Name: Injeção de Retroductal de nanopartículas para a glândula Submandibular murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprenda a técnica de injeção retraductal de nanopartículas poliméricas na glândula submandibular murina para entrega direta de compostos, contornando a circulação sistêmica. Este método avança pesquisas em terapias para disfunção salivar.

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Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de dentária e Craniofacial Research (NIDCR) e o National Cancer Institute (NCI) do institutos nacionais da saúde sob prêmio número R56 DE025098, DE027695 UG3 e CA206296 F30. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde. Este trabalho também foi apoiado pela NSF DMR 1206219 e a inovação IADR no prêmio de cuidado Oral (2016).
Gostaríamos de agradecer sua ajuda na realização de experimentos IVIS Jayne Gavrity. Gostaríamos de agradecer a Karen Bentley para sua entrada e assistência na realização de EM. Gostaríamos de agradecer sua ajuda com IHC Pei-Lun Weng. Gostaríamos de agradecer a Matthew Ingalls por sua assistência na preparação de figura. Gostaríamos de agradecer o Dr. Elaine Smolock e Emily Wu para leitura crítica deste manuscrito.

Todos na vivo os procedimentos descritos abaixo foram aprovados pela Comissão Universidade recursos animais na Universidade de Rochester, Rochester, NY.
1. preparação
<ol><li>Usando o tubo de cateter intracraniano 32G com inserir fio, corte 3 cm do tubo para formar uma ponta chanfrada, aproximadamente 45° ao eixo longo. Confirme que o fio é mais do que o tubo de pelo menos 1 cm.</li>
	<li>Carrega 50 µ l de solução de nanopartículas PSMA (Figura 1), ou outro material de injeção, em uma seringa de Hamilton. Para reduzir a probabilidade de barotrauma durante a injeção, fixe o tubo do cateter, com o estilete removido, a seringa e expulsar o volume morto.</li>
	<li>Inspecione a solução de injeção para assegurar que as nanopartículas é totalmente solvated para evitar obstrução ductal após a administração.</li>
	<li>Prepare a solução de atropina em 0,1 mg/mL. Nota: Porque a atropina é sensível à luz e degrada ao longo do tempo, esta solução deve ser feita no dia da injeção e protegida da luz até administrado.</li>
</ol>2. acesso e visualização Ductal ponto de entrada
<ol><li>Pese de camundongos C57/BL6 usando uma balança analítica.</li>
	<li>Utilizando uma seringa de 0,5 mL com agulha 29 x ½", anestesia os ratos com uma solução salina estéril intraperitonealmente injetado de 100 mg/kg quetamina e 10 mg/kg de xilazina. Prossiga para a etapa seguinte quando o mouse não responde mais aos estímulos, que geralmente ocorre dentro de 5 a 10 min após a injeção. Nota: Este procedimento também pode ser realizado com isoflurano, mas exigirá um cone de nariz personalizado que permite o acesso à cavidade oral.</li>
	<li>Para evitar o ressecamento durante o procedimento, aplique o lubrificante para os olhos e coloque o mouse em posição num palco personalizado. Nota: Para manter as condições adequadas para um procedimento intra-oral, ferramentas devem ser desinfectadas ou esterilizadas antes de cada utilização.</li>
	<li>Abra a cavidade oral por assegurar os incisivos sobre uma viga de metal e usar uma faixa elástica para aplicar tensão para baixo por trás dos incisivos mandibulares (Figura 2A).</li>
	<li>Alinhe o mouse sob o microscópio de dissecação, tal que a base da mandíbula é visualizada.</li>
	<li>Para alargar a boca, use um afastador de aço personalizado, curvo para aplicar tensão bilateralmente na mucosa bucal.</li>
	<li>Para visualizar a papila submandibulares, segure e levante suavemente a língua do chão da boca usando fórceps rombudo. Nota: As papilas aparecerá como duas saliências pálidas debaixo da língua (Figura 2B).</li>
	<li>Para facilitar a visualização e outra manipulação dentro da cavidade oral, coloque algodão entre a língua e mucosa bucal.</li>
</ol>3. ductal canulação e colocação de linha
<ol><li>Usando bem, pinça curva, segure tubo do cateter com a inserção do fio. Para melhor controle manual durante a cateterização, alinhe o tubo com a curvatura da pinça (Figura 3A).</li>
	<li>Usando o microscópio de dissecação, mova o fórceps e fio para o campo de visão. Nota: O fio deve ser salientes da tubagem.</li>
	<li>Aplica suavemente a pressão na base de uma papila submandibular usando o fio de encastrar para produzir uma perfuração pequena, superficial, da mucosa (0,076 mm de diâmetro) que facilitará a posterior entrada do tubo de cateter (0,25 mm de diâmetro). Se encontrar resistência, corte pontas biseladas frescas sobre a tubulação e a inserção do fio com tesoura afiada de dissecação.</li>
	<li>Após a entrada, retirar o estilete e, usando o microscópio de dissecação, confirmar a presença de saliva no local da punção. Evite movimento enérgico ou súbito (retirada ou inserção) do estilete que pode causar sangramento ou comprometer a integridade ductal.</li>
	<li>Retire o estilete dentro da tubulação (Figura 3B).</li>
	<li>Para garantir que tubulação de injeção vai caber no ducto de Wharton abertura, inserir o tubo contendo o estilete como um guia rígido para a punção feita anteriormente (Figura 2 C). Nota: Se não executada rapidamente, inchaço local pode evitar re-inserção.</li>
	<li>Para evitar a pressão traseira de obstrução ductal prolongada, retire o tubo. Inspecione para verificar que uma abertura, visível sob microscopia, pode ser vista na papila submandibular. Se o sangramento visível ocorre, retire o estilete e tente novamente de passo 3.2 sobre as papilas submandibulares opostas.</li>
	<li>Sem mover o mouse, administre injeção intraperitoneal de solução de atropina 1 mg/kg, para reduzir a salivação durante o procedimento. Espere 5-10 min.</li>
	<li>Segure a extremidade do tubo de seringa e introduza no orifício usando o microscópio de dissecação (Figura 3). Se encontrar resistência, corte uma extremidade chanfrada fresca para a tubulação e a tentativa.</li>
	<li>Uma vez que o tubo está no lugar dentro da papila submandibular, avance lentamente 3-5 mm para o ducto. Lançamento da tubulação da pinça.</li>
	<li>Para melhorar a vedação entre o tubo e a papila submandibular, seca a interface pela mancha suavemente com gaze durante 1 min.</li>
	<li>Inspecione para confirmar que a posição do tubo não mudou durante a secagem.</li>
</ol>4. injeção
<ol><li>Injete o material a uma taxa de 10 µ l/min. verificar para confirmar que o mouse permanece sedado e não mostra sinais de aflição (Figura 2D). Nota: Injeções de 15-50 µ l são bem toleradas. Injeção de volumes maiores pode provocar barotrauma.</li>
	<li>Após a injeção, manter a pressão de seringa por 5 min melhorar a retenção de material dentro de duto da Wharton e SMG (Figura 4). Inspecione a papila submandibular periodicamente para assegurar que a tubulação não sair o orifício ductal.</li>
	<li>Usando a pinça fina, agarrar e retirar o tubo delicadamente as papilas submandibulares. Nota: É normal observar algum fluido egresso das papilas.</li>
	<li>Remova o retractor e algodão da cavidade oral antes de mover o mouse do palco. Nota: O animal não deve ser deixado sem supervisão até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Além disso, certifique-se de que o mouse não está alojado com outros ratos até totalmente recuperado.</li>
</ol>5. verificação e análise
Nota: Um na vivo Imaging System (IVIS) pode ser usado para avaliar a retenção de nanopartículas fluorescente etiquetadas após injeção (como mostrado 1 h e 24 h após a injeção na Figura 5).
<ol><li>Para visualizar melhor sinal fluorescente dentro do SMG através da pele, remova a pele ventral sobrejacente as SMGs por depilar ou usar um creme depilatório químico. Nota: Após a eutanásia, tecido SMG também pode ser colhido, fixo (pernoite em paraformaldeído 4%) e manchado usando imuno-histoquímica para confirmar a persistência de NP fluorescente etiquetada um dia depois da injeção (Figura 6).</li>
</ol>

