Name: Entrega de vírus de CRISPR guias de próstata murino para alteração do Gene (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Aprenda a entrega viral de CRISPR/Cas9 na próstata murina para edição gênica ortotópica. Este método permite alterar expressão gênica e estudar câncer de próstata in vivo.

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Senhor foi financiado por uma bolsa de estudos da sociedade dinamarquesa do câncer (R146-A9394-16-S2). MFB e MKT foram financiados por AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). Senhor e MFB foram co-financiados pela escola de pós-graduação, saúde, AU. O laboratório E.F.W. é suportado por subvenções do Ministério espanhol de economia (SAF2015-70857, co-financiado pela União Europeia FEDER-) e um ERC avançado grant (741888 - CSI-diversão).
Queremos agradecer a Liliana Fajardo Mellor (Genes, desenvolvimento e doença; National Cancer Research Center) para uma leitura crítica do manuscrito.

Este protocolo envolve um procedimento cirúrgico em ratos de laboratório. Todas as experiências em animais devem ser revisadas e aprovadas por um cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) individualmente. Como a abordagem é baseada na sobrevivência e recuperação animal, certifique-se de anestesia adequada, controle da dor e um ambiente cirúrgico asséptico em todos os tempos. Use uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia durante a cirurgia e até a recuperação da anestesia.
1. considerações de partida
<ol><li>Dependendo o vírus usado, podem aplicar os requisitos de título diferente; Dilua o vírus em conformidade. Nota: Neste exemplo, um vírus Adeno-associado, diluído em PBS é injetado em um título de 1 x 1012 UI/mL. O vírus tem serótipo 9 e contém RNA guia a Pten e expressão da proteína Cre sob um promotor da ubiquitina (Figura 1). Perda de Pten aumentou pAKT e proliferação do epitélio prostático13.</li>
	<li>Use Camundongos machos em idade de 8 semanas no momento da cirurgia para garantir o adequado desenvolvimento da próstata. Nota: Ratos mostrados neste experimento são ratos de knockin Rosa26-LSL-Cas9-EGFP em C57BL/6J fundo12 (Figura 1).</li>
	<li>Recentemente, preparar uma mistura de anestesia geral e se possível mantê-lo estéril. Nota: Para melhor recuperação animal após a cirurgia, um antídoto de anestesia é altamente recomendado.<ol>
<li>Para preparar um volume total de 5 mL de anestésico, misture cloridrato de medetomidina 0,15 mL (1 mg/mL), 0,4 mL midazolam (5 mg/mL) e butorfanol 0,25 mL (10 mg/mL) com 4,2 mL água salina estéril. Nota: Métodos alternativos de anestesia, como isoflurano inalável, podem ser usados de acordo com as orientações institucionais cuidados com animais.</li>
		<li>Para reverter o efeito do pós-operatório cloridrato de medetomidina, misture atipamezole 0,1 mL (5 mg/mL) com 4,9 mL de água salina estéril.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare um ambiente asséptico cirúrgico adequada desinfecção e esterilização. Instrumentos cirúrgicos de autoclave antes de usar.</li>
</ol>2. vírus-entrega à próstata murino
<ol><li>Anestesia o animal por injeção intraperitoneal com uma seringa estéril 1 mL e uma agulha 27 x ½". Use uma dose de anestesia de 0,01 mL/g de massa corporal. Se o procedimento dura mais de 30 min, manter anestesia pela injeção de 1/3 do iniciar dose a cada 30 min.</li>
	<li>Examine a profundidade anestésica avaliando o relaxamento muscular, retirada de pedal e reflexos palpebrais. Quando observa-se perda de reflexos, raspe o abdômen inferior do animal.</li>
	<li>Cuidadosamente, cubra os olhos do animal com veterinária pomada oftálmica usando um cotonete estéril para prevenir a cegueira devido à falta de reflexo corneal.</li>
	<li>Limpe o abdômen raspado com 70% de etanol e 10% povidona iodo para desinfetar a área cirúrgica. Esfregue a área cirúrgica do centro da área cirúrgica em direção a periferia.</li>
	<li>Realize uma incisão vertical da pele na linha baixa-abdominal de aproximadamente 1 cm, usando uma tesoura cirúrgica estéril.</li>
	<li>Levante o peritônio usando uma pinça de ponta fina para não danificar os órgãos que estão lançando por baixo. Cuidadosamente fazer uma incisão de 8 mm de < usando tesoura cirúrgica através do peritônio. Nota: Em contraste com os humanos, glândula de próstata de um roedor é composto por quatro lóbulos separados. O lobo anterior é anexado para a vesícula seminal.</li>
	<li>Movimente suavemente o tecido gordo à parte para descobrir a vesícula seminal. Usando uma pinça de anel, levante cuidadosamente a vesícula seminal até a próstata anterior pode ser identificado (Figura 1).</li>
	<li>Injete um volume total de solução de vírus (3 x 1010 partículas virais) 30 µ l no epitélio anterior da próstata, utilizando uma seringa de insulina de 0,5 mL com agulha 30 x 8 mm. Minimizar o escapamento e garantir que o fluido é absorvido dentro do tecido, formando uma pequena bolha. Coloque a vesícula seminal volta na cavidade abdominal.</li>
	<li>Suture o peritônio com 2-3 pontos interrompidos simples, usando 6-0 reabsorvível com um 13 mm, 3/8 círculo e uma agulha de ponta cónica.</li>
	<li>Grampo da pele com 3 clipes de estéril 4.8 x 6.5 mm, levantando a pele com pinças para não danificar o peritônio.</li>
	<li>Para melhor recuperação, aplica o antídoto de anestesia em dose de 0,01 mL/g de massa corporal por injeção intraperitoneal, usando uma seringa estéril 1 mL e uma agulha 27 x ½". Cuidadosamente coloque a animal de volta em sua jaula.</li>
</ol>3. pós-operatório procedimentos
<ol><li>Manter a gaiola com ratos que passou por uma cirurgia em uma almofada de aquecimento para 1 h após o procedimento, para evitar a hipotermia até totalmente recuperado. Se o antídoto for aplicado, o animal deve ser acordado alguns minutos após a injeção.</li>
	<li>Monitore os animais diariamente para indicações de cura e dor ferida apropriado. Se necessário, administre analgésicos adicionais de acordo com as orientações institucionais cuidados com animais.</li>
	<li>Remova os clipes de pele após 4-5 dias, uma vez que a ferida é fechada.</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+incidence+and+mortality+worldwide%3A+sources%2C+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454(2015).</li>
<li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19937345">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li>
<li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+JUNB%2FAP-1+promotes+invasive+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy%2C+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li>
<li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li>
<li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+prostate%3A+an+historical+survey+of+divergent+views%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste protocolo, descrevemos um método para alterar a expressão do gene no lóbulo anterior da próstata murino pela injeção do vírus, criando um novo modelo de rato poderoso para câncer de próstata (Figura 2). A administração bem sucedida de um adenovírus foi primeiramente descrita por Leow et al . em 20058. Anteriormente mostramos como um adenovírus que codifica para uma proteína de recombinase Cre pode substituir demorado cruzamento de um alelo Cre para excl...

