Name: Integrar a citometria de fluxo de imagem e Transcriptomic de criação de perfil para avaliar alterados CD1d endocítica tráfico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a integrar citometria de fluxo de imagem e transcriptômica para avaliar alterações no tráfego endocítico de CD1d em células dendríticas humanas expostas a poluentes. Este método conecta expressão gênica à função proteica.

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Os autores agradecer Robert Giulitto (centro de sangue de Hoxworth) para amostras de sangue humano e Dr. Liang Niu para a normalização da expressão do gene lê. Agradecemos também a concessão de apoio do nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (ES006096), centro de genética ambiental (CEG) projecto-piloto (S.H.), Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (AI115358) (Samba), Universidade de Prêmio de Cincinnati University Research Council (S.H.) e Universidade de Cincinnati College de medicina núcleo realce do financiamento (X. Z.).

Protocolos humanos neste estudo foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Cincinnati, e todos os métodos foram realizados em conformidade com as normas orientadoras aplicáveis e regulamentos. Amostras de sangue de doadores saudáveis foram obtidas do centro Hoxworth de sangue no centro médico da Universidade de Cincinnati.
1. Transcriptomic de criação de perfil de expostos a poluentes derivados de monócitos humanas DCs
<ol><li>Extração de RNA total de DCs BaP-expostos<ol>
<li>Diferenciar humanos DCs usando citocinas GM-CSF e IL-4 e expor DCs para BaP para 4 dias13.</li>
		<li>Classificar o BaP-expostos DCs usando citometria de fluxo com base em marcadores de superfície expressadas (linhagem–HLA-DR.+), a maioria dos quais consiste em DCs convencionais (CD11c+CD1c+)13. Normalmente, classificar 10.000 DCs em meio de cultura contendo 10% FBS, centrifugar DCs a 600 x g e 4 ° C por 6 min e imediatamente remover o sobrenadante por aspiração usando uma ponta de pipeta de 1 mL.</li>
		<li>Uma vez que o sobrenadante é removido por aspiração, lyse o centrifugado adicionando 0,4 mL de tampão de Lise/ligação do kit de isolamento de RNA para armazenamento em-80 ° C antes de extração do RNA.</li>
		<li>Use o kit de isolamento de RNA com o protocolo de extração de RNA total para extrair o RNA total14. Medir a integridade do RNA usando um Bioanalyzer15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transcriptomic análise de DCs classificadas (figura 1A)<ol>
<li>Preparamos a biblioteca usando um kit de preparação de biblioteca de RNA RNA-seq. Em suma, fragmentar o RNA poli-A isolada (~ 200 bp), reverso transcrever os fragmentos para o 1º strand do cDNA e siga pela síntese do cDNA segunda vertente rotulada com dUTP.</li>
		<li>Ligate cDNA fita dupla para o adaptador com uma estrutura de Hairpin loop após a purificação do grânulo, fim-reparação e dA-tailing. Retirar os resíduos de uracil em strand 2º do cDNA e adaptador loop com enzima usuário (Reagente de excisão Uracil específicos) para manter a especificidade de vertente e abrir o loop de adaptador para o PCR.<ol>
<li>Execute 13 ciclos de PCR utilizando primers universais e índice específico para enriquecer a biblioteca indexada. Limpar a biblioteca e executar em um chip Bioanalyzer DNA alta sensibilidade para verificar a qualidade da biblioteca e distribuição de tamanho.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilize um kit de quantificação de biblioteca e um sistema PCR em tempo real combinadas com informações de tamanho biblioteca para calcular biblioteca concentração através de um método da curva padrão.</li>
		<li>Proporcionalmente piscina individualmente indexadas bibliotecas compatíveis e ajustar a concentração total final para 15 pM. Executar a geração de aglomerado de biblioteca e sequenciar biblioteca em uma configuração de leitura única 1 x 50 bp para gerar 25 milhões leituras por amostra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sequenciamento<ol>
