Name: Culturas Organotypic tridimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda a estabelecer culturas organotípicas tridimensionais de órgãos vestibulares e auditivos de murinos usando géis de colágeno I. Este método preserva a arquitetura tecidual e permite estudos de sinalização mecânica e molecular no desenvolvimento da orelha interna.

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Agradecemos o Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi e r. Petelski por suas contribuições para a pesquisa original em que se baseia este protocolo. Agradecemos também J. lhamas e W. Makmura para assistência técnica e criação de animais. Reconhecemos o subsídio de formação NIDCD T32 DC009975, NIDCD conceder R01DC015530, fundo de desenvolvimento terapêutico Robertson e Fundação da família Caruso para financiamento. Finalmente, reconhecemos o apoio do Howard Hughes Medical Institute, da qual Dr. Hudspeth é um investigador.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado Animal e uso comissões da Rockefeller University e da University of Southern California.
1. (opcional) preparação de colágeno solução de tendões Mouse-tail
Nota: Colágeno soluções estão disponíveis comercialmente. Siga as instruções do fabricante para preparação do gel.
<ol><li>Eutanásia em 5-10 ratos de jovem adulto (3-5 semanas de idade) de qualquer estirpe de tipo selvagem com dióxido de carbono em conformidade com o protocolo aprovado pelo institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização relevantes16. Recolher as caudas e desinfectar os submergindo em etanol a 70% por um período mínimo de 4 h à temperatura ambiente. Nota: Incubação por mais de 48 h deve ser evitada, pois resulta em desidratação excessiva de tecido e dificulta o processo de extração do tendão.</li>
	<li>Retire a pele de cada cauda apresentando um corte longitudinal com uma lâmina de bisturi e retraindo a pele inteira com fórceps. Transferi as caudas de pele para um prato de Petri de 100mm preenchido com etanol a 70% limpa e corte-as em segmentos de 10 mm. Nota: Descarte as partes mais finas das caudas, que são difíceis de manipular.</li>
	<li>Usando fórceps, fixe cada segmento da cauda para o fundo da caixa de Petri e usar um segundo par de pinças bem para extrair os tendões da cauda um de cada vez. As fibras do tendão individual devem surgir com resistência mínima. Nota: Velha e chata #5 pinças funcionam bem para esta etapa.</li>
	<li>Preparar 100 mL de uma solução de 0,1% (em volume) de ácido acético em água estéril, a nível molecular e adicionar 10 mL de solução para uma placa de Petri estéril-100mm. Os tendões de transferência para o prato de Petri e deixe por 1h à temperatura de desnaturação do colágeno eu.</li>
	<li>Use uma tesoura esterilizada de bisturi ou iridectomy com pontas rombas, curvas para picar o tendão em fragmentos de 1-2 mm. Transferir os tendões picados para um tubo estéril de 50 mL e adicionar 0,1% de ácido acético para trazer o volume para 50 mL. Nota: Utilizar quatro ou cinco caudas para cada 50 mL de ácido para alcançar um colágeno concentração de 2.0-2.5 mg/mL.</li>
	<li>Refrigere o colágeno a 4 ° C por um período mínimo de 48 h para facilitar a desnaturação da proteína completa. Vórtice com um vórtice do tabletop, definido como a velocidade máxima durante 1 min duas vezes por dia.</li>
	<li>Medir a concentração de proteína da solução usando o ensaio de ácido bicinchoninic, ajustar o colágeno concentração de 2.0-2.5 mg/mL, adicionando solução de 0,1% de ácido acético e loja a 4 ° C. Nota: Colágeno solução pode ser armazenada por um a dois anos.</li>
	<li>(Opcional) Centrifugue o colágeno solução a 2.000 x g, durante 1 h a 4 ° C e uso a fração superior translúcida (cerca de metade do volume), para alcançar o colágeno opticamente claro coagula na secção 4.</li>
</ol>2. dissecação de órgãos vestibulares e auditivos
<ol><li>Eutanásia em ratos grávidos de toda a tensão com dióxido de carbono em conformidade com o protocolo aprovado pelo institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização relevantes16. Extrair e decapitar os embriões. Nota: Lfng-CreERT2/tdTomato ratos podem ser usados para permitir a rotulagem permanente das células após a exposição a 4-hydroxytamoxifen17de apoio.</li>
	<li>Esterilize todas as superfícies de trabalho e instrumentos de dissecção, incluindo dois pares de pinças #5 e um cabelo faca18, limpando-os com etanol a 70%.</li>
	<li>Dividi cada cabeça em duas metades, introduzindo um corte longitudinal com uma lâmina de bisturi estéril ou usando dois pares de pinças #5. Extrair os ossos temporais, que contêm o ouvido interno19e colocá-los em 15 mL de solução salina equilibrada gelado do Hank (HBSS) em uma placa de Petri 60mm. Mantenha o prato no gelo. Nota: Embriões em uma variedade de estágios de E13.5 de E18.5 têm sido utilizados com sucesso.</li>