Detecção e tratamento do câncer de próstata têm melhorado significativamente na última década. Ainda assim, a incidência de câncer de próstata está aumentando, seguindo a expectativa de vida. Com um estimado 1,1 milhões de novos casos em todo o mundo, está entre as causas mais comuns de morte por cancro em homens 1. Câncer de próstata é lento em seu desenvolvimento, mas quando o câncer progrediu para um estado metastático avançado, o prognóstico é pobre devido a opções de tratamento limitado. Até agora, apenas alguns genes têm sido identificados como os drivers comuns nesse tipo de câncer, e sua heterogeneidade e multifocality impede a deteção de biomarcadores e doença targetable motoristas2,3.
Técnicas clássicas de geração GEMMs são muitas vezes prejudicadas pela sua complexidade, oportunas despesas e custos. Modelos de nocaute condicionais foram amplamente utilizados para estudar os genes candidatos de câncer de próstata, que resultam em embrionária letalidade quando inativado no germline4. Modelos mais comuns envolvem uma recombinase Cre de específico da próstata guiado por qualquer um Probasin modificado5 ou um promotor de6 PSA integrado no GEMM por cruzamentos adicionais. Nestes modelos, o gene de interesse será orientado na maioria das células epiteliais da próstata, gerando hiperplasia no órgão inteiro, que pode prejudicar trato urinário função7 do animal.
Entrega viral da proteína Cre por injeção para o lobo anterior da próstata murino pode resolver esse problema, orientando apenas algumas células8. Os pré-requisitos técnicos de laboratórios, expertise e objectivos, tendo em conta os benefícios do método de uma ampla gama de variações possíveis. Abordagens de sucesso utilizando adenovírus visando JunB e Pten9 ou Lentivirus direcionamento Pten e Trp5310 foram mostradas entre outros. Adição de transgenes, tais como luciferase, para construção de viral ou o GEMM além disso permitirá monitoramento não-invasivo de progressão da doença através de bioluminescência imagem11.
Genoma de edição com base na tecnologia CRISPR/Cas9 revela uma oportunidade nova e rápida para estudar o câncer através de geração rápida de nocautes somática12. Viral entrega de RNAs de guia única (sgRNAs) direcionada para o lobo anterior da próstata murino estabelece um modelo fisiologicamente mais relevante do câncer de próstata. Por este meio, únicas pilhas carregando mutações escolhidas podem formar clones que são capazes de expansão e invasão. Além disso, o uso da guia RNAs para múltiplos genes alvo irá gerar clones de células com alterações em genes diferentes. Isso permitirá que a heterogeneidade do tumor e uma pressão de seleção natural na progressão do câncer, que pode revelar a importância de cada alteração do gene ou mecanismos epistatic.
Aqui nós apresentamos um método para entregar partículas virais para a próstata murino para alteração da expressão genética. Por uma pequena incisão abdominal, o lobo da próstata anterior murino é exposto e partículas virais são injetadas para o lobo. Cinco dias clipes pós-cirurgia, cirurgia podem ser retirados a pele e o câncer da próstata pode ser analisado de 8 semanas depois. Globalmente, este é um procedimento rápido e eficiente, que tem pouco impacto sobre o mouse e permite maior tumor desenvolver sem comprometer o mouse.

