Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

O objetivo geral deste experimento é visualizar interneurônios GABAérgicos corticais geneticamente modificados durante a migração tangencial no ambiente mais naturalista possível. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nas neurociências do desenvolvimento, rastreando o impacto da perda de função de genes específicos de proteínas durante o desenvolvimento do cérebro. A principal vantagem desta técnica é que ela é de baixo custo e relativamente fácil de executar em comparação com outros métodos semelhantes, como a eletroporação no útero.

Portanto, essa técnica pode melhorar o diagnóstico de pacientes com distúrbios genéticos do neurodesenvolvimento, como autismo e epilepsia, esclarecendo a patogenicidade de mutações específicas identificadas em pacientes, bem como os papéis de novos genes de doenças durante o desenvolvimento do cérebro. Comece montando o gabinete de biossegurança com todos os instrumentos necessários para dissecação e cultura. Pulverize generosamente todos os instrumentos no gabinete de biossegurança com etanol 70% e esterilize os instrumentos e o interior do gabinete com luz ultravioleta por 15 a 20 minutos.

Quando estiver pronto para coletar embriões, borrife generosamente o abdômen da mãe eutanasiada com 70% de etanol. Puxe a pele abdominal para cima com uma pinça esterilizada e, com a outra mão, use uma tesoura cirúrgica esterilizada para cortar a pele do abdômen. Com uma segunda pinça e tesoura esterilizadas, puxe a fáscia abdominal para cima e corte-a, evitando cuidadosamente o útero.

Usando um terceiro par de pinças e tesouras esterilizadas, segure os chifres uterinos e corte-os da cavidade pélvica. Coloque os chifres uterinos dissecados em um petrídish estéril de 60 milímetros preenchido com meio de cultura lebovitz de base neural suplementado com aminoácidos, vitaminas e sais inorgânicos. No gabinete de biossegurança estéril, use dois pares de pinças finas para dissecar os embriões da placenta e isolar as cabeças por decapitação.

Corte chanfrado a ponta de uma pipeta de transferência de plástico estéril de três mililitros e use-a para aspirar as cabeças e transferi-las para uma nova placa de Petri estéril de 60 milímetros preenchida com o mesmo meio de cultura neural suplementado para lavar o sangue. Transfira-os novamente para uma terceira placa de Petri em camadas com cera preta solidificada e preenchida com meio de cultura suplementado de base neural. Coloque a placa de Petri de 16 milímetros em camadas com cera preta e contendo as cabeças decapitadas em meio de cultura suplementado de base neural sob o microscópio de dissecação na cabine de biossegurança.

Use uma pinça fina segurada na mão esquerda para estabilizar a cabeça com a parte rostral voltada para a direita. Em seguida, use o nano injetor na mão direita para injetar um a dois microlitros da solução de plasmídeo enriquecido com corante no ventrículo lateral direito. Eletropore o cérebro injetado colocando a cabeça entre os eletrodos com o eletrodo negativo posicionado dorsalmente e paralelo à cabeça e o eletrodo positivo em direção ao lado ventral da cabeça para atingir o MGE.

Uma vez que os eletrodos estejam bem posicionados, forneça pulsos quadrangulares de 40 volts por 50 milissegundos em intervalos de 500 milissegundos. Enquanto ainda trabalha no ambiente estéril do gabinete de biossegurança, comece a dissecar o cérebro para fora do crânio. Primeiro, estabilize a cabeça na camada de cera preta inserindo uma agulha em cada olho, evitando cuidadosamente o cérebro.

Em seguida, use uma pinça fina para segurar o lado esquerdo do pescoço e uma segunda pinça fina para rasgar a pele do crânio de trás para frente. Enquanto segura a cabeça lateralmente com uma pinça em uma mão, use outra pinça na outra mão para cortar cuidadosamente o crânio no nível do tronco cerebral e puxar o crânio para cima. Com cada pinça, corte o crânio no plano sagital em direção à frente e, em seguida, faça uma incisão lateral para liberar os fragmentos do crânio.