<ol><li>Miranda-Rius, J., Brunet-Llobet, L., Lahor-Soler, E., Farre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+Secretory+Disorders%2C+Inducing+Drugs%2C+and+Clinical+Management%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Salivary Secretory Disorders, Inducing Drugs, and Clinical Management.</a> International Journal Of Medical Sciences. 12 (10), 811-824 (2015).</li>
<li>Acauan, M. D., Figueiredo, M. A. Z., Cherubini, K., Gomes, A. P. N., Salum, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy-induced+salivary+dysfunction%3A+Structural+changes%2C+pathogenetic+mechanisms+and+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy-induced salivary dysfunction: Structural changes, pathogenetic mechanisms and therapies.</a> Archives of Oral Biology. 60 (12), 1802-1810 (2015).</li>
<li>Dirix, P., Nuyts, S., Vander Poorten, V., Delaere, P., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+xerostomia+after+radiotherapy+on+quality+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Supportive+Care+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">The influence of xerostomia after radiotherapy on quality of life.</a> Supportive Care in Cancer. 16 (2), 171-179 (2008).</li>
<li>Vissink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+management+of+salivary+gland+hypofunction+and+xerostomia+in+head-and-neck+cancer+patients%3A+successes+and+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Clinical management of salivary gland hypofunction and xerostomia in head-and-neck cancer patients: successes and barriers.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (4), 983-991 (2010).</li>
<li>Delporte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fluid+secretion+after+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+to+irradiated+rat+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA to irradiated rat salivary glands.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (7), 3268-3273 (1997).</li>
<li>Samuni, Y., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+in+salivary+glands%3A+from+the+bench+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Gene delivery in salivary glands: from the bench to the clinic.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1812 (11), 1515-1521 (2011).</li>
<li>Beahm, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+approaches+to+the+submandibular+gland%3A+A+review+of+literature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Surgical approaches to the submandibular gland: A review of literature.</a> International Journal of Surgery. 7 (6), 503-509 (2009).</li>
<li>Zheng, C., Shinomiya, T., Goldsmith, C. M., Di Pasquale, G., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convenient+and+reproducible+in+vivo+gene+transfer+to+mouse+parotid+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+diseases%22%5BJournal%5D)">Convenient and reproducible in vivo gene transfer to mouse parotid glands.</a> Oral diseases. 17 (1), 77-82 (2011).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Radiation-Induced+Salivary+Hypofunction+Following+hKGF+Gene+Delivery+to+Murine+Submandibular+Glands%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prevention of Radiation-Induced Salivary Hypofunction Following hKGF Gene Delivery to Murine Submandibular Glands.</a> Clinical Cancer Research. 17 (9), 2842-2851 (2011).</li>
<li>Okazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+rat+salivary+gland+tissue+repair+by+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Acceleration of rat salivary gland tissue repair by basic fibroblast growth factor.</a> Archives of Oral Biology. 45 (10), 911-919 (2000).</li>
<li>Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-mediated+gene+silencing+confers+radioprotection+to+salivary+glands+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo.</a> Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).</li>
<li>Cotrim, A. P., Sowers, A., Mitchell, J. B., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+irradiation-induced+salivary+hypofunction+by+microvessel+protection+in+mouse+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Prevention of irradiation-induced salivary hypofunction by microvessel protection in mouse salivary glands.</a> Molecular Therapy. 15 (12), 2101-2106 (2007).</li>
<li>Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersed+donor+salivary+gland+cells+are+widely+distributed+in+the+recipient+gland+when+infused+up+the+ductal+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree.</a> Biotechnic & Histochemistry. 84 (6), 253-260 (2009).</li>
<li>Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+radiation+therapy-induced+salivary+gland+dysfunction+in+mice+by+post+therapy+IGF-1+administration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration.</a> BMC Cancer. 10, 417-417 (2010).</li>
<li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-Like+Growth+Factor-1+Preserves+Salivary+Gland+Function+After+Fractionated+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (2), 579-586 (2010).</li>