<table><tbody><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J camundongos</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>26175</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml U-100 seringa de insulina</td><td>BD</td><td>324825</td><td>para injeção de vírus</td></tr> 1 <tr><td>ml seringa</td><td>BD</td><td>300013</td><td>para injeção de anestesia</td></tr><tr><td>30 G 1/2' ' agulha</td><td>BD</td><td>304000</td><td>para injeção de anestesia</td></tr><tr><td>6-0 Polysorb Sutura</td><td>Medtronic</td><td>GL889</td><td>para fechar o peritônio</td></tr><tr><td>Cirurgia esterilizada descartável drapejar</td><td>vários fornecedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>vários fornecedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almofada de preparação de iodo de povidona</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-70</td><td></td></tr><tr><td>Aparar máquina</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>para raspar o abdômen</td></tr><tr><td>Fórceps Dumont</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Halsey Micro Porta-agulhas</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de íris</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps de padrão estreito</td><td>FST</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de anel</td><td>FST</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>Alça do Sistema de Clipe de Ferida incl. Clipes</td><td>FST</td><td>12030-01</td><td>para fechar a pele</td></tr><tr><td>Removedor de Sistema de Clipe de Ferida</td><td>FST</td><td>12030-04</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica</td><td></td><td>diferentes modelos foram usados</td></tr><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td></td><td></td><td>obtido do biotério</td></tr><tr><td>Butorfanol</td><td></td><td></td><td>obtido do biotério</td></tr><tr><td>Medetomidina clorido</td><td></td><td></td><td>obtido do biotério</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td></td><td></td><td>obtido do biotério</td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para os olhos</td><td>Takeda</td><td>7242</td><td></td></tr><tr><td>Vírus (AAV, AV)</td> <td>vários fornecedores</td><td></td><td>vírus usado neste protocolo é um</td></tr><tr><td>anticorpo pAKT</td> de produção interna <td>CST</td><td>4060</td><td>usado 1:200 dillution</td></tr><tr><td>GFP anitbody</td><td>CST</td><td>2956</td><td>usado 1:100 dillution</td></tr></tbody></table>

