Name: Análise de Toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mRNAs mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Aprenda a técnica de toeprinting para analisar a formação de complexos de iniciação de tradução em mRNAs de mamíferos. Este método permite estudar mecanismos de tradução dependentes de cap e mediados por IRES.

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Este trabalho foi financiado por um ciências naturais e engenharia Conselho de Canadá-Discovery bolsa de investigação (05463-RGPIN-2017), a Fundação de Canadá para inovação-John R. Evans líderes fundo (35017), o programa inova do Campus Alberta e Ministério de Alberta Comércio e desenvolvimento econômico.

Nota: O RNA é altamente suscetível à degradação por ribonucleases (RNases). Tome precauções padrão para manter o RNA intacto. Luvas mudam com frequência. Utilize pontas de pipetas filtrada, plasticware nuclease-free e livre de nuclease produtos químicos em todas as etapas do protocolo. Utilização livre de nuclease ou pyrocarbonate de dietilo (DEPC)-tratamento de água para todas as soluções.
1. preparação de soluções
<ol><li>Preparar o tampão de Toeprinting: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), KOAc, 2.5 mM Mg(OAc)2, 5% (p/v) de sacarose, espermidina ditiotreitol (DTT) e 0,5 mM de 2 mM a 100 mM.<ol>
<li>Loja TDT e espermidina em alíquotas de uso único, a-20 ° C para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. Nota: TDT e espermidina devem ser adicionados para o buffer de toeprinting, imediatamente antes do uso. Uma solução sem TDT e espermidina pode ser armazenada a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare alíquotas de 85 mM 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) e 91 mM trifosfato de adenosina (ATP). Armazenar as alíquotas a-20 ° C.</li>
	<li>Preparar 450 mL de mistura de gel de 6% poliacrilamida - 7m ureia: 67,5 mL de acrylamide:bis de 40%-acrilamida (19:1), 189 g de ureia, 112,5 mL de 5 x TBE (Tris/borato/thylenediaminetetraacetic ácido (EDTA)) e 120 mL de água. Dissolva a ureia por aquecimento em banho maria a 37 ° C ou em um prato quente com agitação. Filtrar a solução (por exemplo., 0,2 μm filtro de vácuo de nitrocelulose). Nota: A solução pode ser armazenada a 4 ° C, durante pelo menos um mês. Cuidado: Acrilamida monomérica é uma neurotoxina que pode ser absorvida através da pele. Tome muito cuidado para evitar o contacto com a pele (i. e., um jaleco, luvas e proteção do olho). Poliacrilamida também deve ser manipulada com cuidado, como polimerização não pode proceder à realização de 100%.</li>
	<li>Preparar o formamide tintura de carregamento: 95% formamida, 18 mM EDTA, 0.025% (p/v) Dodecil sulfato de sódio (SDS), 0.025% (p/v) de azul de bromofenol, xileno cianol de 0.025% (p/v). Loja a-20 ° C.</li>
	<li>Dissolva 1 nmol de primer (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' fim-etiquetadas com 800 IRDye) em 100 μL de água para uma concentração de trabalho de 10 pmol/μL. Armazenar a-20 ° C em alíquotas de uso único (cerca de 10 µ l), protegido da luz.</li>
</ol>2. preparação do mRNA
<ol><li>Modelos de DNA para a síntese de mRNA pela reação em cadeia do polymerase (PCR) de modelos apropriados de amplificar (i. e., DNA genômico ou Plasmídeo, conforme o caso). Usar uma alta fidelidade DNA polimerase de acordo com as instruções do fabricante, com as seguintes condições de reação (35 ciclos): derreter, 98 ° C, 10 s; recoze, 53 ° C, 20 s; estender, 72 ° C, 30 s. Nota: O primer para a frente (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) incorpora a sequência do promotor T7 para permitir a transcrição do RNA; o primer reverso (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) inclui 51 resíduos de timina para fornecer uma cauda poli-A para o RNA transcrito. Observe que o RNA também pode ser em vitro transcrito do ADN do plasmídeo.</li>