<li>Marmary, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26759233">Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL-6 modulation.</a> Cancer Research. , (2016).</li>
<li>Baum, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+responses+to+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+for+radiation-induced+salivary+hypofunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19403-19407 (2012).</li>
<li>Arany, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-apoptotic+gene+knockdown+mediated+by+nanocomplexed+siRNA+reduces+radiation+damage+in+primary+salivary+gland+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-apoptotic gene knockdown mediated by nanocomplexed siRNA reduces radiation damage in primary salivary gland cultures.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 113 (6), 1955-1965 (2012).</li>
<li>Benoit, D. S. W., Henry, S. M., Shubin, A. D., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-responsive+polymeric+siRNA+carriers+sensitize+multidrug+resistant+ovarian+cancer+cells+to+doxorubicin+via+knockdown+of+polo-like+kinase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">pH-responsive polymeric siRNA carriers sensitize multidrug resistant ovarian cancer cells to doxorubicin via knockdown of polo-like kinase 1.</a> Molecular pharmaceutics. 7 (2), 442-455 (2010).</li>
<li>Malcolm, D. W., Varghese, J. J., Sorrells, J. E., Ovitt, C. E., Benoit, D. S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Biological+Fluids+on+Colloidal+Stability+and+siRNA+Delivery+of+a+pH-Responsive+Micellar+Nanoparticle+Delivery+System%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The Effects of Biological Fluids on Colloidal Stability and siRNA Delivery of a pH-Responsive Micellar Nanoparticle Delivery System.</a> ACS Nano. , (2017).</li>
<li>Baranello, M. P., Bauer, L., Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28styrene-alt-maleic+anhydride%29-based+diblock+copolymer+micelles+exhibit+versatile+hydrophobic+drug+loading%2C+drug-dependent+release%2C+and+internalization+by+multidrug+resistant+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(styrene-alt-maleic anhydride)-based diblock copolymer micelles exhibit versatile hydrophobic drug loading, drug-dependent release, and internalization by multidrug resistant ovarian cancer cells.</a> Biomacromolecules. 15 (7), 2629-2641 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture-Targeted+Delivery+of+%CE%B2-Catenin+Agonists+via+Peptide-Functionalized+Nanoparticles+Augments+Fracture+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Fracture-Targeted Delivery of β-Catenin Agonists via Peptide-Functionalized Nanoparticles Augments Fracture Healing.</a> ACS Nano. 11 (9), 9445-9458 (2017).</li>
<li>Baranello, M. P., Bauer, L., Jordan, C. T., Benoit, D. S. W. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12195-015-0391-x">Micelle Delivery of Parthenolide to Acute Myeloid Leukemia Cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 455-470 (2015).</li>
<li>Kuriki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannulation+of+the+Mouse+Submandibular+Salivary+Gland+via+the+Wharton%27s+Duct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e3074(2011).</li>
<li>Nair, R. P., Zheng, C., Sunavala-Dossabhoy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroductal+Submandibular+Gland+Instillation+and+Localized+Fractionated+Irradiation+in+a+Rat+Model+of+Salivary+Hypofunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li>
<li>Wang, Y., Malcolm, D. W., Benoit, D. S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+and+sustained+delivery+of+siRNA%2FNPs+from+hydrogels+expedites+bone+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled and sustained delivery of siRNA/NPs from hydrogels expedites bone fracture healing.</a> Biomaterials. 139 (Supplement C), 127-138 (2017).</li>
<li>Hoffman, M. D., Van Hove, A. H., Benoit, D. S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradable+hydrogels+for+spatiotemporal+control+of+mesenchymal+stem+cells+localized+at+decellularized+bone+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Degradable hydrogels for spatiotemporal control of mesenchymal stem cells localized at decellularized bone allografts.</a> Acta Biomaterialia. 10 (8), 3431-3441 (2014).</li>
<li>Nguyen, C. Q., Yin, H., Lee, B. H., Chiorini, J. A., Peck, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL17%3A+potential+therapeutic+target+in+Sjogren%27s+syndrome+using+adenovirus-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">IL17: potential therapeutic target in Sjogren's syndrome using adenovirus-mediated gene transfer.</a> Laboratory Investigation. 91 (1), 54-62 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Retroductal injeção é fundamental para a entrega de drogas localizadas à glândula salivar. Essa técnica tem aplicações na triagem de agentes terapêuticos para condições, incluindo a síndrome de Sjogren e RIH9,10,28. Entrega da droga direto para a SMG através da injeção de retroductal fornece uma vantagem chave sobre administração sistémica no seu potencial para reduzir os efeitos fora do alvo, incluindo ativação imune<sup class=...