<li>Carrega o sequenciamento e indexação reagentes para racks de reagente o SBS e PE, respectivamente. Coloque os reagentes num banho de água da série laboratório por 1h até todo o gelo derreteu e os reagentes em cada frasco/tubo são misturados adequadamente.</li>
		<li>Preparar a mistura ICB, adicionando a enzima descongelada de tintura e -20 ° C para a garrafa e misture. Prepare uma solução de NaOH de acordo com as instruções de sequenciamento. Coloque todos os reagentes a 4 ° C até que esteja pronto para usar.</li>
		<li>Durante a 1 h, período, esperando poder sobre o sequencer. Espere que a unidade DONOTEJECT para aparecer e conecte o computador a uma unidade de rede.</li>
		<li>Inicie o software de controle de sequenciador.</li>
		<li>Prepare-se 2 L de solução que contém 0,5% de Tween 20 e 0,03% manutenção de água de 300 no laboratório-grau ProClin.</li>
		<li>O rack de reagente SBS, adicione ~ 100 mL da solução de lavagem de manutenção a cada um dos 8 garrafas e tampas de funil para as garrafas. O rack de reagente de PE, adicionar ~ 12 mL da solução de lavagem de manutenção a cada um dos dez tubos 15ml cónico e descartar as tampas.</li>
		<li>Carrega os dois racks com os solução enchido garrafas/tubos para o sequencer.</li>
		<li>O software de controle de sequenciador, escolha a lavagem de manutenção; Siga as instruções na tela para limpar o sistema sequenciador de fluido até que o processo seja concluído.</li>
		<li>Iniciar um novo executado na guia "Sequência" de software; Direcione a saída de dados para uma unidade de rede. Escolha os parâmetros para leitura única 1 x 50 bp com bibliotecas de índice único multiplexado.</li>
		<li>Opcionalmente, logar o Hub de sequência de BaseSpace, para que o status de sequenciamento pode ser monitorado remotamente através de um computador ou telefone inteligente.</li>
		<li>Carregar uma folha de amostra para demultiplexação e fornecer informações de reagente de acordo com a exigência do software.</li>
		<li>Carregar os reagentes SBS e PE para o sequencer. Encha o sistema com uma célula de fluxo usado (~ 15 min).</li>
		<li>Uma vez concluída a geração de cluster (~4.5 h), tirar a célula de fluxo, Borrife levemente a célula de fluxo com água e limpe seco usando papel de lente. Levemente pulverizar a célula de fluxo com etanol a 95% e limpá-lo seco. Verifique contra a luz para certificar-se que a superfície esteja limpa sem detritos ou resíduos de sal.</li>
		<li>Depois de concluída a etapa Prime, a célula de fluxo em cluster de carga e iniciar o sequenciamento. O software visualizador de análise de sequência será automaticamente iniciado.</li>
		<li>Monitore a qualidade de dados de sequenciamento através de SAV incluindo densidade do aglomerado, filtro de passagem de leituras, cluster pass filtro %, ≥Q30%, legado fase/prófase %, QC, etc , o que ajuda a compreender a qualidade de dados e solucionar problemas de indexação.</li>
		<li>Alterar a vedação da célula de fluxo e realizar uma lavagem de manutenção após a conclusão do sequenciamento. O sequencer está pronto para a próxima corrida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise de Bioinformatic<ol>
<li>Execute a bioinformática de análise de dados de RNA-seq13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. via análise de perfis de Transcriptomic (figura 1B)
<ol><li>Use um edgeR Bioconductor comparar contagens de intensidade de expressão de gene resultante entre DCs BaP-expostos e não-expostos de três doadores. Em seguida, identificar genes diferencialmente expressos entre DCs BaP-expostos e não-expostos, baseados na mudança da dobra absoluto (> 2 dobras) e a descoberta de falsa valores (FDR) - ajustado p- a taxa (< 0,05).</li>
	<li>Para prever os clusters funcionais de diferencialmente expressos genes, usar o pacote de software ToppCluster para pesquisar os genes alterados contra vários bancos de dados, incluindo KEGG e REACTOME e gerar dados de clusters. ToppCluster usa o teste hipergeométrica para obter enriquecimento funcional através de de análise do gene lista enriquecimento16.</li>
