Name: Desthiobiotin-Streptavidin-afinidade mediada purificação de proteínas RNA-interagindo em células mesotelioma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Aprenda a capturar proteínas citosólicas que se ligam a sequências específicas de RNA em células de mesotelioma usando destiobiotina. Este método complementa ensaios funcionais e auxilia na caracterização de interações proteína-RNA.

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Este trabalho foi financiado pela Swiss National Science Foundation Sinergia concessão CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung e Zürich Krebsliga.

1. preparação da fração de proteína citosólica e Nuclear
<ol><li>Placa 4 x 106 ACC-MESO-4 células num balão de cultura de célula T150 cultivadas em RPMI - 1640 meio suplementado com 10% FBS, 1 x penicilina/estreptomicina (100 x) e 2 mM L-glutamina (200 mM). Quando as células alcançam uma confluência de 80-90% (~5-5.5 x 106 células), prosseguir com a extração da proteína da fração nuclear e citosólica. Nota: ACC-MESO-4 linha de celular foi obtida o RIKEN BioResource centro11.</li>
	<li>Aspire médio, lavar as células adicionando-se 15 mL de 1X PBS, incline a placa suavemente algumas vezes e aspire a PBS 1x. Adicionar 3 mL de 0,25% Trypsin-EDTA e incubar o frasco de cultura a 37 ° C por 3 min. Nota: Veja as células sob o microscópio para destacamento; se ainda ligado a torneira o frasco contra a palma de sua mão 3 vezes.</li>
	<li>Adicionar 7 mL de RPMI-1640, suplementado com 10% FBS, 1x penicilina/estreptomicina (100 x) e L-glutamina (200 mM) de 2 mM, coletar as células em um tubo de 15 mL e spin para baixo a 200 x g por 5 min.</li>
	<li>Médio, Aspire e resuspenda o pellet de células com 1,5 mL de 1X PBS e, em seguida, transferir as células para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Spin para baixo a x 500 g e a 4 ° C por 5 min. descartar o sobrenadante. Nota: A partir deste passo em diante, executar todas as etapas de centrifugação a 4 ° C e manter todos os reagentes no gelo.</li>
	<li>Ressuspender as células com gelada 1,5 mL de 1X PBS e spin-down as células a x 500 g e a 4 ° C por 3 min. descartar o sobrenadante. Nota: As quantidades necessárias de CER I, II CER e reagentes NER são 10, 0,55 e 5 volumes de centrifugado estimado embalado volume, respectivamente; o protocolo seguinte assume um volume de 20 µ l. Recomendamos preparar apenas a quantidade necessária de reagente CER eu.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l de reagente de extração citoplasmática gelada (CER eu) suplementado com 2 µ l de 1x do inibidor da protease, por exemplo, diluir 1 comprimido de inibidor de Protease (EDTA-livre) em 500 µ l de água para obter 100 ações de x. Esta quantidade de reagente CER chega a lyse 20 µ l de uma pelota de célula embalado volume.<ol>
<li>Para estimar o volume de sedimento embalado de célula, compare o tubo contendo o centrifugado com um tubo de 1,5 mL cheio com 10, 20, 50 ou 100 µ l de PBS 1x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspenda o pellet de células por vigorosamente num Vortex o tubo por 15 s e incubar o tubo no gelo por 10 min. Adicionar 11 µ l de reagente de extração citoplasmática gelada II (II CER) para o tubo, vórtice vigorosamente por 5 s e incubar 1 min no gelo.</li>
	<li>Vórtice vigorosamente durante 5 s e centrifugar o tubo a 16.000 x g e 4 ° C por 5 min. Transfira o sobrenadante no tubo limpo previamente refrigerados no gelo. O sobrenadante é a fração citoplasmática que é mais usado no experimento de RNA-pulldown.</li>
	<li>Ressuspender o restante em 100 µ l de reagente de extração nuclear gelada (NER) suplementado com 1 µ l de inibidor de proteinase (100x) e vigorosamente vórtice por 15 s. Recomendamos preparar apenas a quantidade necessária de reagente NER suplementado com inibidores de protease.</li>
	<li>Incubar a amostra no gelo por 40 min com ocasional num Vortex por 15 s (a cada 10 min).</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 16.000 x g durante 10 min. transferência do sobrenadante (isto é a fração de proteína nuclear) para um tubo limpo previamente refrigerado.</li>
	<li>Proceder imediatamente por medir a concentração de proteína usando o método bicinchoninic (BCA) (ver Tabela de materiais). Para controlar a pureza da proteína de cada fração, execute immunoblotting (Figura 1) contra a α-tubulina (detecção positivos somente na fração citosólica) e poli ADP-ribose polimerase - PARP (detecção positivos somente na fração nuclear). Para visualização de proteína, consulte a seção 4.</li>