Disfunção da glândula salivar tem várias etiologias, incluindo a síndrome de Sjögren, uma auto-imune mediada por perda de tecido secretor funcional e radiação induzida hipossalivação (RIH), uma comum sequelas de cabeça e pescoço câncer radioterapia1. Perda da função salivar devido qualquer condição predispõe indivíduos a infecção oral e sistêmica, cárie dentária, disfunção digestiva e deglutição, Imparidade de discurso e depressão1,2,3. Como resultado, qualidade de vida significativamente sofre, com intervenções limitadas a paliação dos sintomas ao invés de cura4. Para investigar novas terapias na vivo, é de interesse para administrar compostos bioativos diretamente à glândula salivar.
Injeção de Retroductal é um método valioso para entregar compostos bioativos diretamente para as glândulas salivares e testar a eficácia na doença, lesão, ou sob a homeostase do tecido normal. As três principais glândulas salivares são as parótidas (PG), a submandibular (SMG) e a sublingual (SLG), todos que vazio na cavidade oral através de ductos excretores. A anatomia do murino SMG permite acesso direto através de cateterização do ducto de Wharton, localizado no assoalho da boca sob a língua5. Após a cateterização, solvated drogas podem ser administradas diretamente para a SMG. Após o parto retroductal, difusão extra glandular é restrito pela cápsula de tecido circundante, que regula a troca de material com em torno de estruturas6. O SMG e seu ducto estruturam-se da mesma forma em seres humanos e rotineiramente são acessados durante SMG cirurgia e sialoendoscopy7. Em humanos e ratos, o PG é igualmente acessível através do duto de Stensen na mucosa bucal8.
Em modelos murino da RIH, injeção de retroductal SMG tem sido utilizada para entregar terapêutica incluindo fatores de crescimento, as células primárias, vetores adenovírus, citocinas e compostos antioxidantes modular a resposta celular a lesões, e reduzir o tecido danos5,9,10,11,12,13,14,15,16. O mais notável sucesso clínico da injeção de retroductal é a administração do vetor adenovírus para direcionar a expressão de um canal de água (aquaporina 1; AQP1) em pacientes após a radiação para câncer de cabeça e pescoço17.
Anteriormente, desenvolvemos e demonstrado a eficácia de um sistema de nanopartículas poliméricas-siRNA retroductally injetado para proteger a função da glândula salivar de RIH11,18,19,20. Como uma extensão de nossos trabalhos anteriores, aqui, demonstramos nosso protocolo para injeção de SMG retroductal usando uma nanopartícula fluorescente etiquetada (NP) capaz de carregar e entregar outra forma pouco solúvel drogas21,22, 23.
Podemos ter sintetizado o NP de um copolímero de diblock composto de poli (estireno-alt-hidrazida anhydride)-b-poly(styrene) (PSMA) através da polimerização de fragmentação (balsa) de cadeia de adição reversível, conforme descrito anteriormente,21. Através da troca de solvente, estes polímeros espontaneamente auto-montagem em estruturas de NP micelle com um hidrofóbico hidrofílico e interior exterior21. O NPs é rotulado com o fluoróforo Texas-vermelho para permitir a verificação da entrega NP nas glândulas sem sacrificar o animal. Viver a imagem animal e imuno-histoquímica SMG é mostrado em 1 h e 1 dia após a injeção.
Esta actualizado e protocolo de canulação reprodutível deve permitir que outros conseguir injeção de retroductal. Esperamos que esta técnica refinada se torne crítica para estudos em vivo e desenvolvimento terapêutico24,25.