entrega de vírus de crispr guias de próstata murino para alteração do gene

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Com um aumento da incidência de câncer de próstata, identificação de novos drivers de tumor ou moduladores é crucial. Modelos de rato geneticamente modificados (GEMM) para câncer de próstata são dificultados pela heterogeneidade do tumor e sua dinâmica complexa de microevolução. Câncer de próstata tradicional rato modelos incluem, entre outros, da linha germinal e condicionais nocautes, transgénico expressão de oncogenes e modelos de enxerto. Geração de mutações de novo nesses modelos é complexa, demorada e dispendiosa. Além disso, a maioria dos modelos tradicionais alvo a maioria do epitélio da próstata, Considerando que o câncer de próstata humano é bem conhecido a evoluir como um evento isolado em apenas um pequeno subconjunto de células. Modelos valiosos precisa simular não só a iniciação do câncer de próstata, mas também progressão de doença avançada.
Aqui nós descrevemos um método para algumas células no epitélio da próstata por transducing células-alvo por partículas virais. A entrega de um vírus projetado para a próstata murino permite a alteração da expressão gênica no epitélio da próstata. Quantidade e tipo de vírus pelo presente irão definir o número de células alvo para a alteração do gene por transducing algumas células para iniciação de cancro e muitas células para a terapia de gene. Através de injeção com base em cirurgia no lóbulo anterior, distal da trilha urinária, o tumor neste modelo pode expandir sem prejudicar a função urinária do animal. Além disso, pela segmentação apenas um subconjunto de células epiteliais da próstata a técnica permite a expansão clonal do tumor e, portanto, imita a iniciação de tumor humano, progressão, bem como a invasão através da membrana basal.
Esta nova técnica fornece um modelo poderoso câncer de próstata com maior relevância fisiológica. Sofrimento dos animais é limitado, e desde que a procriação não adicional for necessária, contagem global animal é reduzida. Ao mesmo tempo, análise de novos genes candidatos e caminhos é acelerada, que, por sua vez, é mais custo eficiente.

Para avaliar a entrega do vírus para a próstata murino, as amostras foram analisadas três meses após a cirurgia. O Rosa26-LSL-Cas9-EGFP ratos12 express GFP nas células que foram expostas à proteína Cre expressa pelo vírus. As amostras da próstata foram examinadas com uma microscopia de fluorescência para identificar áreas com sinal GFP (Figura 2A). O sinal GFP indica atividade Cre no epitélio da próstata, mas não se gene edição tem sid...

Este protocolo descreve um método recentemente estabelecido para a entrega do vírus para a próstata murino. Usando tecnologia CRISPR/Cas9, superexpressão do gene ou entrega de recombinase Cre, a técnica permite ortotópico alteração da expressão gênica e implementa um modelo de romance do rato para câncer de próstata.