	<li>A fim de manter a atividade de proteína e seu estado nativo, prepare 25 µ l de alíquotas dos extratos citosólico e nucleares. Snap-congelar essas alíquotas, colocando-os em nitrogênio líquido para 5 s e loja diretamente a-80 ° C.</li>
</ol>2. rotulagem do RNA com Desthiobiotin
<ol><li>Sondas de RNA sintetizado comercialmente e HPLC purificado. Resuspenda com água livre de nuclease a 10 µM. Nota: Sonda sequências estão listadas na tabela 1.</li>
	<li>Use 50 pmol de RNA por reação de RNA-pulldown. Descongelar e manter todos os reagentes no gelo exceto para PEG-30%, usado para rótulo 3' terminus de RNA oligo.</li>
	<li>Transferência de 5 µ l de 10 sondas de RNA µM, rotulado como CALB2 3' UTR (são), CALB2 3' UTR (mtARE) e independentes-RNA (IRE), em 0,5 mL microcentrifuga de parede fina tubos e incubá-los em uma máquina PCR a 85 ° C por 5 min. Coloque os tubos imediatamente no gelo. Nota: Este passo é importante, como promove o relaxamento e a acessibilidade da sonda para a rotulagem do RNA.</li>
	<li>Para uma única reação de 30 µ l, adicionar ao tubo de RNA, contendo a mistura de 10 µ l a seguir: 3 µ l de água livre de nuclease, 3 µ l de RNA Ligase Buffer de reação, 1 µ l de RNase inibidor de 10x (40 U / µ l), 1 µ l de Desthiobiotinylated citidina bisfosfato (1 mM) e 2 µ l de RNA T4 ligase do (20 U / µ l). Nota: Para preparar A mistura de mestre 3 amostras em excesso (3.2), misturar 9,6 µ l de nuclease água livre, 9,6 µ l de RNA Ligase Buffer de reação, 3,2 µ l de RNase inibidor de 10x (40 U / µ l), 3,2 µ l de Desthiobiotinylated citidina bisfosfato (1 mM) e 6.4 µ l de RNA T4 ligase do (20 U / µ l).</li>
	<li>Adicione cuidadosamente 15 µ l de PEG-30% para a reação. Use outra dica de misturar a reação. Incubar a reação durante a noite a 16 ° C.</li>
	<li>No dia seguinte, prepare-se o seguinte: 5 M NaCl (fresco/nuclease-free), clorofórmio: álcool isoamílico na proporção 24:1 (por exemplo, por reação - 96 µ l clorofórmio e 4 µ l de álcool isoamílico), gelada 100% de etanol e gelada 70% de etanol.</li>
	<li>Adicione 70 µ l de água livre de nuclease aos tubos de reação de RNA-rotulagem. Adicione 100 µ l de clorofórmio: isoamílico álcool e vórtice brevemente. Desativação da rotação a 13.000 x g por 3 min. retire apenas a fase superior e transferência para um novo tubo isento de nuclease 1,5 mL; Evite tocar a fase inferior.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de NaCl 5m, 1 µ l de glicogênio e 300 µ l de etanol gelado a 100%. Coloca o tubo a-20 ° C durante 2 h. Nota: Neste passo, o experimento pode ser continuado no dia seguinte.</li>
	<li>Cuidadosamente, centrifugar 13.000 x g e 4 ° C por 15 min. desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Adicione 300 µ l de etanol a 70% gelado e centrifugar novamente a 13.000 x g e 4 ° C por 5 min.</li>
	<li>Descartar o sobrenadante completamente e deixe secar naturalmente a pelota (15 min). Resuspenda o pellet em 20 µ l de água livre de nuclease. Nota: Proceda com RNA-pulldown no mesmo dia.</li>
	<li>Incubar o RNA a 90 ° C por 2 min e colocar no gelo. Coloque o RNA rotulados no gelo durante a etapa seguinte de pre-lavagem dos grânulos magnético estreptavidina. Nota: Um tempo de incubação pode danificar a sonda de RNA.</li>
</ol>3. RNA-proteína Pulldown
<ol><li>
Pré-lavagem grânulos streptavidin-magnético e incubação com desthiobiotin-RNA
	<ol>
<li>Use 50 µ l de estreptavidina grânulos magnético por 50 pmol de RNA. No entanto, isto deve ser otimizado dependendo do experimento.</li>
		<li>Vórtice com grânulos streptavidin-magnético para 15 s e rapidamente remover 200 µ l (mestre mistura; suficiente para reações de 3 + 1) em um limpa 1,5 mL tubo cofre-bloqueio usando o tubo de corte pontas de pipetas. Coloque o tubo num suporte magnético para que os grânulos recolher ao lado do tubo e esperem 1 min. Retire o líquido de ressuspensão.</li>
		<li>Lave os grânulos, remover o tubo do suporte magnético, adicione 400 µ l de NaOH 0,1 M, 0,05 M NaCl solução e suavemente pipeta subindo e descendo várias vezes. Coloque o tubo de volta a depor magnético. Espere 1 minuto e recolher o sobrenadante. Repita este passo novamente.</li>
		<li>Lave os grânulos com 200 µ l de 100 mM de NaCl. Remova o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de 20 mM Tris (pH 7,5), resuspenda grânulos pipetando, colocar o tubo no stand magnético, esperar 1 min e remover o sobrenadante. Repita a etapa.</li>