	<li>Uso um kit apropriado transcrição in vitro transcrever IRES contendo RNA ou ARN tampado partir do modelo de DNA. Siga as instruções do fabricante. Prepare a amostra de RNA em volumes de reação padrão 20 μL. Tratar o RNA recém sintetizado com 2 unidades de DNase RNase-livre por 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Diluir o RNA DNase-tratada para 110 µ l com água livre de nuclease adicionar ácido fenol µ l 110, vórtice 5 s e centrífuga para 3 min a 20.000 x g à temperatura ambiente. Remover a 100 µ l da fase aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicionar 10 µ l de acetato de sódio 3M e vórtice 2 s. Add, 3 volumes de 100% de etanol, vórtice 5 s e precipitar o RNA a-20 ° C durante a noite.</li>
	<li>Centrifugar a > 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Lave o pellet com 500 µ l de etanol a 70% (v/v) gelada e repita a centrifugação. Aspirar o máximo do líquido sobrenadante possível e deixe secar naturalmente a pelota para 5-10 min. tenha cuidado para não deslocar o pellet.</li>
	<li>Ressuspender o RNA no volume adequado de água livre de nuclease para produzir uma trabalho de concentração de 0.5 μg/μL. Isto pode ser armazenado a-80 ° C ou usado imediatamente.</li>
</ol>3. Toeprinting reação
<ol><li>Mix 15 μL de coelho lisado Reticulócito (RRL, nuclease não-tratados), 1 μL (40 unidades) de inibidor de RNase, 1 µ l de 91 mM ATP (1,82 mM final) e 1 μL de 85mm GMP-PNP (final de 1,7 mM) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Incube a 30 ° C por 5 min. Nota: O RRL deve ser aliquotada para uma única utilização evitar o congelamento-descongelamento repetitiva. Um controle crítico é uma reação que falta RRL, a fim de elucidar as pausas naturais da transcrição reversa devido a estrutura secundária do RNA. Adicione toeprinting reserva para substituir RRL para este controle.</li>
	<li>Adicionar 0,5 µ g (1 µ l) de RNA e incubar a 30 ° C por 5 min.</li>
	<li>Adicione 22 µ l de tampão de Toeprinting e incubar a 30 ° C por 3 min.</li>
	<li>Adicionar 0,5 µ l (5 pmol) de primer IRDye-etiquetadas e incubar no gelo por 10 min.</li>
	<li>Adicionar 2 µ l de dNTPs 25 mM (concentração final: 1 mM cada), 2 µ l de Mg(OAc)2a 100 mM, 1 µ l de aviária Myeloblastosis vírus Transcriptase reversa (AMV-RT) e 3,5 µ l de tampão de Toeprinting. O volume final é 50 μL.</li>
	<li>Incube a reação a 30 ° C, durante 45 min.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l de água livre de nuclease e extrair imediatamente com 250 µ l de 25:24:1 fenol: clorofórmio: isoamílico álcool (pH aproximadamente 8.0). Vórtice 5 s e centrifugar 20.000 x g por 3 min à temperatura ambiente. Retirar a fase aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicionar 3 volumes de 100% de etanol, vórtice 5 s e precipitar a-20 ° C durante a noite.</li>
	<li>Centrifugar a > 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Lave o sedimento de DNA com 500 µ l de etanol a 70% (v/v) gelada. Centrifugar a > 20.000 x g durante 15 minutos a 4 ° C. Aspirado de sobrenadante, tanto quanto possível e ar seco que a pelota de 5-10 min. tenha cuidado para não deslocar o pellet.</li>
	<li>Dissolva a pelota em 6 μL de água livre de nuclease e adicionar 3 μL de formamida tintura de carregamento.</li>
</ol>4. reações de sequenciamento de
<ol><li>Use o modelo de DNA de 2.1 e o primer IRDye-rotulado de passo 3.4 para reações de sequenciamento padrão, usando dideoxynucleotides (ddNTPs) como terminadores de cadeia. Usar um kit de sequenciamento de DNA apropriado e siga as instruções do fabricante.</li>
	<li>Mix 6 μL de cada reação de sequenciamento com 3 μL de formamida tintura de carregamento.</li>
</ol>5. preparação do Gel e eletroforese de sequenciamento
Nota: Este protocolo usa um Imageador de fluorescência com base em gel e um 21 x 23 cm x gel de 0,2 mm, mas pode ser adaptado para outros sequenciadores ou gel-tamanhos, se necessário.
<ol><li>Limpe cuidadosamente os espaçadores de 0,2 mm, bem como o curto (23 x 25 cm) e tempo placas de vidro (30 × 25 cm) com 100% de etanol. Secar ao ar.</li>