Entrega de vírus de CRISPR guias de próstata murino para alteração do Gene

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

O objetivo geral deste procedimento cirúrgico é alterar a expressão gênica na próstata murina pela entrega viral de guias CRISPR Cas9 para indução do câncer de próstata. Este método pode ajudar a abordar novas questões na biologia do câncer de próstata no que diz respeito à análise e validação de novos genes em um ambiente in vivo. As principais vantagens dessa técnica é que ela permite a edição rápida de vários genes, visando apenas um subconjunto das células prostáticas como visto no cenário humano.Alguém que é novo no procedimento pode ter dificuldades no início por causa do tamanho do órgão e da precisão necessária para uma conclusão cirúrgica bem-sucedida. Para preparar um volume total de 5 mililitros de anestésico, misture 0,15 mililitros de um mg por mililitro de cloridrato de medetomidina, 0,4 mililitros de 5 mg por mililitro de midazolam e 0,25 mililitros de 10 mg por mililitro de butorfenol. Em seguida, adicione 4,2 mililitros de água salina estéril.Para reverter os efeitos do cloridrato de medetomidina após a cirurgia, misture 0,1 mililitro de 5 mg por mililitro de atipamezol com 4,9 mililitros de água salina estéril como antídoto anestésico. Prepare um ambiente cirúrgico asséptico por meio de desinfecção e esterilização adequadas e autoclave os instrumentos cirúrgicos. Entregar o vírus à próstata, após anestesiar um camundongo macho de oito semanas de idade de acordo com o protocolo de texto; Examine a profundidade do anestésico avaliando o relaxamento muscular, a retirada do pedal e os reflexos palpáveis.Quando for observada perda de reflexos, raspe a parte inferior do abdômen do animal. Usando um cotonete estéril, cubra cuidadosamente os olhos do animal com pomada oftálmica veterinária para evitar a cegueira causada pela xeroftalmia. Em seguida, use 70% de etanol e 10% de iodo de providona para limpar o abdômen raspado para desinfetar a área cirúrgica.Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica estéril, faça uma incisão vertical na pele de aproximadamente um centímetro na linha média abdominal baixa. Em seguida, com uma pinça de ponta fina, levante o peritônio para evitar danificar os órgãos que estão por baixo; e use uma tesoura cirúrgica para fazer cuidadosamente uma incisão de oito milímetros ou menos através do peritônio. Mova suavemente o tecido adiposo para o lado para descobrir a vesícula seminal.Em seguida, usando uma pinça de anel, levante cuidadosamente a vesícula seminal até que a próstata anterior possa ser identificada. Agora, com uma seringa de insulina de 0,5 mililitro e uma agulha de calibre 30 de 8 milímetros; Injetar um volume total de 30 microlitros de solução viral no epitélio anterior da próstata. Minimize o vazamento e certifique-se de que o fluido seja absorvido dentro do tecido, formando uma pequena bolha.Em seguida, coloque a vesícula seminal de volta na cavidade abdominal. Para garantir que o fluido seja absorvido dentro do tecido em uma pequena bolha e sem vazamento, certifique-se de injetar paralelamente à vesícula seminal e seguindo a forma do lobo anterior da próstata. Com uma agulha de ponta cônica e um círculo 3/8 de 13 milímetros, suturar o períneo com dois a três pontos simples interrompidos de sutura absorvível 6-0.Em seguida, levantando a pele com uma pinça para evitar danificar o peritônio; grampeie a pele com três clipes estéreis de 4,8 por 6,5 milímetros. Para uma melhor recuperação após a cirurgia, use uma seringa estéril de 1 mililitro e uma agulha de calibre 27 por 1/2 polegada para administrar o antídoto anestésico na dose de 0,1 mililitros por grama de peso corporal por injeção intraperitoneal. Em seguida, coloque cuidadosamente o animal de volta em sua gaiola.Mantenha a gaiola em uma almofada de aquecimento por uma hora após o procedimento para evitar hipotermia até que esteja totalmente recuperada. O animal deve acordar alguns minutos após a injeção. Continue monitorando e tratando o animal diariamente de acordo com o protocolo de texto.E, quando a ferida estiver fechada, remova os clipes de pele. Para avaliar a entrega do vírus à próstata murina, as amostras foram analisadas três meses após a cirurgia. Como mostrado aqui, os camundongos usados neste estudo expressaram GFP em células que foram expostas à proteína Cree expressa pelo vírus.O sinal GFP mostra a atividade Cree no epitélio da próstata, mas não se a edição de genes foi induzida pelo guia CRISPR. Esses cortes imuno-histoquímicos identificam áreas focais de células com altas expressões de pAKT, indicando perda de P10. Nesses painéis, a cocoloração para pAKT e GFP identificou células duplamente positivas, o que confirmou a transformação das células prostáticas pelo vírus adeno-associado.No geral, esses resultados mostram que, in vivo, a edição do gene CRISPR-Cas9 pode ser realizada no epitélio da próstata usando o camundongo Rosa26-LSL-Cas9-EGFP e o vírus adeno-associado. Uma vez dominado, o procedimento pode ser feito em 15 minutos. Essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo do câncer de próstata para examinar vários genes com in vivo simultâneos.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fornecer substrato à próstata murina. Não se esqueça que ao trabalhar com alguns vírus pode ser extremamente perigoso e cuidados devem sempre ser tomados ao fazer esses procedimentos.

virus-delivery-crispr-guides-to-murine-prostate-for-gene

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo descreve um método para editar genes específicos em células da próstata usando um sistema de entrega baseado em adenovírus. A abordagem permite a alteração ortotópica e localizada da expressão gênica utilizando a tecnologia CRISPR para desenvolver novos modelos de camundongos para câncer de próstata.