		<li>Retire o tubo do suporte magnético, adicionar 200 µ l de buffer de captura do RNA de 1x e ressuspender streptavidin grânulos magnético vortexing brevemente. Remover 50 µ l de grânulos magnético streptavidin e adicionar a cada tubo rotulado-RNA usando uma ponta de pipeta de corte. Incube os tubos por 30 min à temperatura ambiente em um rolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ligação de proteínas de RNA
	<ol>
<li>Coloque os tubos em um carrinho magnético, esperar 1 min e retirar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicionar 50 µ l de 20 mM Tris (pH 7,5) para as contas e ressuspender pipetando. Coloque os tubos em um carrinho magnético, esperar 1 min e retirar o sobrenadante. Repita este passo.</li>
		<li>Adicionar 100 µ l de tampão de ligação proteína-RNA 1x aos talões e ressuspender pipetando.</li>
		<li>Entretanto, prepare a seguinte mistura: 10 µ l de 10x buffer de ligação proteína-RNA, 30 µ l de glicerol a 50%, 50 µ g de proteínas citoplasmáticas e livre de nuclease até 100 µ l de água. Nota: Preparar mistura mestre B para 3 amostras em excesso (3.3) da seguinte forma: 33 µ l de 10x buffer de ligação proteína-RNA, 99 µ l de glicerol a 50%, 165 µ g de proteínas citoplasmáticas e água livre de nuclease até 330 µ l. Mantenha o tubo de mistura mestre B no gelo.</li>
		<li>Coloque os tubos no suporte magnético, espere 1 minuto e recolher o sobrenadante. Adicionar 100 µ l do mix master B, resuspenda suavemente pipetando acima e para baixo e evitar a criação de bolhas. Incube os tubos de reação para 60 min a 4 ° C em um rolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavagem e eluição
	<ol>
<li>Coloque os tubos em um carrinho magnético, recolher o sobrenadante (que é o fluxo através de - FT) e transferir para um tubo novo. Nota: Mantenha esta FT no gelo para análise posterior.</li>
		<li>Pipetar 100 µ l de 1x tampão de lavagem sobre os grânulos, Ressuspender delicadamente, colocar de volta no carrinho magnético, esperar 1 min e descartar o sobrenadante. Repita essa etapa 2 vezes.</li>
		<li>Adicionar 40 µ l de tampão de eluição para as esferas magnéticas, misturar pipetando para cima e para baixo e incubar a 37 ° C num agitador de tubo (950 rpm) por 30 min.</li>
		<li>Coloque os tubos em um carrinho magnético, esperar 1 min e coletar amostra de eluted (que é eluído - E). Coloque no gelo e usar para análise a jusante. Nota: Neste passo, cada sonda RNA testada consiste em uma passagem (FT) e amostra de eluato (E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. análise do borrão ocidental e eletroforese em poliacrilamida
Nota: Ver tabela 2 receitas para os buffers usados nesta seção. Realizar um Western blot de acordo com o método de Laemmli12.
<ol><li>Handcast 12% geles de SDS-PAGE (10-poços, espaçador de 1,5 mm, 66 µ l). Preparar uma mistura de gel de execução: 4 mL de solução 30% do acrilamido-bisacrylamide, 2,4 mL de Tris inferior do buffer, 3,2 mL de dH2O, 9,6 µ l de TEMED, 96 µ l da solução de persulfato de amónio de 10% (APS). Preparar a mistura de gel de empilhamento: 3,25 mL de dH2O, 0,5 mL de acrilamida 30% - solução bisacrylamide, 1,3 mL de tampão Tris superior, 10 µ l de TEMED, 20 µ l de 10% APS.</li>
	<li>Adicione 16,6 µ l de tampão de x Laemmli 6 (por exemplo, 14 mL de pH Tris/HCl/SDS 6,8 (tampão Tris superior), 2 g de SDS, 1,86 g de TDT, 6 mL de glicerol e 0,012% bromofenol; armazenado a-20 ° C) para a amostra FT e 6.6 µ l de buffer de x Laemmli 6 em amostra E. Incubar as amostras durante 5 min à 95 ° C.</li>
	<li>Carregar as amostras (20 µ l de FT e toda a eluir ~ 40 µ l) e executá-los por 30 min a 60 V, continuando com 20 V durante a noite.</li>
	<li>Usando um sistema eletroblotting semi-seco, transferência de proteínas para uma membrana PVDF para 80 min em 15 V. Nota: A membrana PVDF deve ser ativada antes de executar a transferência de proteína. Incube a membrana em metanol 100% por 1 min, seguido de uma incubação de 2 min em água ultrapura.</li>
	<li>Após a transferência da proteína, incube o gel de SDS-PAGE com Coomassie solução para 3 h, seguido por três etapas de lavagem com água ultrapura, a cada 30 min.</li>
	<li>No final da transferência de proteína, deixe-a membrana PVDF secar por 1 h. reativar a membrana como indicado no ponto 4.5. Bloquear a membrana 1 h com 5% BSA em 1 x TTBS.</li>
	<li>Incubar a membrana com o primeiro anticorpo: HuR ou mesothelin, ambos diluído 1: 1000 em 5% BSA em 1 x TTBS por 4 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar a membrana três vezes por 7 min em 1 x TTBS e incubar com peroxidase de coelho anti-rato rábano (HRP)-anticorpo secundário conjugado diluído 1:10,000 em 5% BSA, 1 x TTBS.</li>
	<li>Visualize as proteínas utilizando quimioluminescência aprimorada e um sistema de imagem digital.</li>
</ol>