	<li>Misture 30 mL de gel de ureia de poliacrilamida - 7M 6% misturar com 200 μL de persulfato de amónio de 10% (p/v) (APS) e 20 μL de tempted (TEMED). Despeje o gel, com cuidado para evitar bolhas e inserir o ' tubarão ' gel de pente. Permitir que o gel polimerizar por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Montar o aparelho de sequenciamento e encher os reservatórios com 1 x TBE.</li>
	<li>Pre-executada por 15 min em 1500 V até que seja alcançada a temperatura ideal de 55 ° C.</li>
	<li>Aqueça a mistura de corante de amostra/carregamento (a partir de passos 3.9 ou 4.2) a 85 ° C por 5 min. carga 1 μL para o gel de sequenciamento.</li>
	<li>Funcione o gel em 1500 V em 8 h. A máquina vai ler as faixas em tempo real.</li>
	<li>Desmontar o aparelho e elimine-o gel do acrilamido e buffer de execução.</li>
</ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15803138">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+just+scanning%3A+the+importance+of+cap-independent+mRNA+translation+initiation+for+cellular+stress+response+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).</li>
<li>Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Eukaryotic+Initiation+Factors+during+Cellular+Stress+and+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression.</a> J Nucleic Acids. 2016, 8235121(2016).</li>
<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Anthony, D. D., Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+40+S+and+80+S+complexes+with+mRNA+as+measured+by+sucrose+density+gradients+and+primer+extension+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition.</a> J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).</li>
<li>Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+inhibition+analysis+of+translation+initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extension inhibition analysis of translation initiation complexes.</a> Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).</li>
<li>Shirokikh, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Res. 38 (3), 15(2010).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Thakor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mRNA+recruits+the+ribosome+via+eIF3-PABP+bridge+to+initiate+internal+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation.</a> RNA Biol. , 1-15 (2016).</li>
<li>Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+IRES-mediated+translation+of+the+c-myc+and+BiP+mRNAs+by+the+poly%28A%29+tail+is+independent+of+intact+eIF4G+and+PABP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP.</a> Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).</li>
<li>Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+search+for+structurally+similar+cellular+internal+ribosome+entry+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites.</a> Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).</li>
<li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+a+single+GTP+is+used+in+the+formation+of+80+S+initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes.</a> J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).</li>
<li>Arnaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+34-Kilodalton+Isoform+of+Human+Fibroblast+Growth+Factor+2+Is+Cap+Dependently+Synthesized+by+Using+a+Non-AUG+Start+Codon+and+Behaves+as+a+Survival+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).</li>
<li>Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+48S+translation+preinitiation+complexes+into+80S+initiation+complexes+as+revealed+by+toeprinting%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting.</a> FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (92), e52295(2014).</li>
<li>Duncan, C. D. S., Mata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+interpretation+of+ribosome+profiling+experiments+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe.</a> Sci Rep. 7 (1), 10331(2017).</li>
<li>Beck, H. J., Janssen, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Translation+Initiation+Regulation+Mechanism+in+Escherichia+coli+ptrB+Mediated+by+a+5%27-Terminal+AUG%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG.</a> J Bacteriol. 199 (14), (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nenhum conflito de interesse de divulgar.