	<li>(Opcional) Lavar o ouvido interno agitando-os delicadamente em um tubo cônico de 50 mL, contendo 30 mL gelada HBSS e substituindo o HBSS três ou quatro vezes. Mantenha o tubo no gelo. Nota: Esta etapa limita eventual contaminação da cultura de tecidos e traz rapidamente a temperatura de 4 ° C, o que impede a morte de degradação e células do tecido.</li>
	<li>Usando dois pares de fina #5 pinças, separar o ouvido interno do osso temporal e transferir as orelhas, três ou quatro de cada vez, em um prato de Petri 60mm preenchido com HBSS gelada.</li>
	<li>Disse os órgãos sensoriais vestibulares.<ol>
<li>Orientar o lado medial orelhas acima e localize o utrículo. Com dois pares de pinças #5, remova a cartilagem que cercam os órgãos vestibulares. Delicadamente cortar o nervo vestibular, a conexão entre o utrículo e saccule e os canais semicirculares, como mostrado na Figura 1. Puxe delicadamente o utrículo e as anexado ampolas dos canais semicirculares superiores e horizontais na orelha. Nota: Esse método pode ser usado no ouvido interno dos estágios E16.5 - E18.5. Preserve os fragmentos de cartilagem para a seção 3 abaixo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disse a cóclea.<ol>
<li>Remova o tecido cartilaginoso envolvendo o órgão da audição com dois pares de pinças #5. Delicadamente, cortar a conexão entre a base coclear e o saccule conforme mostrado na Figura 1. Nota: Para estágios E13.5 - E14.5, suavizam a cartilagem antes da dissecação, tratando o interior das orelhas com colagenase 0,25% eu em solução tampão fosfato salino (PBS) durante 5 min à temperatura ambiente. Preserve os fragmentos de cartilagem para a seção 3 abaixo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usar uma pipeta de 200 µ l equipado com uma ponta larga antiaderente, transferir o utricles e cochleae para um prato de Petri de 30mm preenchido com meio de cultura composto por DMEM/F12 suplementadas com 33mm Dglucose, bicarbonato de sódio de 19 mM, 15 mM, 4(2hydroxyethyl)- ácido 1piperazineethanesulfonic (HEPES), glutamina 1 mM, 1 mM nicotinamida, 20 mg/L fator de crescimento epidérmico, 20 mg/L fator de crescimento, insulina 10 mg/L, transferrina 5,5 mg/L e Selenito de sódio 5 µ g/L.</li>
	<li>Manter os preparativos do utrículo para até 3 h a 37 ° C numa incubadora de tecido-cultura gaseados com 5% de dióxido de carbono para permitir a cicatrização dos cortes no epitélio introduzida durante a dissecção. Preparações de cóclea devem ser transferidas para o gel de colágeno 10 min após a dissecação. Nota: Porque a dissecação é realizada em HBSS gelada, não há nenhuma necessidade para pré-aquecer o meio de crescimento de 37 ° C.</li>
</ol>3. (opcional) ajustar o colágeno rigidez do Gel com a adição de diferentes concentrações de condrócitos
Nota: O método para isolamento de condrócitos foi modificado de Gosset et al 20
<ol><li>Preparar uma solução de 1% de colagenase em estéril de 1X PBS e loja alíquotas de µ l 100-200 a-80 ° C. Descongelar no gelo, quando necessário, evitando vários ciclos de congelamento e descongelamento.</li>
	<li>Bem de uso de fórceps para recolher os pedaços de cartilagem que sobraram da dissecação dos órgãos vestibulares e auditivos de orelhas de 10-12. Tecidos conjuntivos e ouvido interno separados da cartilagem. Transferir a cartilagem para um prato de Petri de 30 mm e adicione 300 µ l de meio de cultura estéril.</li>
	<li>Use uma tesoura de lâmina ou iridectomy de bisturi estéril com pontas curvas sem corte para cortar o tecido para conseguir peças de cartilagem aproximadamente 0,5 mm de comprimento.</li>
	<li>Adicionar colagenase eu ao meio com cartilagem a obter uma concentração final de enzima de 0,25%. Transferi a cápsula para uma incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C, gaseados com 5% de dióxido de carbono. Pipeta vigorosamente, usando uma pipeta de 1.000 µ l de cada 20 min até pedaços de cartilagem se dissociam e já não são distinguíveis na solução, então incubar por um adicional de 20 min. Nota: No caso de preparações o utrículo, condrócito isolamento pode ser realizado durante a etapa de 2,9; demora cerca de 2 h (rodadas de pipetagem de 3-4).</li>
	<li>Recolher a suspensão de células em um tubo cônico de 15 mL e ajustar o volume para 10ml com PBS 1x estéril. Centrifugar 800 x g por 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de PBS 1x estéril. Centrifugar a 800 x g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Nota: É fundamental lavar as células duas vezes; qualquer restante colagenase que digerirá o eu do gel de colágeno.</li>
