Análise de Toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mRNAs mamíferos

O objetivo geral desta análise de impressão digital é observar a formação do complexo de iniciação da tradução em mRNAs de mamíferos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da tradução de mRNA, como o início da tradução mediada pelo IRES. A principal vantagem desta técnica é que se pode realizar uma análise detalhada da formação do complexo de iniciação da tradução em um mRNA específico.

Monte as reações de transcrição para transcrever o RNA dos modelos de DNA amplificados por PCR, codificando o RNA do XIAP IRES ou seus mutantes. Em seguida, adicione duas unidades de DNase livre de RNase para remover o molde de DNA para cada reação de 20 microlitros de RNA. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, dilua o RNA tratado com DNase com água livre de nuclease até um volume final de 110 microlitros. Em seguida, adicione 110 microlitros de fenol ácido para iniciar a purificação do RNA. Vortex as amostras por cinco segundos e centrifugue a 20.000 x g por três minutos à temperatura ambiente.

É fundamental diluir o RNA ou CDNA antes da extração do fenol. Se o volume for muito baixo, será difícil recuperar fisicamente a fase aquosa e o rendimento final será baixo. Em seguida, transfira cuidadosamente 100 microlitros da fase aquosa contendo RNA para um novo tubo de microcentrífuga.

Adicione 10 microlitros de acetato de sódio 3 M, pH 5,5, e misture as amostras. Em seguida, adicione três volumes de etanol a 100% para precipitar o RNA e o vórtice das amostras por cinco segundos. Incube durante a noite a 20 graus Celsius.

No dia seguinte, centrifugar as amostras a 20 000 x g durante 30 minutos a quatro graus Celsius e rejeitar o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet com 500 microlitros de etanol 70% gelado e repita a centrifugação. Aspirar cuidadosamente o máximo de sobrenadante possível, sem desalojar o sedimento.

Em seguida, seque o pellet ao ar por cinco a 10 minutos. Ressuspenda o pellet em água livre de nuclease até uma concentração final de 0,5 microgramas por microlitro. Para iniciar o ensaio de impressão do dedo do pé, adicione 15 microlitros de lisado de reticulócitos de coelho não tratado com nuclease a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, que representa o RNA XIAP IRES do tipo selvagem e seus mutantes.

Adicione inibidor de RNase, ATP e GMP-PNP a cada tubo. Incube a 30 graus Celsius por cinco minutos. Depois disso, adicione um microlitro do respectivo RNA a cada um dos tubos e incube a 30 graus Celsius por mais cinco minutos.

Durante o período de incubação, adicione TDT e espermidina ao tampão de impressão do dedo do pé. Em seguida, adicione 22 microlitros de tampão de impressão do dedo do pé a cada um dos tubos e incube a 30 graus Celsius por três minutos. Em seguida, adicione 0,5 microlitros de primer de impressão de dedo do pé rotulado com corante infravermelho e incube a reação no gelo por 10 minutos.

Posteriormente, adicione dois microlitros de dNTPs, dois microlitros de acetato de magnésio e um microlitro de transcriptase reversa do vírus da mieoloblastose aviária. Traga o volume final para 50 microlitros com tampão de impressão do dedo do pé. Em seguida, permita que a extensão do primer ocorra por 45 minutos a 30 graus Celsius.

Também é fundamental adicionar acetato de magnésio à reação de impressão do dedo do pé, sem a qual a transcriptase reversa não funcionará de maneira ideal. Depois disso, adicione 200 microlitros de água livre de nuclease. Adicione 250 microlitros de fenol:24:1 25:24:1

Após cinco segundos de vórtice, centrifugar as amostras a 20 000 x g à temperatura ambiente durante três minutos. Em seguida, transfira cuidadosamente a fase aquosa contendo o DNA para um novo tubo de microcentrífuga. Em seguida, adicione três volumes de etanol a 100% para precipitar o DNA e o vórtice por cinco segundos.

Incube durante a noite a 20 graus Celsius. No dia seguinte, centrifugar os tubos a 20 000 x g durante 30 minutos a quatro graus Celsius e rejeitar o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet de DNA com 500 microlitros de etanol a 70% gelado e centrifugue a 20.000 x g por 15 minutos a quatro graus Celsius.

Aspire o mais sobrenadante possível, tomando cuidado para não desalojar o pellet. Em seguida, seque o pellet ao ar por cinco a 10 minutos. Dissolva o pellet de DNA em seis microlitros de água livre de nuclease.

Em seguida, adicione três microlitros de corante de carga de formamida. Use um kit de sequenciamento para preparar uma escada de sequenciamento de didesoxinucleotídeos com o primer de impressão do dedo do pé e a construção de DNA que codifica o RNA XIAP IRES. Em seguida, misture seis microlitros de cada reação de sequenciamento com três microlitros do corante de carga de formamida.

Depois de limpar e montar as placas, despeje o gel e insira o pente. Após a polimerização do gel, montar o aparelho de sequenciamento e encher os reservatórios com 1x TBE. Em seguida, execute previamente a 1500 volts por 15 minutos até atingir uma temperatura de 55 graus Celsius.

Aqueça todas as amostras com corante formamida a 85 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, carregue um microlitro de cada amostra em um gel de sequenciamento de poliacrilamida a 6% e execute o gel a 1500 volts por oito horas. Finalmente, leia as bandas em tempo real com um gerador de imagens baseado em fluorescência.

Este método mostra que a confirmação do RNA é crítica para a formação do complexo de iniciação da tradução. A transcrição reversa do complexo ribossomo de mRNA XIAP produz impressões típicas de 17 a 19 nucleotídeos a jusante de AUG. O mutante 5'PPT mostra formação de impressão digital prejudicada.

No entanto, quando transcrito com o 5'cap, ocorre a formação do complexo de iniciação. Da mesma forma, o mutante 3'PPT também mostra formação de impressão digital prejudicada. No entanto, a transcrição com o 5'cap leva à formação do complexo de iniciação.

O mutante PPT duplo que abriga as mutações 5'PPT e 3'PPT é capaz de formar o complexo de iniciação sem o 5'cap. A formação da impressão digital é fortemente prejudicada para o códon de início mutante na ausência de RRL e GMP-PNP e uma cauda Poly A. Os produtos CDNA são comparados com uma escada de sequenciamento de didesoxinucleotídeos.

A globina beta humana, ou mRNA HBB, não mostra impressão digital na ausência da tampa 5'. No entanto, o complexo de iniciação é formado no 5'UTR tampado de HBB, produzindo impressões de dedos de 16 a 18 nucleotídeos a jusante de AUG. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três dias, incluindo a preparação de modelos de transcrição in vitro e RNA, se realizada corretamente.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como sondagem estrutural, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a estrutura secundária do tipo selvagem ou variantes mutantes do IRES. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da tradução de mRNA explorarem a tradução mediada por IRES in vitro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a impressão digital de mRNA de mamíferos e analisar a formação de complexos de iniciação de tradução.

Não se esqueça de que o ácido fenol, o fenol: clorofórmio: o álcool isoamílico e a acrilamida podem ser extremamente perigosos. Equipamento de proteção individual apropriado deve ser usado durante o uso desses reagentes.