Toeprinting é uma técnica poderosa para medir diretamente a capacidade de um RNA de interesse para apoiar a formação de complexos de iniciação da tradução em circunstâncias altamente controlados. Este protocolo descreve uma técnica simplificada para toeprinting mamíferos RNAs. Reticulócito coelho lisado (RRL) é usado como uma fonte conveniente de ribossomos, eIFs, iniciador tRNA e IRES trans-agindo fatores (ITAFs). O experimentador fornece seu RNA de escolha e também pode complementar a reação de toeprinting com...

Como tradução consome energia mais celular, faz sentido que a tradução é fortemente regulamentado1. Por outro lado, a desregulação da tradução- e as consequentes alterações na saída de proteína-é frequentemente observada nos Estados-resposta ao estresse e doenças, como câncer,1,2. Uma grande vantagem do controle de translação é a velocidade com que as células podem alterar sua saída de proteína para responder a vários estímulos3. Regulamento de tradução, portanto, representa um importante mecanismo que pode influenciar a sobrevivência da pilha e morte1,2,3. As etapas da tradução, a iniciação é o mais altamente regulamentado e complexo3. Brevemente, mais eucarióticos mRNAs contêm uma 5' m7G tampa que quase sempre é essencial para a sua tradução. Cap-dependente iniciação requer iniciação eucariótico fatores eIF4E, eIF4A e eIF4G (o complexo cap-reconhecimento) para interagir com a extremidade 5' do mRNA. 43S preinitiation ribosome complexo, que contém o limite eIF2 iniciador tRNA e eIF3, é recrutado à extremidade 5' do mRNA através de uma interação de eIF4G com eIF3. A complexo de pré-iniciação é pensada para fazer a varredura do mRNA, auxiliado por eIF4A (um RNA helicase) até que o códon de início (AUG) está localizado. A complexo de iniciação 48S posteriormente é formada e tRNA é entregue para o P-site do ribosome. Finalmente, as subunidades 60S e 40S do Ribossoma são Unidas para formar o início dos anos 80 complexo, seguido de tradução alongamento1,3,4. Em contraste, sites de entrada interno Ribossoma (IRESes) contornar a exigência de uma 5' cap, recrutando a subunidade ribossomal 40S diretamente para o codão de iniciação3. Condições de estresse fisiológico atenuam global tradução de mRNA devido a modificações dos fatores chave geral iniciação eucariótico (eIFs). No entanto, mecanismos de iniciação da tradução não-canônicos permitam tradução seletiva de certos mRNAs que muitas vezes codificam proteínas de estresse-resposta, e desregulação da iniciação da tradução não-canônicos está implicada em doenças como o câncer 1 , 2. elementos reguladores de RNA discreto, tais como IRESes celular, permitam a tradução de tais mRNAs2,3.
Um aspecto particularmente interessante de controle de translação é compreender os mecanismos da canonical versus não-canônicos tradução de um mRNA determinado. Toeprinting é uma técnica que permite o estudo detalhado e mecanicista de iniciação da tradução de RNAs específicos in vitro. O objectivo geral de toeprinting é para avaliar a capacidade de um RNA de interesse de nucleada a formação de um início de tradução complexa com o ribossoma sob uma variedade de condições, a fim de determinar quais sequências, elementos estruturais ou acessório fatores são necessários para a iniciação da tradução eficiente. Por exemplo, recrutamento de Ribossoma pode ser prejudicado na ausência de um cap 5' mas estimulado pela presença de um IRES.
O princípio da técnica é in vitro transcrever um RNA de interesse, incube-lo na presença de extratos celulares contendo componentes de tradução (ou os componentes purificados) para permitir que transcrevem complexos de iniciação ao formulário e para reverter o RNA com um primer específico. Complexos estáveis de RNA-Ribossoma causará a transcrição reversa de empatar na extremidade 3' do Ribossoma, o so-called 'toeprint'5,6,7.
No presente protocolo, subunidades ribossomais, eIFs, os tRNAs e IRES trans-fatores de atuação (ITAFs) são convenientemente contribuídos por Reticulócito coelho lisado (RRL). Outra vantagem deste protocolo é o uso de um primer fluorescente-etiquetadas e Imageador de fluorescência com base em gel, ao invés de um primer radiolabeled. Isso elimina etapas extras, incluindo radioativos o primer, bem como a secagem do gel e expô-lo a uma intensificação da tela. As bandas fluorescentes são registadas em tempo real, como a execução de gel, permitindo a maior resolução. Destampada ligada ao X inibidor da apoptose RNA de IRES de proteína (XIAP) é usado como exemplo aqui, apesar de mRNAs tampados também podem ser analisados por esta técnica8.
Ao contrário da análise ocidental, que mede a saída final do processo de tradução em lisados celulares, toeprinting é uma abordagem in vitro para medir a formação do complexo tradução iniciação em um RNA. Esta abordagem reducionista permite o estudo altamente detalhado de substratos ou fatores que regulam a iniciação da tradução (EG., tampadas ou un-tampado mRNA, IRES estrutura, presença ou ausência de cauda poli-A, disposição de fatores específicos da proteína, etc.). Daí, toeprinting pode ser usado para estudar os diferentes modos de tradução8 ou os efeitos das estruturas de mRNA, tais como IRESes, na síntese de proteína9,10.