	<li>Usando uma pipeta de 200 µ l, adicione 100 µ l de meio de cultura para o centrifugado e pipeta suavemente para ressuspender. Contar as células usando um hemocytometer e mantê-las na prévia de gelo para usar.</li>
	<li>Para aumentar a rigidez do gel, adicionar condrócitos para o colágeno neutralizado eu solução (seção 1) do gel e misture rapidamente para distribuir as células em todo o gel antes da solidificação. Nota: O módulo de elasticidade do colágeno eu gel (uma medida da rigidez), aumenta linearmente com o número de condrócitos adicionado11. A relação é descrita pela função linear determinada experimentalmente E = 206· NC + 15, em que E é o módulo de elasticidade em Pascals e Nc é o número de condrócitos em milhões. Para um protocolo detalhado para gel medições de rigidez por favor consulte o original do artigo11.</li>
</ol>4. Coloque o órgão sensorial auditivo ou Vestibular em um eu do Gel de colágeno
<ol><li>Em um tubo estéril de 1,5 mL, preparar o colágeno solução de polimerização misturando 160 µ l de PBS de x 10 com indicador de pH vermelho de fenol, µ l 133 de 0,34 M de hidróxido de sódio, 70 µ l de bicarbonato de sódio de 0,9 M e 40 µ l de 1 M de HEPES. Mantenha o tubo no gelo. Nota: Esta receita fornece a solução de polimerização necessária para preparar 2 mL de colágeno eu do gel, mas pode ser dimensionado conforme necessário.</li>
	<li>Mix 100 µ l de solução de polimerização e 400 µ l de colágeno solução no gelo pipetando delicadamente acima e para baixo em um tubo de 1,5 mL refrigerado. Para aumentar a rigidez do gel, adicionar 50 µ l de meio de cultura contendo condrócitos e misture suavemente, conforme descrito na seção 3.</li>
	<li>Transferir 500 µ l do colágeno neutralizado solução para um prato de Petri 30mm refrigerados com uma pastilha de vidro de 10 mm-fundo ou para um poço de uma placa de quatro. Nota: É fundamental para manter todos os reagentes no gelo para evitar a polimerização rápida e irregular do colágeno eu.</li>
	<li>Transferir o cochleae ou utricles, para o colágeno neutralizado solução e ajustar os órgãos para a sua posição desejada com um cabelo estéril faca18 ou um par de pinças bem. Nota: Colágeno polimerização torna-se perceptível após 1-2 min como a solução torna-se turva.</li>
	<li>Depois que a solução ao redor do tecido tem polimerizado, coloque a placa de Petri ou placa de quatro por 20 min a 37 ° C numa incubadora de tecido-cultura gaseados com 5% de dióxido de carbono para garantir a completa polimerização.</li>
	<li>Adicione 3 mL de meio de cultura suplementado com 0,5% de soro fetal bovino (FBS) por placa de Petri ou 500 µ l do mesmo meio por alvéolo de uma placa de quatro. Manter a cultura a 37 ° C numa incubadora de tecido-cultura gaseados com 5% de dióxido de carbono. Se desejado, completar o meio de crescimento com 10 µM 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) para rotular a proliferação de células. Nota: Altas concentrações de FBS podem ser usadas se desejado.</li>
</ol>5. virais injeções em culturas tridimensionais de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares
<ol><li>Degele o vírus desejado no gelo e misture com a solução de azul de Tripan em um tubo cônico de 0,5 mL, para obter uma concentração final de tintura de 0,05%. Use tintura de x de 10-20 para evitar substancial diluição do vírus. Manter-se no gelo. Nota: Adenovírus serótipo 5 funciona melhor para infectar células suportando o utrículo19, Considerando que o vírus adeno-associado Anc80 podem infectar tanto células ciliadas e apoiar as células no utrículo e a cóclea,21.</li>
	<li>Quebre a ponta de uma agulha de vidro preparada em um extrator de micropipeta com pinça limpa bem enquanto observá-lo com a maior ampliação de um binóculo, microscópio de dissecção. Nota: É importante otimizar as configurações sobre o extrator de agulha. Agulhas com 9 - 12mm hastes e 20 - 30-µm aberturas funcionam melhor.</li>
	<li>Remova uma órgão sensorial cultura da incubadora. Anexar a agulha para o microinjector e preenchê-lo com 2-3 µ l de mistura de corante e vírus. Avance a agulha para o órgão sensorial enquanto observa-lo sob o binóculo, microscópio de dissecção.</li>
	<li>Dirigir suavemente a ponta da agulha através de camadas epiteliais e mesenquimais do telhado de uma cultura utricular tridimensional. Injete a mistura viral até as cavidades do utrículo e Ampollas preencher com o corante azul. Nota: Porque permite acesso fácil aos órgãos sensoriais, um prato de Petri de vidro de 10 mm-fundo é ideal para as injeções.</li>
	<li>Incube a 37 ° C numa incubadora de tecido-cultura gaseados com 5% de dióxido de carbono. Nota: Quando a proteína fluorescente verde ou vermelha é usada na construção de viral, a fluorescência é aparente 24h após transdução viral.</li>
</ol>