<ol><li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).</li>
<li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+3%27+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).</li>
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<li>Kresoja-Rakic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+controls+calretinin+expression+in+malignant+pleural+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma.</a> Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).</li>
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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

3' UTRs pertencem ao não-codificantes do genoma3, e todos os RNAs não codificantes podem interagir com as proteínas a fim de exercer sua função7. Quando o genoma de mamíferos foi encontrado para ser comodamente transcrito e produzido uma parcela significativa de tempo não-codificante RNAs16, emergentes evidências demonstraram que estes RNAs long-não-codificante função na regulação da expressão gênica como eles interagem com cromatina-remodelação comp...

Expressão gênica e o nível final do produto do gene podem ser fortemente regulamentados por afetar a estabilidade do mRNA e o mRNA tradução taxa1. Estes mecanismos de regulação pós-transcricional são exercidos através de interações de não-codificantes do RNA e/ou ligação de RNA proteínas (RBPs) com mRNA alvo. Geralmente é a região untranslated 3' do mRNA (3' UTR - pertencentes à porção não-codificantes do genoma2) que contém específica cis-elementos reguladores (CRE), que são reconhecidos pelo trans-agindo fatores como miRNA ou RBPs 3. o mais bem estudadas cis-elemento dentro do 3' UTR, é motivo de adenina-rico elemento (são), que é reconhecido por proteínas específicas de AU-ligação (AUBP) e, por sua vez, induz qualquer degradação do mRNA/deadenylation (decaimento são-mediada) ou de estabilização do mRNA4.
O tamanho da 3' UTR de desnutridos mRNA (CALB2) é 573 bp longa e contém um pentâmero AUUUA putativo, como previsto pelos AREsite2, uma ferramenta de bioinformatic5. Consistente com a presença de um putativo são motivo, o ensaio de vetor-repórter pmirGLO demonstrado um papel de estabilização deste elemento dentro do mRNA CALB26. Finalmente, o em vitro RNA-pulldown foi usado para identificar a AUBP que estabiliza desnutridos mRNA através do motivo de são.
Desde que todos os RNAs não codificantes interagirem com proteínas7, o em vitro RNA-pulldown é um ensaio de primeira escolha para a identificação de RNA-interactianos e boa maneira para ajudar a decifrar os mecanismos moleculares. Neste método de RNA-pulldown, sondas de RNA sintetizadas comercialmente, que foram rotuladas com uma forma modificada de biotina (desthiobiotin) no terminal 3' da strand, RNA, foram usadas. O RNA-desthiobiotin está imobilizado através da interação com estreptavidina em grânulos magnéticos, que são usados para puxar para baixo de proteínas que interagem especificamente com o limite-RNA de interesse. Proteínas não-desnaturado e ativas da fracção citosólica de células mesotelioma são utilizadas como fonte de proteínas. Essas proteínas RNA-limite são eluídas dos grânulos magnéticos, executado através de um gel de SDS-PAGE 12%, transferido para uma membrana e sondado com anticorpos diferentes.
O procedimento de purificação padrão estreptavidina-biotina afinidade, dura desnaturação requeridas para romper o vínculo forte irreversível biotina-streptavidin para Eluir o limite proteínas8, que pode levar a dissociação de complexos de proteínas. Ao contrário de biotina, desthiobiotin reversível vincula streptavidin e competitivos é deslocada com uma solução tamponada de biotina, permitindo a eluição suave de proteínas e evitando o isolamento de naturalmente biotinilado moléculas9, sugerindo que a técnica é ideal para isolar os complexos da proteína nativa sob condições nativas.
In vitro as condições de vinculação e o rigor, que são determinados pela concentração de sal, agentes redutores e porcentagem de detergente, devem ser próximo aos presentes no contexto celular a fim de identificar interações de verdade na vivo . As condições de ligação implementadas neste documento foram anteriormente demonstradas conforme apropriado para a identificação da HuR como uma proteína ligadora AU10. Esta abordagem poderia poupar tempo, desde que a otimização das condições de vinculação adequada pode ser demorada e desafiador. Além disso, esse método poderia ser usado como um protocolo de partida para qualquer experiência de RNA-pulldown e pode ser otimizado progressivamente alterando a concentração de sais e detergentes, mudando a porcentagem de glicerol, e adicionando outros sais. Além disso, demonstrar que mesmo uma curta 25-nucleotídeo do RNA-sonda abrigando um pentâmero são-motivo poderia ser usado para demonstrar a interação com um específico AUBP.