<table><tbody><tr><td>DEPC (Dietil pirocarbonato)</td> <td>Sigma</td><td>D5758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TRIS base, Ultrapure</td><td>JT Baker</td><td>4109-01</td><td></td></tr><tr><td>KOAc (acetato de potássio)</td> <td>Bio Basic</td><td>PB0438</td><td></td></tr><tr><td>Mg (OAc) 2 (acetato de magnésio tetrahidratado)</td> <td>Bio Basic</td><td>MB0326</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose, grau de biologia molecular</td><td>Calbiochem</td><td>573113-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PNP (Guanosina 5&prime;-[&beta;,&gama;-imido]trifosfato trissódico hidratado) 0,1 M solução</td><td>Sigma</td><td>G0635</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosina 5&prime;-trifosfato) sal dissódico, solução 100 mM</td><td>Sigma</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>19:1 Acrilamida: bis-acrilamida, 40%</td><td>Bio Basic</td><td>A0006</td><td></td></tr> Unidades de filtração de topo de garrafa de 500mL <tr><td>Urea</td><td>Bio Basic</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>, 0,2 &micro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.101</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (sal dissódico, di-hidratado)</td> <td>Bio Basic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio Basic</td><td>SB0485</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Bio Basic</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>xileno cianol FF</td><td>Bio Basic</td><td>XB0005</td><td></td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 kit de transcrição</td><td>Ambion</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 kit de transcrição</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Fenol:Clorofórmio (5:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>25:24:1 Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico</td><td>Invitrogen</td><td>15593-049</td><td></td></tr><tr><td>Lisado de Reticulócitos de Coelho (RRL). NÃO deve ser tratado com nuclease.</td><td>Green Hectares, EUA</td><td></td><td>Entre em contato com a Green Hectares, peça 1:1 RRL:água</td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor (40 U/&micro; L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>E00382</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>56172, 56173, 56174, 56175</td><td>Misture partes iguais para um estoque de 25 mM cada.</td></tr><tr><td>AMV-RT, 10 U/&micro; L</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>Sequenase Versão 2.0 Kit de Sequenciamento de</td><td>DNA Thermo Fisher</td><td>707701KT</td><td></td></tr><tr><td>Modelo 4200 IR2 Analisador de DNA</td><td>LI-COR</td><td></td><td>O produto foi descontinuado</td></tr><tr><td>APS (Persulfato de Amônio)</td> <td>Bio Basic</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Basic</td><td>TB0508</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polimerase de Alta Fidelidade</td><td>Novo Garrafa Térmica Turbo Fisher Biolabs</td><td>M0530</td><td></td>da Inglaterra Biolabs</tr><tr><td></td><td></td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mrnas mamíferos

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Iniciação da tradução é a etapa limitante da síntese de proteínas e representa um ponto-chave na qual células regulam a produção de proteína. Regulação da síntese de proteínas é a chave para a resposta de estresse celular e desregulação é central para muitos Estados de doença, como o câncer. Por exemplo, embora o estresse celular leva para a inibição da tradução global pela atenuante cap-dependente iniciação, certas proteínas de estresse-resposta seletivamente são traduzidas em uma forma independente de cap. Discreto do RNA dos elementos reguladores, tais como sites de entrada celular Ribossoma interno (IRESes), permitem a tradução destes mRNAs específicos. Identificação de tais mRNAs e a caracterização dos seus mecanismos reguladores, tem sido uma área-chave em biologia molecular. Toeprinting é um método para o estudo da estrutura do RNA e função no que tange a iniciação da tradução. O objetivo do toeprinting é avaliar a capacidade do in vitro transcrito de RNA para formar complexos estáveis com ribossomas sob uma variedade de condições, a fim de determinar quais sequências, elementos estruturais ou acessórios fatores estão envolvidos no Ribossoma ligação — um pré-cursor para a iniciação da tradução eficiente. Ao lado de outras técnicas, tais como análise ocidental e polysome de perfil, toeprinting permite uma caracterização robusta de mecanismos para a regulação da iniciação da tradução.

Descrevemos anteriormente a capacidade da IRES XIAP para apoiar a iniciação de tradução tampão-independente em vitro8,10. Toeprinting foi a chave técnica para interrogar os detalhes mecanicistas da iniciação XIAP IRES complexo. Uma construção de DNA codificação um mRNA contendo o XIAP IRES (Figura 1A) estava em vitro transcritas e submetidas a análise de toeprinting....

Toeprinting visa medir a capacidade de in vitro transcrito de RNA para formar complexos de iniciação de tradução com ribossomas sob uma variedade de condições. Este protocolo descreve um método para mamíferos RNA toeprinting e pode ser usado para estudar a tradução tanto cap-dependente e IRES-driven.