<table><tbody><tr><td>Cloridrato de pilocarpina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6503</td><td>Pilocarpina</td></tr><tr><td>Estudante Vannas Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-9</td><td>Tesoura de mola para traqueostomia</td></tr><tr><td>Solução salina estéril</td><td>Medline</td><td>RDI30296H</td><td>Solução salina</td></tr><tr><td>Dumont # 7 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td>Fórceps curvo</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Fórceps Reta</td></tr> Padrão <tr><td>Padrão Fórceps</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11000-12</td><td>Fórceps Blunt</td></tr><tr><td>Tesoura Fina- Carboneto de Tungstênio</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>14568-09</td><td>Tesoura de Dissecção</td></tr><tr><td>Microhematócrito Tubos Capilares Heparinizados</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362566</td><td>Tubos Capilares</td></tr><tr><td>Lubrificante Pomada</td> <td>para os OlhosRefresh</td><td>N/A</td><td>Refresh Lacri-Lube</td></tr><tr><td>Goat policlonal anti-Nkcc1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-21545</td><td>Nkcc1 Anticorpo</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td></td><td>GraphPad ver6.0</td><td>Software Estatístico</td></tr><tr><td>Aplicador com ponta de algodão</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td>Aplicador para pomada ocular</td></tr><tr><td>0,5 cc Seringa de insulina, 29G x 1/2 "</td><td>BD</td><td>7629</td><td>Seringa para injeção intraperitoneal</td></tr></tbody></table>