<table><tbody><tr><td>NE-PER Kit de extração nuclear e citoplasmática</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos Inibidores de Protease Pierce, sem EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20164</td><td>Inclui contas magnéticas e, portanto, o kit precisa ser armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Perfurar RNA 3' Kit de Destiobiotinilação Fim</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20163</td><td>O kit faz parte do "Kit Pull-Down de RNA-proteína magnética Pierce", e precisa ser armazenado a -20 &graus; C ao contrário do kit pull-down (4 &deg; C).</td></tr><tr><td>Suporte magnético DynaMag-2,&nbsp;</td><td></td> Anticorpo monoclonal Anti-HuR (MOUSE) Anti-HuR da <td>Thermo Fisher</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Scientific-O</td> <td>anticorpo está incluído no Kit Pull-Down de RNA-proteína magnética Pierce&nbsp; - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secundário anti-rato coelho 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - &alpha; - tubulina (MOUSE) anticorpo monoclonal</td><td>Santa Cruz</td><td>8035</td><td>1:1000 em 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secundário anti-camundongo coelho 1:10.000 em 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - PARP (COELHO) Anticorpo policlonal</td><td>Sinalização Celular</td><td>9542</td><td>1:1000 em 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secundário anti-coelho de cabra 1:10.000 em 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - Mesotelina (MOUSE) Anticorpo Monoclonal&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>200-301-A87</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho para cabras</td><td>Sinalização Celular</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-rato para coelhos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI - 1640 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Soro Bovino Filtrado</td><td>Pan Biotech&nbsp;</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina - estreptomicina (100x)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solução de L-Glutamina (200 mM)</td> <td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Gibco da Life technologies&nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1653301</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean System Placas de Vidro&nbsp;</td><td>Placas</td> Espaçadoras <td>Bio-Rad 1653308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN com espaçador integrado de 1,5 mm</td> Pente <td>Mini-PROTEAN 1653312</td><td></td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>, 10 poços, 1,5 mm, 66 &micro; L</td><td>Bio-Rad</td><td>1653365</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules</td><td>Bio-Rad</td><td>1658050</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Solução de Descontaminação RNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese gel 30 - solução estoque aquosa de 30% de acrilamida e bisacrilamida na proporção de 37.5:1</td><td>Roth</td><td>3029</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS&nbsp;</td>Membrana de transferência <td>PanReac AppliChem</td><td>A3942</td><td></td></tr><tr><td>PVDF&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEF1002</td><td>Precisa ser ativado incubando em metanol puro por 1 min seguido de lavagem em água por 2 min&nbsp;</td></tr><tr><td>Célula de transferência semi-seca Trans-Blot SD</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Clareza Western ECL Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>FusionFX&nbsp; Imager Digital</td><td>Vilber-RNA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>oligo synthesis</td><td>Mycrosynth AG,</td> <td>Suíça-a</td> <td>escala de síntese - 0.04 &micro; mol - Albumina</td></tr><tr><td>de soro bovino</td> purificada por HPLC <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl) 6 M</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182883.1211</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td>Alíquotas 50% estéreis para serem armazenadas a -20&deg; C</td></tr><tr><td>Pierce Streptavidin contas magnéticas&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88817</td><td>Por favor, note que estas contas magnéticas têm um diâmetro médio de 1 &micro; m (intervalo de 0,5 - 1,5 &micro; m). Além disso, Dynabeads-M280 Streptavidin, que são grânulos de tamanho homogêneo 2,8 &micro; m, também são usados no pulldown de RNA, mas esteja ciente de que isso pode afetar o processo de purificação.</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie G-250</td><td>Applichem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>368458</td><td></td></tr><tr><td>ácido ortofosfórico&nbsp;</td><td>Aplicativo</td><td>A0637</td><td></td></tr></tbody></table>

desthiobiotin-streptavidin-afinidade mediada purificação de proteínas rna-interagindo em células mesotelioma