Modelagem do câncer de próstata em modelos de camundongos geneticamente modificados: uma técnica de edição de genes localizada mediada por CRISPR/Cas9 em células do lobo anterior da próstata de camundongos

O sistema / Cas9 CRISPR oferece o potencial para fazer genoma segmentado edição acessível e disponível para a comunidade científica. Este protocolo destina-se a demonstrar como criar vírus que vai nocaute um gene de interesse utilizando o sistema / Cas9 CRISPR, e depois injetá-las estereotáxicamente no cérebro do rato adulto.

Concepção, embalagem, entrega e de alto título CRISPR retro e lentivírus via estereotáxica Injection

Um protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediada disrupção do gene no mouse e células hematopoiéticas primárias humanas é descrito neste artigo. Ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA são introduzidas através de eletroporação com sgRNAs gerados através da transcrição em vitro e Cas9 comercial. Alta eficiência de edição é obtida com tempo limitado e custo financeiro.

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

O objetivo do presente protocolo é demonstrar a injeção intrabenigna de células de câncer de próstata, com posterior castração. Ortotópico modelos pré-clínicos de câncer de próstata andrógeno-dependentes e resistente a castração são críticos para estudar a doença no contexto de um microambiente do tumor clinicamente relevantes e um host imunocompetentes.

Um modelo murino de ortotópico bioluminescentes e fluorescente Syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e castração resistente

Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para realizar na vivo edição de gene cardíaca em ratos usando recombinantes Adeno-Associated vírus (rAAV)-mediada entrega de CRISPR. Este protocolo oferece uma promissora estratégia terapêutica para tratar a cardiomiopatia distrófica em distrofia muscular de Duchenne e pode ser usado para gerar o nocaute cardíaco-específicas em ratos pós-natal.

Entrega de mediada por vírus adeno-associado de CRISPR para Gene cardíaco em ratos de edição

Nós descrevemos um método novo para a entrega do plasmídeo de DNA em células uroteliais do rato bexiga na vivo através de cateterismo de uretra e eletroporação. Oferece uma maneira rápida e conveniente para gerar modelos de rato autóctone de doenças da bexiga.

Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação

Aqui descrevemos uma metodologia rápida e direta de triagem in vivo CRISPR/Cas9 utilizando ultrassom guiado em injeções lentiviras embrionárias uterobrionárias para avaliar simultaneamente funções de vários genes na pele e cavidade oral de camundongos imunocompetrente.

Triagem In Vivo CRISPR/Cas9 para avaliar simultaneamente a função genética na pele do rato e na cavidade oral

O presente protocolo descreve uma única mutação M213L em Gja1 que retém a geração Connexin43 em comprimento completo, mas impede a tradução do isoforme traduzido internamente GJA1-20k.

Remoção de um local de início de tradução interna do mRNA enquanto retém a expressão da proteína de comprimento completo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de edição de genes de edição de genes (CRISPR) regularmente interespaçado de alto rendimento para análise de rede de clusters microRNA que permite a geração rápida de um painel de linhas celulares geneticamente modificadas carregando combinações únicas de exclusão de membros de cluster miRNA de até 35 kb dentro de um único experimento.

Ferramenta de edição de genes CRISPR para análise de rede de cluster microrna

Aqui, descrevemos uma técnica simples destinada à geração eficiente de camundongos geneticamente modificados chamada CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Este método fornece reagentes de edição por eletroporação em embriões a uma eficiência próxima de 100%. Este protocolo é eficaz para mutações pontuais, pequenas inserções genômicas e deleções em embriões de mamíferos.

Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

Apresentamos um protocolo para transdução retroviral de RNA guia em células T primárias de camundongos transgênicos Cas9, fornecendo uma alternativa eficiente para edição gênica no estudo da diferenciação Th17.

Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro

Aprenda a entrega viral de CRISPR/Cas9 na próstata murina para edição gênica ortotópica. Este método permite alterar expressão gênica e estudar câncer de próstata in vivo.

Entrega de vírus de CRISPR guias de próstata murino para alteração do Gene

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