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Os autores não têm nada para divulgar.

Os sinais moleculares que crescimento mediato e diferenciação na orelha interna durante o desenvolvimento foram extensivamente estudaram5,6,7,8,9,10. No entanto, evidências obtidas a partir do sistema modelo utricular sugerem que pistas mecânicas, sentidas-se através de cruzamentos de celular e a ativação da sinalização de hi...

O estudo de quase todos os aspectos de desenvolvimento de mamíferos órgão tem sido facilitado pelos sistemas em vitro . Dois métodos principais são usados agora para a cultura de órgãos sensoriais vestibulares: flutuante1 e aderente2 preparações. Ambos os métodos permitem a investigação de cabelo célula vulnerabilidades3 e regeneração1,4 em vitro. Além disso, as funções do desenvolvimento do entalhe5,6, Wnt7,8, fator de crescimento epidérmico do receptor (EGFR)9,10 , sinalizando cascatas no ouvido interno e têm foi estabelecido, em parte, através do uso de culturas em vitro de epitélios sensoriais. No entanto, diferenciação e crescimento celular são controlados, não só através de sinalização por morphogens, mas também através de sinais físicos e mecânicos como contatos intercelulares, a rigidez da matriz extracelular e mecânicos de alongamento ou constrição. O papel de tais estímulos mecânicos é um desafio para investigar no ouvido interno em desenvolvimento em vivo. Além disso, métodos de cultura livre-flutuante e aderente existentes não são adequados para tais estudos in vitro. Aqui nós descrevemos um método de cultura de organotypic tridimensionais de colágeno géis de rigidez diferentes. Esse método amplamente preserva a arquitetura na vivo dos órgãos sensoriais vestibulares e cocleares e permite a investigação dos efeitos da força mecânica em crescimento e diferenciação11.
Porque os estímulos mecânicos são conhecidos para ativar eventos moleculares a jusante, tais como o hipopótamo sinalização via12,13,14,15, é importante ser capaz de combinar a estimulação mecânica com manipulações genéticas e bioquímicas. O método de cultura descrito aqui permite a entrega de genes mediada por vírus e, portanto, pode ser usado para estudar a sinalização da mecânica e molecular durante a orelha interna desenvolvimento11.