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

O em vitro RNA-pulldown é ainda amplamente usado nos primeiros passos de protocolos que visam identificar RNA-proteínas que reconhecem estruturas de RNA e motivos específicos. Neste protocolo de RNA-pulldown, sondas de RNA sintetizadas comercialmente são rotuladas com uma forma modificada de biotina, desthiobiotin, no terminal 3' da strand, RNA, que se liga reversivelmente para streptavidin e permite assim a eluição das proteínas sob mais fisiológica condições. O RNA-desthiobiotin está imobilizado através da interação com estreptavidina em grânulos magnéticos, que são usados para puxar para baixo de proteínas que interagem especificamente com o RNA de interesse. Proteínas não-desnaturado e ativas da fracção citosólica de células mesotelioma são utilizadas como fonte de proteínas. O método descrito aqui pode ser aplicado para detectar a interação entre proteínas de ligação de RNA conhecidas e uma 25-nucleotide (nt) longo RNA sonda contendo uma sequência de interesse. Isso é útil para completar a caracterização funcional de estabilização ou desestabilizar os elementos presentes em moléculas de RNA alcançadas usando um ensaio de vetor de repórter.

Neste experimento, utilizou-se um fragmento de tempo 25-nt de desnutridos 3' UTR abrigando são motivo (CALB2) 3' UTR (são) 25-nt para testar se liga-se especificamente à proteína antígeno humano-R (HuR), um conhecido estabilizador de mRNA. Para testar a especificidade do elemento são, um RNA 25-nt sonda CALB2 3' UTR (mtARE) contendo uma mutação são-motivo, que anteriormente foi mostrada para abolir o efeito de estabilização do motivo são, foi usado6. O RNA terceiro...

Desthiobiotin rotulagem de um sintético 25-nucleotide oligo de RNA, que contém um motivo de adenina-rico elemento (são), permite a ligação específica da proteína de ligação são citosólica.

Desthiobiotin-Streptavidin-afinidade mediada purificação de proteínas RNA-interagindo em células mesotelioma