injeção de retroductal de nanopartículas para a glândula submandibular murino

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Dois objetivos comuns das glândulas salivares terapêutica são prevenção e cura da disfunção do tecido seguindo ou auto-imune ou radiação. Entregando localmente compostos bioativos para as glândulas salivares, maiores concentrações de tecido podem ser alcançadas com segurança contra administração sistémica. Além disso, fora o tecido-alvo os efeitos da acumulação extra glandular de material podem ser drasticamente reduzidos. A este respeito, injeção de retroductal é um método amplamente usado para investigar a biologia das glândulas salivares e a fisiopatologia. Retroductal administração de fatores de crescimento, as células primárias, vetores adenovírus e drogas pequena molécula mostrou para apoiar a função da glândula no cenário do ferimento. Nós anteriormente demonstraram a eficácia de uma estratégia de siRNA nanoparticle retroductally injetada para manter a função da glândula após irradiação. Aqui, um método altamente eficaz e reprodutível para administrar nanomateriais para a glândula submandibular murino através do ducto de Wharton é Detalhado (Figura 1). Descrevemos a acessar a cavidade oral e descrevem as etapas necessárias ao duto de cannulate da Wharton, com novas observações servindo como verificações de qualidade durante todo o procedimento.

Injeção de Retroductal pode ser usada para administrar o NPs para a SMG murino (Figura 1). Aqui, nós entregamos a 50 µ g PSMA NPs rotulado com vermelho Texas fluoróforo.
Colocação adequada do mouse permite fácil acesso e visualização do assoalho da boca (Fig. 2A-B). As papilas submandibulares são identificadas como duas saliências carnudas debaixo da lí...

Entrega de drogas local para as glândulas submandibulares é de interesse em biologia de glândula salivar de entendimento e para o desenvolvimento de novas terapêuticas. Apresentamos um protocolo de injeção retroductal atualizadas e detalhadas, destinado a melhorar a precisão de entrega e reprodutibilidade experimental. O aplicativo aqui apresentado é a entrega de nanopartículas poliméricas.

Injeção de Retroductal de nanopartículas para a glândula Submandibular murino

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

O objetivo geral deste procedimento é administrar nanomateriais diretamente na glândula submandibular murina. A principal vantagem dessa técnica é que ela consegue a entrega direta de compostos à glândula submandibular enquanto ignora a circulação sistêmica. As implicações dessa técnica se estendem à terapia da disfunção das glândulas salivares após o tratamento com radiação para malignidade de cabeça e pescoço.Geralmente, indivíduos novos neste método podem ser desafiados localizando e canulando o ducto submandibular enquanto o animal está sedado. Para iniciar este procedimento, corte três centímetros de um tubo de cateter intracraniano de calibre 32 com fio inserido para formar uma extremidade chanfrada de aproximadamente 45 graus em relação ao eixo longo. Confirme se o fio é pelo menos um centímetro mais longo que a tubulação.Criar uma borda chanfrada para a tubulação facilitará a canulação ductal. Se o tubo ficar dobrado durante o procedimento, uma nova borda chanfrada deve ser cortada. Em seguida, carregue 50 microlitros de solução de nanopartículas de PSMA ou outro material de injeção em uma seringa Hamilton.Para reduzir a probabilidade de trauma de toca durante a injeção, co

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um protocolo para a canulação do mouse glândula salivar submandibular via ducto de Wharton, é descrito. Para este experimento, a solução de azul de tripano é usado como um tintureiro para demonstrar como esta técnica efetivamente oferece infusões na glândula alvo, e sugerir a confiabilidade dessa nova abordagem como uma potencial terapia medicamentosa / célula clínicos para a regeneração das glândulas salivares.