<table><tbody><tr><td>#10 Lâminas Cirúrgicas</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>#5 Fórceps</td><td>Dumont</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm</td><td>Sigma</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>250 uL pontas de pipeta de orifício grande</td><td>USA Scientific</td><td>1011-8406</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri com fundo de vidro de 30 mm</td><td>Matsunami Glass USA Corporation</td><td>D35-14-1.5-U</td><td></td></tr><tr><td>4 poços placa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>4-Hidroxitamoxifeno&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm Placa de Petri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>123TS1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Ad-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP, fração IgY de frango</td><td>Invitrogen</td><td>A10262&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myo7A</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-SOX2 (Y-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de ácido bicinchonínico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Kit de imagem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase I</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos</td><td>Sigma</td><td>F5392</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipeta Extrator</td><td>Sutter Instrumento</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro&nbsp;</td>Tesoura de Iridectomia <td>Daigger</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Zepf Instrumentos Médicos</td><td>08-1201-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Narishige</td><td>IM-6</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Vermelho indicador de pH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4633&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol Puro, 200 Provas</td><td>Decon Labs&nbsp;</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RFP anticorpo</td><td>ChromoTek</td><td>&nbsp; 5F8</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice de mesa&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Azul Trypan&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

culturas organotypic tridimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Os órgãos sensoriais do ouvido interno estão desafiando a estudar em mamíferos devido a sua inacessibilidade à óptica observação e manipulação experimental. Além disso, apesar de técnicas de cultura existentes permitem que as perturbações bioquímicas, esses métodos não fornecem um meio para estudar os efeitos da força mecânica e a rigidez do tecido durante o desenvolvimento dos órgãos sensoriais ouvido interno. Aqui nós descrevemos um método para a cultura de organotypic tridimensionais da cóclea que supera essas limitações e utrículo murino intacto. A técnica para o ajuste de uma rigidez de matriz tridimensional descrita aqui permite a manipulação da força elástica contra o crescimento do tecido. Portanto, esse método pode ser usado para estudar o papel das forças mecânicas durante o desenvolvimento do ouvido interno. Além disso, as culturas permitem a entrega de genes mediada por vírus, que pode ser usada para experiências de ganho e perda-de-função. Este método de cultura preserva inata de células ciliadas e apoiar as células e serve como uma alternativa potencialmente superior à tradicional cultura bidimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares.

Órgãos sensoriais vestibulares e auditivos de orelhas embrionárias, cultivadas em 40-Pa colágeno géis imitando rigidez baixa condições embrionárias11, reter relativamente normais estruturas tridimensionais (Figura 1) e manter as células ciliadas e apoiar as células (Figura 2 e Figura 3). Embora apoiando a densidade celular diminui por mais de 30% (teste t deStudent: n...

Culturas organotypic tridimensional do utrículo murino e cóclea em opticamente clara colágeno eu geles preservar tecido inata morfologia, permitam a estimulação mecânica através do ajuste da rigidez da matriz e permitam a entrega de genes mediada por vírus.