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

O objetivo geral deste procedimento é capturar proteínas citosólicas que se ligam a uma sequência específica localizada na molécula de RNA nas células do mesotelioma. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia do RNA, como se uma proteína de ligação ao RNA prevista pode se ligar à adenosina ou à sequência rica em uridina em um transcrito. A principal vantagem dessa técnica é que ela complementa a caracterização funcional de elementos estabilizadores ou desestabilizadores avaliados pelo ensaio repórter.Demonstrando essa técnica estará a Dra. Jelena Kresoja-Rakic, pós-doutoranda do meu laboratório. Para iniciar o protocolo, obtenha células ACC-MESO-4 previamente preparadas com uma confluência de 80 a 90%. Aspire o meio, lave as células com 15 mililitros de solução salina tamponada com fosfato 1X, ou PBS, e aspire o PBS.Em seguida, adicione três mililitros de 0,25% de tripsina-EDTA e incube o frasco de cultura a 37 graus Celsius por três minutos. Adicione sete mililitros de meio RPMI-1640 suplementado, colete as células em um tubo de 15 mililitros e gire-as a 200 vezes g por cinco minutos. Em seguida, aspire o meio e ressuspenda o pellet celular com 1,5 mililitros de PBS 1X.Em seguida, transfira as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Gire as células novamente a 500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular com 1,5 mililitros de PBS 1X gelado e gire as células a 500 vezes g e quatro graus Celsius por três minutos.Descarte o sobrenadante e estime o volume embalado do pellet celular comparando o tubo contendo o pellet celular com um tubo de 1,5 mililitro com 10, 20, 50 e 100 microlitros de PBS 1X. Adicione 200 microlitros de reagente de extração citoplasmática gelada, ou CER I, suplementado com dois microlitros de inibidor de proteinase 1X. Vortex vigorosamente o pellet por 15 segundos e incube o tubo no gelo por 10 minutos.Adicione 11 microlitros de reagente de extração citoplasmática II gelada, ou CER II, agite vigorosamente por cinco segundos e incube o tubo por um minuto no gelo. Vortex a amostra vigorosamente por cinco segundos e centrifugue o tubo a 16.000 vezes g por cinco minutos. Transfira o sobrenadante para o tubo limpo e pré-resfriado sobre gelo.Ressuspenda o pellet restante em 100 microlitros de reagente de extração nuclear gelada, ou NER, suplementado com um microlitro de inibidor de proteinase e vore vigorosamente por 15 segundos. Incube a amostra no gelo por 40 minutos e vortex a cada 10 minutos por 15 segundos. Centrifugar o tubo a 16 000 vezes g durante 10 minutos.Transfira o sobrenadante, que é a fração de proteína nuclear, para um tubo limpo e pré-resfriado. Meça imediatamente a concentração de proteína usando o método bicinchonínico. Em seguida, prepare 25 microlitros de alíquotas de extratos citosólicos e nucleares.Congele essas alíquotas colocando-as em nitrogênio líquido por cinco segundos e armazene-as diretamente a 80 graus Celsius negativos. Transfira cinco microlitros de sondas de RNA de 10 micromolares para tubos de microcentrífuga de parede fina de 0,5 mililitro e incube-os em uma máquina de PCR a 85 graus Celsius por cinco minutos. Coloque os tubos imediatamente no gelo.Para uma única reação de 30 microlitros, adicione 10 microlitros de mistura previamente preparada ao tubo contendo RNA. Adicione cuidadosamente 15 microlitros de PEG 30% à reação e use uma ponta nova para misturar a reação. Incube a reação durante a noite a 16 graus Celsius.No dia seguinte, prepare os reagentes. Adicione 70 microlitros de água livre de nuclease aos tubos de reação de marcação de RNA. Adicione 100 microlitros de álcool clorofórmio-isoamílico e vortex brevemente e gire a amostra a 13.000 vezes g por três minutos.Remova cuidadosamente apenas a fase superior. Evite tocar na fase inferior. Transfira-o para um novo tubo de 1,5 mililitro sem nuclease.Adicione 10 microlitros de cloreto de sódio de cinco molares, um microlitro de glicogênio e 300 microlitros de etanol 100% gelado. Coloque o tubo a menos 20 graus Celsius por duas horas. Após duas horas, centrifugue a 13.000 vezes g e quatro graus Celsius por 15 minutos.Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Adicione 300 microlitros de etanol gelado a 70% e centrifugue novamente a 13.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o sobrenadante completamente e seque o pellet ao ar por 15 minutos.Ressuspenda o pellet em 20 microlitros de água livre de nuclease. Incube o RNA a 90 graus Celsius por dois minutos e coloque-o no gelo. Coloque o RNA marcado no gelo durante a etapa seguinte de pré-lavagem das esferas magnéticas de estreptavidina.Pré-lave 50 microlitros de esferas magnéticas de estreptavidina por 50 picomoles de RNA. Vortex o tubo com esferas magnéticas de estreptavidina por 15 segundos. Após o vórtice rapidamente, remova 200 microlitros em um tubo Safe-Lock limpo de 1,5 mililitro usando pontas de pipeta cortadas.Em seguida, coloque o tubo em um suporte magnético para que as contas se acumulem na lateral do tubo e aguarde um minuto. Remova o líquido de ressuspensão. Para lavar as contas, remova o tubo do suporte magnético, adicione 400 microlitros de hidróxido de sódio 0,1 molar, solução de cloreto de sódio 0,05 molar e pipete suavemente para cima e para baixo várias vezes.Coloque o tubo de volta no suporte magnético e aguarde um minuto. Em seguida, colete o sobrenadante. Lave as esferas com 200 microlitros de cloreto de sódio a 100 milimolares e remova o sobrenadante.Adicione 200 microlitros de tris de 20 milimolares, ressuspenda as contas pipetando e coloque o tubo no suporte magnético. Após um minuto, remova o sobrenadante. Em seguida, remova o tubo do suporte magnético, adicione 200 microlitros de tampão de captura de RNA 1X e ressuspenda as esferas magnéticas de estreptavidina por um breve vórtice.Remova 50 microlitros de esferas magnéticas de estreptavidina e adicione-as a cada tubo de RNA rotulado usando uma ponta de pipeta cortada. Incube os tubos por 30 minutos em temperatura ambiente em um rolo. Depois que o tubo estiver no suporte magnético por um minuto, remova o sobrenadante.Adicione 50 microlitros de tris de 20 milimolares às contas e ressuspenda-as. Em seguida, coloque os tubos no suporte magnético. Após um minuto, remova o sobrenadante.Adicione 100 microlitros de tampão de ligação de RNA de proteína 1X às esferas e ressuspenda-as. Em seguida, coloque os tubos de volta no suporte magnético. Depois que os tubos estiverem no suporte por um minuto, colete o sobrenadante.Adicione 100 microlitros de master mix B, ressuspenda pipetando suavemente para cima e para baixo e evite criar bolhas. Incube os tubos de reação por 60 minutos a quatro graus Celsius em um rolo. Passe para as etapas de lavagem e eluição.Coloque os tubos em um suporte magnético, colete o fluxo e transfira-o para um novo tubo. Pipete 100 microlitros de tampão de lavagem 1X nas contas, ressuspenda suavemente, coloque-as de volta no suporte, aguarde um minuto e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa duas vezes.Adicione 40 microlitros de tampão de eluição às esferas magnéticas, misture pipetando para cima e para baixo e incube em um agitador de tubo. Coloque os tubos em um suporte magnético, aguarde um minuto e colete a amostra de eluído. Coloque no gelo e use para análise a jusante.Para demonstrar a pureza das frações nuclear/citosólica, as proteínas foram analisadas por Western blot, que mostrou que a alfa-tubulina foi detectada apenas na fração citosólica e a proteína PARP foi detectada apenas na fração nuclear. O eluato da sonda CALB2 UTR ARE de três primos demonstrou ligação de R humano e estava ausente no eluato da sonda mutante e da sonda de RNA não relacionada, que se liga à proteína responsiva ao ferro. Para demonstrar ainda mais a especificidade entre o CALB three-prime UTR e o R humano, a membrana foi sondada com anticorpo anti-mesotelina, e todas as três amostras de eluato não mostraram presença de mesotelina, indicando que o motivo ARE estabilizador dentro do CALB2 three-prime UTR pode se ligar especificamente à proteína R humana.A coloração de Coomassie do gel mostra que quantidades iguais de proteínas foram usadas para incubar com as três sondas de RNA diferentes. Após este procedimento, método adicional centrado em proteínas, como a imunoprecipitação de uma determinada proteína, pode ser realizado para abordar questões adicionais, como qual sequência se liga a ela. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do RNA explorarem possíveis parceiros de interação de um RNA específico.

