinte, transfira a solução dialisada para um novo tubo e adicione 0,5 volumes do reagente de isolamento total do exossomo. Misture a solução até ficar homogênea e incube a cerca de cinco graus Celsius durante a noite.Na manhã seguinte, centrifugue a mistura a 15 000 g durante uma hora a cerca de cinco graus Celsius. Em seguida, aspire e descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de EVs em dois mililitros de PBS. O pellet provavelmente não será visível.Para análise de western blot, primeiro determine a concentração de proteína da amostra, como com o ensaio BCA. Em seguida, prepare de 10 a 20 microgramas de EVs em 22,5 microlitros de tampão RIPA. Em seguida, adicione 7,5 microlitros de tampão de carregamento 4X e aqueça a mistura a 95 graus Celsius por cinco minutos.Após o tratamento térmico, separe as proteínas da vesícula extracelular em um gel 12%SDS-PAGE. Depois de executar o gel, as proteínas são transferidas para a membrana de PVDF. Sondar a membrana com anticorpos anti-CD63 numa diluição de um a 1 000.Em seguida, trate a membrana com IgG-HRP anti-coelho em uma diluição de um a 5.000. Agora, use um reagente de detecção de ECL para desenvolver a membrana e siga com a análise em um sistema de imagem de quimioluminescência. Comece transferindo cinco microgramas de amostra para um tubo de ultracentrífuga de polipropileno e ajuste o volume para 12 mililitros com o meio RPMI-1640.Em seguida, centrifugue a amostra a 110.000 g por 90 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, aspirar cuidadosamente e rejeitar o sobrenadante. Em seguida, prepare uma suspensão de vesícula extracelular 2X adicionando um mililitro de diluente C ao pellet.Ressuspenda o pellet com uma pipetagem suave. Agora, prepare uma solução de corante 2X fresca. Adicione dois microlitros do corante etanólico PKH67 a um mililitro de diluente C em um tubo de microcentrífuga e misture bem.Em seguida, core a amostra misturando as duas soluções e incubando a mistura em temperatura ambiente por quatro minutos. Em seguida, pare a coloração adicionando quatro mililitros de FBS e aguarde mais um minuto. Em seguida, adicione o meio RPMI-1640 para ajustar o volume para 12 mililitros e gire a suspensão para isolar as vesículas manchadas.Remova e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda os EVs marcados com PKH67 peletizados em 12 mililitros de meio RPMI-1640. Em seguida, repita a centrifugação, mas desta vez colete as vesículas em um mililitro de PBS.Para o ensaio de captação, preparar culturas de células de mamíferos durante a noite em placas de seis poços. Na manhã seguinte, adicione cinco microgramas de vesículas marcadas com PKH67 em cada poço e continue a cultura por duas a quatro horas. Após a incubação, remova o meio e lave as células com PBS duas vezes.Em seguida, fixe as células por 15 minutos, lave-as duas vezes com PBS e core-as com DAPI antes da imagem. Esquistossomos no estágio hepático foram coletados de coelhos 28 dias após a infecção. Vesículas extracelulares foram então coletadas dos vermes esquistossomos e analisadas.Seu tamanho de partícula, conforme determinado pela análise de nanopartículas de Malvern, variou entre 100 e 400 nanômetros, com a maior parte da população perto de 220 nanômetros. A microscopia eletrônica de transmissão revelou que as vesículas extracelulares eram redondas e tinham entre 100 e 200 nanômetros de diâmetro. A análise de Western blotting indicou que as vesículas extracelulares isoladas foram reconhecidas usando anticorpos CD63, que é um marcador típico de vesículas extracelulares.A microscopia de fluorescência de vesículas extracelulares marcadas com PKH67 internalizadas pelas células do clone 1469 do NCTC mostrou que as vesículas extracelulares estavam distribuídas principalmente no citoplasma das células receptoras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar EV em meio de cultura in vitro de Schistosoma japonicum adulto.

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Research

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Aprenda a isolar vesículas extracelulares de Schistosoma japonicum em cultura in vitro com mínimo estresse. Este método eficiente permite estudar a biologia parasitária e a comunicação celular.

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