Um modelo de alça Intestinal ligados em galinhas livres anestesiados patógeno específico para estudar a virulência de Clostridium Perfringens

Aqui nós apresentamos um protocolo para criar cirurgicamente 'intestinais laços ligados' no intestino de frango. Este procedimento permite a comparação de virulência em situ em um único host vários as estirpes Clostridium perfringens . Esse método marcadamente diminui o número de galinhas geralmente necessários para experimentos semelhantes na vivo .

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da pesquisa de Enteritis Necrotic De Frango. Como comparar a virulência de cepas específicas de clostridium que causam essa doença. A principal vantagem desta técnica é que ela reduz notavelmente o número de galinhas geralmente necessárias para experimentos ambientais semelhantes.

Embora este método possa fornecer uma visão sobre o potencial de virulência das cepas de clostridium perfringens, ele também pode ser aplicado a outros patógenos intestinais, como Clostridium difficile, ou Salmonella enterica. Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão porque os procedimentos cirúrgicos precisam de treinamento específico e só devem ser realizados por aqueles que adquiriram habilidades como sutura, técnicas anteriores ao experimento. Depois de anestesiar um frango leghorn livre de patógeno específico de 10 semanas, configure os monitores para medidas vitais e comece a remover manualmente as penas do abdômen por tração suave.

Em seguida, esfregue o local cirúrgico usando gluconato de clorexidina com uma escova de cerdas macias. Esfregue suavemente a pele do centro para a periferia por cinco minutos sem inverter o curso. Em seguida, realize três passagens alternadas no local cirúrgico com solução de colacote de clorexidina e álcool isopropílico usando gazes estéreis.

Novamente, vá do centro para a periferia, então, drape o frango. Comece abrindo a cortina acima do local cirúrgico, em seguida, faça uma incisão de pele média baixa em forma de L com um bisturi número três, começando um abraço centímetro ao esterno, e terminando em um centímetro cranial para a cloicha. Em seguida, continue a incisão em forma de L perpendicular ao primeiro fazendo uma segunda incisão começando na extremidade do abraço da primeira incisão e continue cinco centímetros para o lado esquerdo do abdômen seguindo a linha pélvis.

Esta abertura permitirá a fácil extração dos intestinos. Em seguida, abra os músculos peritônio e abdominal usando o mesmo padrão em forma de L para acessar a cavidade abdominal. Os sacos de ar serão agora expostos e devem ser mantidos úmidos usando gaze salina encharcada.

Em seguida, insira um gancho snook spay na cavidade abdominal seguindo a parede abdominal esquerda e trabalhando o gancho em torno dos sacos de ar abdominal para extrair os intestinos. Em seguida, usando gaze seca, continue exteriorizando suavemente os intestinos para expor o Jejunum. Espalhe os intestinos e mantenha-os úmidos com pulverização frequente com soro fisiológico e cobrindo-os com gaze salina encharcada.

É importante ser muito gentil ao retirar os intestinos porque a tensão excessiva pode romper os vasos mesentéricos que podem levar a lesões isquêmicas intestinais e comprometer muito o resultado do procedimento. Depois de exteriorizar os intestinos, faça uma série de laços nos intestinos começando no Jejunum. Cada loop pode ser usado para tratamento diferente.

No jejunum proximal, coloque uma ligadura simples com um material absorvente sintético poliglutamina multifilament, evitando a ligadura dos principais vasos mesentéricos. Em seguida, coloque uma ligadura distal a dois centímetros da ligadura proximal para completar o primeiro loop. Todas as ligaduras proximais e distais devem ser espaçadas por cerca de dois centímetros.

Cada par de ligaduras faz um loop, que é um segmento hermético. Em seguida, crie um interloop ou um segmento de intestino entre as alças. Coloque uma ligadura simples meio centímetro aborely à ligadura distal do primeiro loop.

Esta ligadura está no meio do interloop e diminuirá a possível contaminação cruzada entre as alças. Agora, continue o padrão de criar outro loop meio centímetro aborely aborely a partir da ligadura interloop. Aqui, nove loops e oito interloops são criados cobrindo 26 centímetros de intestino.