Análise de Toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mRNAs mamíferos

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

O objetivo geral desta análise de impressão digital é observar a formação do complexo de iniciação da tradução em mRNAs de mamíferos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da tradução de mRNA, como o início da tradução mediada pelo IRES. A principal vantagem desta técnica é que se pode realizar uma análise detalhada da formação do complexo de iniciação da tradução em um mRNA específico.Monte as reações de transcrição para transcrever o RNA dos modelos de DNA amplificados por PCR, codificando o RNA do XIAP IRES ou seus mutantes. Em seguida, adicione duas unidades de DNase livre de RNase para remover o molde de DNA para cada reação de 20 microlitros de RNA. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, dilua o RNA tratado com DNase com água livre de nuclease até um volume final de 110 microlitros. Em seguida, adicione 110 microlitros de fenol ácido para iniciar a purificação do RNA. Vortex as amostras por cinco segundos e centrifugue a 20.000 x g por três minutos à temperatura ambiente.É fundamental diluir o RNA ou CDNA antes da extração do fenol. Se o volume for muito baixo, será difícil recuperar fisicamente a fase aquosa e o rendimento final será bai

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um grande impedimento para análises bioquímicas dos ribossomos contendo nascente peptidil-tRNAs foi a presença de ribossomos outros nas mesmas amostras, os ribossomos não estão envolvidos na tradução da seqüência de mRNA específico que está sendo analisado. Nós desenvolvemos uma metodologia simples para purificar, exclusivamente, os ribossomos que contém a nascente peptidil-tRNA de interesse.

Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo peptidil-tRNAs para análises funcionais e estruturais

Aqui, descrevemos um método para analisar mudanças na iniciação da tradução do mRNA de células eucarióticas em resposta a condições de estresse. Este método baseia-se na separação de velocidade em gradientes de sacarose de traduzindo ribossomas de ribossomas não traduzindo.

Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

Este protocolo ilustra modificações essenciais da polyribosome fraccionamento, a fim de estudar o translatome in vivo de amostras do SNC. Ele permite que a avaliação global de tradução e transcrição regulação através do isolamento e comparação de RNA total para ribossomo frações de RNA ligado.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Ribossomas desempenham um papel central na síntese de proteínas. Polyribosome (polysome) fracionamento por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose permite a determinação direta da eficiência de tradução de mRNAs individuais em uma escala de todo o genoma. Além disso, este método pode ser usado para a análise bioquímica de ribossomas e factores associados--polissomas como acompanhantes e moléculas de sinalização.

Polysome Fracionamento e Análise de mamíferos Translatomes em uma escala genômica

Este manuscrito descreve um método para visualizar e quantificar eventos tradução localizada em compartimentos subcellular. A abordagem proposta neste manuscrito requer um sistema básico de imagens confocal e reagentes e é rápido e econômico.

Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução

Aqui, nós descrevemos o conjunto de complexos do alongamento do polymerase II (pol II) do RNA que exigem somente o ADN sintético curto e oligonucleotídeos do RNA e o pol purificado II. Esses complexos são úteis para estudar mecanismos subjacentes ao processamento cotranscricional de transcrições associadas ao complexo de alongamento pol II.

Complexos artificiais de alongamento de RNA polimerase II para dissecar eventos co-transcricionais do processamento de RNA

O rastreamento de eventos de tradução individual permite estudos cinéticos de alta resolução de mecanismos de tradução dependentes de tampas. Aqui demonstramos um ensaio in vitro de molécula única baseado em interações de imagem entre anticorpos fluorescentes rotulados e peptídeos nascentes marcados por epítope. Este método permite a caracterização de uma molécula de cinética de iniciação e alongamento de peptídeos durante a tradução ativa in vitro dependente de tampas.

Um ensaio de imagem de molécula única in vitro para a análise de cinética de tradução dependente da tampa

Este protocolo descreve um ensaio repórter para estudar a regulação da tradução de mRNA em oócitos únicos durante a maturação in vitro.

Definindo o Programa de Tradução materna mRNA durante a maturação in vitro usando um ensaio de repórter oócito único

Apresentamos uma técnica para estabilizar rapidamente complexos translacionais (biossíntese de proteínas) com formaldeído interligando em leveduras vivas e células mamíferas. A abordagem permite dissecar intermediários transitórios e interações dinâmicas de RNA:protein. Os complexos interligados podem ser usados em vários aplicativos a jusante, como em métodos de perfil baseados em sequenciamento profundo, microscopia e espectrometria de massa.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Aprenda a técnica de toeprinting para analisar a formação de complexos de iniciação de tradução em mRNAs de mamíferos. Este método permite estudar mecanismos de tradução dependentes de cap e mediados por IRES.

Análise de Toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mRNAs mamíferos

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