Canulação da glândula submandibular do rato através do duto salivar de Wharton

Este vídeo descreve uma técnica de injeção intraductal em que administramos uma mistura de injeção nos dutos das glândulas mamárias de camundongos.

Injeção intraductal: Aplicação da mistura de injeção nos ductos da glândula mamária do camundongo

O vídeo demonstra uma técnica de injeção guiada por ultrassom para administrar drogas terapêuticas nas glândulas salivares de um paciente humano.

Uma injeção guiada por ultrassom de drogas terapêuticas nas glândulas salivares humanas

Microscopia intravital é uma ferramenta poderosa que permite a imagem latente vários processos biológicos em animais vivos. Neste artigo, é apresentado um método detalhado para a imagem dinâmica das estruturas subcelulares, tais como os grânulos secretores, nas glândulas salivares de ratos vivos.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Um protocolo para a entrega intraductal não-invasivo de reagentes aquosas para a glândula mamaria do rato está descrito. O método aproveita injecção localizada nos mamilos das glândulas mamárias destinadas especificamente ductos mamários. Esta técnica é adaptável para uma variedade de compostos, incluindo o siRNA, agentes quimioterapêuticos e moléculas pequenas.

Injeção Intraductal para localizada Drug Delivery ao Rato glândula mamária

Linfonodos são os tecidos imunológicos que orquestram a resposta imune e são um alvo crítico para as vacinas. Os biomateriais têm sido empregados para melhor direcionar linfonodos e controlar a entrega de antígenos ou adjuvantes. Este artigo descreve uma técnica que combina essas ideias para injetar partículas de polímeros biocompatíveis em linfonodos.

Injeção de linfonodo intra-linfático de partículas de polímeros biodegradáveis

A hipofunção das glândulas salivares, um dos principais efeitos adversos da radioterapia de cabeça e pescoço, diminui a qualidade de vida do paciente. A demonstração da eficácia de novas terapias em modelos animais é um pré-requisito antes da transição clínica. Este protocolo descreve a administração retroductal e a irradiação local das glândulas submandibulares de ratos.

Retroductal submandibular Glândula instilação e localizada fracionado irradiação em um modelo de rato de salivar Hipofunção

Descreveremos um protocolo para cirurgicamente expor e estabilizar a glândula salivar submandibular murino para intravital imagem usando microscopia intravital vertical. Este protocolo é facilmente adaptável a outras glândulas exócrinas da cabeça e região do pescoço dos ratos e outros pequenos roedores.

Preparação de murino das glândulas salivares Submandibular para microscopia Intravital vertical

As glândulas salivares têm sido propostas como um local alvo tecidual para a terapia genética, especialmente na área de vacinação por transferência genética. Demonstramos a entrega de genes em um modelo de primata não humano utilizando infusão parotída retrógrada.

Infusão de glândula parotóide retrógrada através do duto de Stensen em um primata não humano para entrega de genes vetoriados

No presente protocolo, a função de barreira endotelial da glândula submandibular (SMG) foi avaliada por meio da injeção de diferentes marcadores fluorescentes de peso molecular nas veias angulares de modelos animais de teste in vivo sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons.

In vivo Detecção de Permeabilidade Vascular em Glândula Submandibular de Camundongo

A imagem por imunofluorescência é limitada pela capacidade de observar processos biológicos complexos e dependentes do tempo em apenas um único instantâneo no tempo. Este estudo descreve uma abordagem de imagem ao vivo conduzida em cortes de glândula submandibular de camundongos com corte preciso. Esta abordagem permite a observação em tempo real das interações célula-célula durante a homeostase e os processos de regeneração e reparo.

Interrogando interações célula-célula na glândula salivar via imagem de células vivas ex vivo

Aprenda a técnica de injeção retraductal de nanopartículas poliméricas na glândula submandibular murina para entrega direta de compostos, contornando a circulação sistêmica. Este método avança pesquisas em terapias para disfunção salivar.

Injeção de Retroductal de nanopartículas para a glândula Submandibular murino

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