Culturas Organotypic tridimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer culturas organotípicas tridimensionais dos órgãos sensoriais vestibulares e auditivos murinos. Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo de pesquisa do ouvido interno, como quais são os papéis da força mecânica e da rigidez do tecido durante o desenvolvimento dos órgãos sensoriais do ouvido interno. A principal vantagem dessa técnica é que ela preserva em grande parte a arquitetura inata da cóclea vestibular e nos permite estudar a sinalização molecular e mecânica durante o desenvolvimento da orelha interna.O Dr. Hudspeth e eu tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos que as culturas tridimensionais podem fornecer condições morfológicas para estudar o crescimento de órgãos vestibulares in vitro. Primeiro, use etanol 70% para limpar e desinfetar a área de trabalho e todos os instrumentos de dissecção necessários, incluindo pinça número cinco e uma faca de cabelo. Em seguida, use uma lâmina de bisturi estéril para fazer um corte longitudinal, divida a cabeça do camundongo em duas metades e extraia os ossos temporais.Transfira 15 mililitros de tampão HBSS em uma placa de Petri de 60 milímetros no gelo. Em seguida, use dois pares de pinças finas número cinco para isolar os ouvidos internos dos ossos temporais. Em seguida, transfira três a quatro orelhas de cada vez em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo tampão HBSS gelado.Em seguida, oriente as orelhas com o lado medial para cima para localizar o utrículo. Use os dois pares de pinças número cinco para remover a cartilagem ao redor dos órgãos vestibulares. Em seguida, corte o nervo vestibular, a conexão entre o utrículo e o sáculo e os canais semicirculares para liberar o utrículo e as ampolas anexadas das orelhas.Apare o excesso de canais semicirculares, se necessário. Como alternativa, use os dois pares de pinças número cinco para remover o tecido cartilaginoso ao redor do órgão auditivo. Em seguida, isole a cóclea.Em seguida, use uma pipeta de 200 microlitros equipada com uma ponta larga e antiaderente para transferir a cóclea e os utrículos para uma placa de Petri de 30 milímetros preenchida com o meio de crescimento à base de DMEM/F12. Em seguida, transfira as preparações cocleares e utrículas para uma incubadora de cultura de tecidos, gaseificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Isso é para obter culturas de órgãos com lúmens fechados.Prepare 100 microlitros da solução de polimerização de colágeno em um tubo estéril de 1,5 mililitro. Em seguida, deixe o tubo no gelo. Em seguida, remova as preparações cocleares e utrículas da incubadora de cultura de tecidos.Prepare a solução de colágeno neutralizado. Para fazer isso, adicione 400 microlitros de colágeno a um tubo resfriado de 1,5 mililitro com 100 microlitros de solução de polimerização pipetando várias vezes no gelo. Transfira 500 microlitros da solução de colágeno neutralizado para uma placa de Petri gelada de 30 milímetros com uma inserção de fundo de vidro de 10 milímetros.Transfira imediatamente a cóclea ou os utrículos para a solução de colágeno neutralizado usando uma pipeta de 200 microlitros equipada com uma ponta larga e antiaderente. Use uma faca de cabelo estéril ou um par de pinças finas para ajustar os órgãos às posições desejadas sob um microscópio de dissecação binocular. Para garantir a polimerização completa, incube a placa de Petri a 37 graus Celsius por 20 minutos.Após 20 minutos, adicione três mililitros de meio de crescimento, suplementado com 0,5% de soro bovino fetal em cada placa de Petri. Depois de adicionar o meio de crescimento, incube a cultura a 37 graus Celsius. Primeiro, descongele o vírus no gelo.Em seguida, misture a suspensão viral com a solução de azul de tripano em um tubo cônico de 0,5 mililitro para ajustar a concentração final do corante de 0,05% Depois de misturar a solução de azul de tripano, deixe as partículas virais no gelo. Em seguida, use um microscópio de dissecação binocular para observar a quebra da ponta da agulha de vidro, preparada em um extrator de micropipeta com pinças finas e limpas. Primeiro, remova a cultura de órgãos sensoriais da incubadora.Encaixe a agulha no microinjetor. Encha a agulha com dois a três microlitros de corante e mistura viral. Olhe através do microscópio de dissecação binocular enquanto coloca a agulha no órgão sensorial.Continue encaminhando a ponta da agulha através das camadas mesenquimal e epitelial do teto de uma cultura utricular tridimensional. Continue injetando a mistura viral até que as cavidades do utrículo e ampolas se encham com o corante azul. Em seguida, incube a cultura de órgãos em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius gaseificada com 5% de dióxido de carbono.Estas são as imagens microscópicas de luz da cultura do utrículo e da cóclea embutidas no gel tridimensional de colágeno um. O utrículo e a cóclea são obtidos de embriões com 17,5 e 14,5 dias de idade, respectivamente, e cultivados por 48 horas. Essas imagens microscópicas confocais mostram um utrículo embrionário de 18,5 dias imediatamente antes e depois do explante no gel de colágeno 40PA.Após três dias na cultura, quase 80% das células ciliadas positivas para Myo7A permanecem intactas. A densidade celular de suporte diminui em mais de 30% e a densidade de células ciliadas diminui em 60% após três dias em culturas utriculares. Essas imagens microscópicas confocais mostram uma cóclea embrionária de 14,5 dias de idade pouco antes e depois do explante no gel de colágeno 40PA.Após três dias em cultura, as células ciliadas internas e externas positivas para Myo7A e Sox2 são morfologicamente distinguíveis e estão organizadas em cerca de quatro a cinco fileiras. Aqui, as imagens mostram infecção viral bem-sucedida das células de suporte na base da cóclea e ao longo das culturas tridimensionais utriculares obtidas de 15,5 e 17,5 dias de embriões, respectivamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar órgãos sensoriais intactos do ouvido interno, estabelecer culturas tridimensionais de utrículo e cóclea e gel de colágeno tipo um e realizar transfecções virais nessas culturas tridimensionais.Lembre-se de que trabalhar com partículas virais, dependendo da carga genética, pode ser perigoso. Precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual e descarte viral adequado, devem sempre ser praticadas.

three-dimensional-organotypic-cultures-vestibular-auditory-sensory

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este procedimento descreve um método para o isolamento e cultura do órgão murino de Corti com ou sem o limbo espiral e neurônios do gânglio espiral. Nós também demonstrar um método para a expressão de um gene exógeno repórter no órgão de Corti explante por eletroporação.

Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

Um procedimento simples de vibratome seccionando o órgão de Corti, seguido por microscopia confocal e imuno-histoquímica é descrito. Este procedimento permite uma melhor preservação da citoarquitetura fino do órgão de Corti de mamíferos e, conseqüentemente, permite a quantificação precisa dos tipos de células.

Vibratome Seccionamento de Preservação melhorada da citoarquitetura do Órgão de Corti de mamíferos

Este vídeo demonstra o processo de isolamento de explantes de gânglios espirais do ouvido interno e co-cultura com o órgão de Corti em uma matriz de multieletrodos. Os gânglios espirais são cuidadosamente extraídos e seccionados em seções de tecido menores ou explantes. Esses explantes são cultivados na área ativa da matriz de multieletrodos para promover o crescimento do processo neuronal.

Cultura de explantes de neurônios do gânglio espiral murino em matrizes de multieletrodos

Análise da função das células ciliadas vestibular é complicada por sua localização profunda na parte mais difícil do crânio, no osso temporal petroso. A maioria dos estudos com células capilares funcionais têm utilizado intensamente as células ciliadas isoladas. Aqui nós descrevemos uma preparação semi-intactos do epitélio vestibular rato para estudos eletrofisiológicos e de microscopia de dois fótons.

Uma preparação semi-intactas isolada do Rato Vestibular epitélio sensorial de Eletrofisiologia e de alta resolução Microscopia de dois fótons

Apresentamos um protocolo para cultivar explantes primários de neurônios do gânglio espiral murino em matrizes de múltiplos eletrodos para estudar perfis de resposta neuronal e otimizar parâmetros de estimulação. Tais estudos visam melhorar a interface neurônio-eletrodo do implante coclear para beneficiar a audição dos pacientes, bem como o consumo de energia do dispositivo.

Do gânglio espiral Neuron Explant Cultura e Eletrofisiologia em multi-eléctrodos Arrays

Neste estudo, apresentamos um método de imagem em tempo real utilizando microscopia confocal para observar células que se movem em direção ao tecido danificado pela incubação ex vivo com o epitélio coclear contendo o órgão de Corti.

Imagens de células vivas in vitro para explorar a migração celular em direção ao órgão de Corti

O pintinho é um organismo modelo econômico, acessível e amplamente disponível para uma variedade de estudos. Aqui, uma série de protocolos é detalhada para entender os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e regeneração do ouvido interno das aves.

In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

São apresentados métodos que fornecem instruções detalhadas para dissecar, dissociar, cultivar e registrar patch-clamp dos neurônios do gânglio vestibular e do gânglio espiral da orelha interna.

Isolamento e Cultivo de Somatas Vestibulares e Gangliões Espirais de Roedores Neonatais para Gravações de Patch-Clamp

O protocolo atual atualiza protocolos anteriores e incorpora abordagens relativamente simples para a cultura de explantes cocleares de alta qualidade. Isso fornece aquisição de dados confiável e imagens de alta resolução em células vivas e fixas. Este protocolo apoia a tendência contínua de estudar as células da orelha interna.

Explantes Cocleares Neonatais Totais como Modelo In vitro

Neste trabalho, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento e cultivo de células ciliadas primárias da cóclea de camundongos. Inicialmente, o órgão de Corti foi dissecado de cócleas murinas neonatais (idade 3-5 dias) sob um microscópio. Posteriormente, as células foram digeridas enzimaticamente em uma suspensão unicelular e identificadas por imunofluorescência após vários dias em cultura.

Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais

Aqui, descrevemos uma técnica para a coleta de órgãos-alvo vestibulares humanos sob condições fisiológicas durante a labirintectomia e sua análise usando imunocoloração.

Colheita de órgãos-alvo vestibulares sob condições fisiológicas durante a labirintectomia

Aprenda a estabelecer culturas organotípicas tridimensionais de órgãos vestibulares e auditivos de murinos usando géis de colágeno I. Este método preserva a arquitetura tecidual e permite estudos de sinalização mecânica e molecular no desenvolvimento da orelha interna.

Culturas Organotypic tridimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares

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