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um grande impedimento para análises bioquímicas dos ribossomos contendo nascente peptidil-tRNAs foi a presença de ribossomos outros nas mesmas amostras, os ribossomos não estão envolvidos na tradução da seqüência de mRNA específico que está sendo analisado. Nós desenvolvemos uma metodologia simples para purificar, exclusivamente, os ribossomos que contém a nascente peptidil-tRNA de interesse.

Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo peptidil-tRNAs para análises funcionais e estruturais

Este vídeo demonstra um ensaio de extração de RNA in vitro para identificar proteínas de ligação a RNA (RBPs), que interagem com as sequências de elementos ricos em adenilato-uridilato (ARE) no mRNA. Os RBPs alvo de um lisado celular são misturados com uma sonda de RNA para formar complexos de RNA-proteína. Os complexos são isolados por purificação de afinidade utilizando a afinidade do marcador de destiobietina da sonda de RNA a um grânulo magnético marcado com estreptavidina.

Ensaio pull-down de proteína de RNA para isolar proteínas de ligação a RNA por meio de extração de afinidade

as interações RNA-proteína estão no centro de muitos processos celulares. Aqui, descrevemos um método in vivo para isolar RNA específico e identificar novas proteínas associadas a ele. Isso pode lançar uma nova luz sobre como os RNAs são regulados na célula.

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

Utilizou-se uma metodologia baseada em gradiente de centrifugação por densidade modificada para isolar células epiteliais do tecido intestinal de Rhipicephalus microplus . As proteínas ligadas à superfície foram biotiniladas e purificadas através de esferas magnéticas de estreptavidina para utilização em aplicações a jusante.

Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células intestinais epiteliais

Este relatório descreve um método rápido e confiável para validar alvos de mRNA de miRNAs celulares. O método usa biotinilado sintético baseado no LNA de ácido nucleico trancado miRNA imita para capturar o alvo do mRNA. Posteriormente, grânulos magnéticos streptavidin-revestidas são empregados para pulldown o alvo mRNA para quantificação por qPCR reação em cadeia da polimerase.

Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular

Um procedimento de isolamento de RNA em tandem (viagem) para recuperação de complexos mRNA-proteínas endogenamente formado é descrito. Especificamente, complexos de RNA-proteína são quitosana na vivo, polyadenylated RNAs são isolados de extratos com grânulos de oligo (descolamento) e particulares mRNAs são capturados com modificados oligonucleotides antisentidos do RNA. Proteínas vinculadas a mRNAs são detectadas pela análise de immunoblot.

Um procedimento de isolamento de RNA em Tandem do Oligonucleotide-baseado para recuperar complexos mRNA-proteínas eucariotas

Complexos de RNA/proteínas purificados usando estratégia botin-streptavidin são eluídos a solução sob condições de desnaturação de forma inadequada para mais de purificação e análise funcional. Aqui, descrevemos uma modificação desta estratégia que utiliza um foto-cleavable vinculador em RNA e um passo de UV-eluição suave, produzindo complexos de RNA/proteína nativos e totalmente funcionais.

Purificação de etapa única de complexos macromoleculares usando RNA ligado à biotina e um foto-cleavable vinculador

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Analisando interações DNA-proteína com interferometria de biocamada baseada em estreptavidina

Aprenda a capturar proteínas citosólicas que se ligam a sequências específicas de RNA em células de mesotelioma usando destiobiotina. Este método complementa ensaios funcionais e auxilia na caracterização de interações proteína-RNA.

Desthiobiotin-Streptavidin-afinidade mediada purificação de proteínas RNA-interagindo em células mesotelioma

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