O número de loops pode ser ajustado conforme necessário. Em seguida, prossiga com a injeção de clostridium perfringens nos loops. No lado anti-mesentérico do loop, use uma agulha de calibre 26 em um ângulo de 45 graus para injetar 0,2 mililitros de solução BHI, contendo um milhão de colônias formando unidades de bactérias na fase de crescimento do midlog.

Nesta situação, com nove loops, cinco cepas diferentes são injetadas em loops alternados com as alças intervenientes injetadas apenas com o veículo como controles negativos. Depois de injetar os patógenos, substitua suavemente o trato intestinal para a área dorsal da cavidade abdominal sob os sacos de ar. Então, feche a cavidade abdominal.

Sutura os músculos peritônio e abdominal ao longo da pelve com um simples padrão de sutura contínua usando um material absorvente sintético poliglutamina multifilament. Continue suturando os músculos peritônio e abdominal do esterno ao cloiche usando suturas contínuas simples. Em seguida, suturar a pele perto usando um material sintético Poliglutamina Multifilament e um padrão contínuo simples.

Primeiro, sutura ao longo da pélvis, em seguida, sutura do esterno para o cloiche. Após o fechamento das incisões, mantenha o frango sob anestesia geral com o uso adequado de analgésicos para minimizar a dor animal durante o tempo de infecção. Continue o monitoramento anestésico para garantir um nível adequado de anestesia.

Após o tempo desejado de infecção, como sete horas no presente experimento, eutanize a ave e colete os tecidos intestinais. Usando um bisturi número três, corte uma seção de loop de meio a um centímetro. Em seguida, transfira a seção para 10% Formalin para fixação noturna e posterior análise histopatológica.

Em seguida, use a mesma lâmina de bisturi no mesmo laço para cortar o restante do laço e transferir esse tecido para um tubo microfusado para o isolamento das bactérias. Repita este procedimento para cada loop usando uma nova lâmina de bisturi cada vez. Sete horas após a injeção, uma alça intestinal injetada com um meio controle estéril tem uma borda de escova mucosa intacta sem necrose.

Congestionamento leve nas camadas intestinais dos segmentos não é incomum. Sete horas após a injeção com o patógeno, Clostridium perfringens, pontas de villi são corroídas com locais de entrada necrosado ao redor das pontas. E então material necrosado ao redor do villi, há aglomerados de grandes bactérias em forma de vara.

Às vezes, a necrose é devido à má execução processual e pode ser mal interpretada como lesões produzidas por bactérias. Um sinal revelador é a ausência de bactérias na seção histológica. Além disso, os vasos sanguíneos da camada muscular são severamente dilatados pelo acúmulo de muitos eritrócitos degenerados indicativos de congestionamento vascular.

Isso foi causado por vasos sanguíneos mesentéricos ligados que provavelmente foram ligados para fazer esforço físico excessivo nos intestinos. As alças isquêmicas podem ser facilmente identificadas microscopicamente durante os procedimentos cirúrgicos. Após um congestionamento vascular severo alguns minutos após a ligadura, o serosa será azul escuro em vez de sua coloração rosa normal avermelhada.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar múltiplas alças intestinais em um modelo de frango colocando ligaduras nos intestinos. Uma vez dominados os procedimentos cirúrgicos, excluindo o tempo de infecção, podem ser feitos em menos de três horas, se for realizado corretamente. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar de manter o frango sob anestesia profunda para controlar a dor e monitorar sinais vitais durante todos os procedimentos, incluindo parte cirúrgica e tempo de infecção.

Seguindo este procedimento ou seus métodos como isolamento bacteriano, e identificação direta, como detecção de genes por PCR, podem ser realizadas a fim de responder a perguntas externas como recuperação e identificação do patógeno injetado inicial. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo de Clostridium perfringens patogênese explorarem enterite necrosada em galinhas. Não se esqueça que trabalhar com animais vivos pode ser extremamente variável.

E precauções como o monitoramento anestésico contínuo do frango devem ser sempre feitas durante a realização deste procedimento.