Em seguida, levante o tronco cerebral e corte cuidadosamente as meninges e os nervos cranianos até que o cérebro esteja completamente fora do crânio. Encha uma placa de Petri de 35 milímetros com solução de agarose derretida mantida líquida a 42 graus Celsius. Em seguida, transfira rapidamente um cérebro eletroporado para o prato cheio de agarose usando a pipeta de transferência previamente cortada.

Mexa a agarose com um bastão de metal para manter o cérebro no meio do poço para evitar que afunde e posicione o cérebro em um plano caudal rostral paralelo ao prato. Pare de mexer quando a agarose começar a solidificar para evitar qualquer dano ao cérebro. Enquanto espera que a incorporação de agarose solidifique, transfira 750 microlitros de meio de cultura suplementado com N2 em cada poço da placa de cultura de seis poços de acordo com o número de cérebros a serem processados.

E coloque uma inserção de membrana de 30 milímetros em cada meio preenchido. Use uma lâmina de barbear para cortar a agarose ao redor do cérebro para formar um bloco retangular, deixando uma margem de um a dois milímetros ao redor do cérebro. Certifique-se de que a parte rostral do cérebro esteja perpendicular ao limite anterior do bloco para facilitar a orientação para as etapas de secção subsequentes.

Cole o bloco de agarose na borda rostral da plataforma vibratome voltada para baixo e na borda ventral voltada para o usuário. Corte o cérebro em seções coronais para obter seções de 250 mícrons de espessura a quatro graus Celsius. Com espátulas esterilizadas, colete duas a três seções contendo o MGE e coloque todas as seções cerebrais de um animal em uma única inserção de membrana de 30 milímetros.

Evitando cuidadosamente a sobreposição entre as seções. Coloque a placa de cultura em uma incubadora estéril ventilada a 37 graus Celsius com 60% de umidade e cinco por cento de CO2 por 48 ou 72 horas. Após o tempo de incubação desejado, transfira as seções de interesse para uma lamínula de oito câmaras preenchida com três a cinco microlitros de meio de cultura.

Coloque a lamínula em uma câmara ambiental, conecte-a a um confocal de disco giratório invertido equipado com um software de aquisição assistido por computador para configurar a sessão de imagem com lapso de tempo. Interneurônios eletroporados em E 13,5 com um plasmídeo experimental expressando o de tomate TD e e SH RNA direcionado a um gene de interesse são vistos em migração tangencial em uma fatia de cérebro organotípica obtida de um embrião de camundongo DLX5 6Cre RCEE GFP após 48 horas de cultura. Os interneurônios foram visualizados usando imagens ao vivo com lapso de tempo por oito horas.

Neste exemplo, o mesmo interneurônio eletroporado é visto no processo de nucleocinese. Enquanto migra tangencialmente no córtex paralelo à superfície da casca. O neurônio inicialmente exibe um corpo celular alongado no processo de nucleocinesia.

Bem como um processo de trailing e um processo de entrelinha ramificado. Após três horas de imagens ao vivo, a nucleocinese é concluída. O processo de trailing se retraiu e o processo principal está estendendo dois longos ramos.

Após cinco horas e 30 minutos, um dos principais ramos do processo se retraiu e o corpo celular do neurônio avançou cerca de 10 mícrons. Finalmente, após oito horas de imagens, a migração parou, o neurônio estendeu seu processo principal novamente e um processo de rastreamento apareceu. Mas o núcleo ainda não avançou.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante manter um ambiente estéril em todos os momentos possíveis. Assim, seguindo esses procedimentos, outros métodos, como eletroporações de MG seguidas de explantes, podem ser realizados para abordar questões adicionais para obter respostas para elucidar os processos dinâmicos do citoesqueleto que ocorrem durante a migração neuronal no nível ultracelular.