	<li>Entrada mais os resultados destes clusters de função para Cytoscape17,18 versão 3.3.0, uma plataforma de software de código aberto amplamente utilizado para a visualização de redes complexas. Assim, os genes envolvidos em diferentes clusters ou caminhos, incluindo clusters endocítica e metabolismo de lipídios, são mostrados em uma rede com anotação de cor de dobra em média a alteração de gene expressão (figura 1B)13.</li>
</ol>3. citometria de fluxo de CD1d e Lamp1 Colocalization de imagem
<ol><li>Anticorpo de rotulagem de DCs BaP-expostos<ol>
<li>Expor 0,5 x 106 humanos DCs para 5,94 mM de BaP de 4 dias a 37 ° C em 2 mL de Dulbecco completa meio modificado da águia. Colheita DCs por centrifugação a 400 x g durante 10 min. bloco as DCs diferenciadas incubando células com bloqueador de soro humano e anticorpos do receptor Fc anti-humanos por 10 min no gelo, incluindo anticorpos CD16, CD32 e CD64 anti-humanos.</li>
		<li>Incubar a violeta brilhante 421-anti-CD1c (L161), ficoeritrina/cianina tingir 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR e PE/Cy5-anti-CD11c com DCs por 20 min no gelo. A tabela 1 mostra esta lista de anticorpos.</li>
		<li>Conserto DCs com paraformaldeído 4% em PBS e permeabilize-los com permeabilização de tampão de lavagem. Executar a coloracao intracelular com uma mistura de PE-rotulado purificada anti-humano CD1d (51,1) e Alexa Fluor 647-rotulado anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medição de citometria de fluxo (Figura 2) de imagem<ol>
<li>Analise as amostras coradas utilizando um citômetro de fluxo da imagem latente para o núcleo de citometria de fluxo do Hospital infantil de Cincinnati, usando um objectivo X 40 para produzir 300 pixels para uma cela com cerca de 10 mm de diâmetro. Tamanho de um pixel é aproximadamente 0, 5mm por 0,5 mm do objeto.</li>
		<li>Adquirir 10.000 imagens celulares de forma imparcial, de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. análises de imagens de citometria de fluxo de imagem.
<ol><li>Análise de colocalization usando software de ideias (Figura 2)<ol>
<li>Realizar a compensação com single-manchado contra amostras não manchadas, definindo a intensidade de fluorescência das amostras não coradas abaixo do limiar, incluindo não-coradas DCs BaP-expostos com autofluorescência de BaP, como dados de citometria de fluxo rotina análise.</li>
		<li>Portão, corado células para obter os subconjuntos de HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ células (Figura 2A) e mostrar imagens de celular em subconjuntos fechados (Figura 2B).</li>
		<li>Salve imagens de celular em formato png com base em dois critérios técnicos de inclusão, a presença visual de sinais fortes co manchadas e Localização subcellular das proteínas CD1d e Lamp1, para as análises de colocalization usando o ImageJ-Fiji (Figura 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use o software ImageJ-Fiji para executar análise colocalization (Figura 3).<ol>
<li>Prepare os arquivos de imagem de entrada mesclando as 100 imagens de célula salvo para DCs humanos não-expostos e BaP-expostos, respectivamente (Figura 3A).</li>
		<li>Analisar CD1d (vermelho) e Lamp1 colocalization (verde), usando um gráfico de dispersão.<ol>
<li>Execute programa ImageJ-Fiji. Abra o arquivo. png com 100 imagens de célula (Figura 3B e Figura 4A): "arquivo | Abra".</li>
			<li>Dividir a imagem com canais de vermelho e verdes mesclados em duas imagens com um vermelho ou um canal verde: "imagem | Cor | Dividir canais".</li>
			<li>Desenhar um gráfico de dispersão usando os comandos "Analyze | Colocalization | Limiar de colocalization". Salve o gráfico de dispersão usando a tecla "PrintScreen" .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcular os coeficientes de colocalization do Mander para cada imagem de celular única (n = 100) (Figura 4B)<ol>
<li>Selecione uma imagem única célula no arquivo de imagem com separação de canais usando o "Oval" ferramenta de seleção.</li>
			<li>Use os comandos "Analyze | Colocalization | Limiar de colocalization". Selecione "Canal 1" da caixa de diálogo da região de interesse (ROI). Manter todas as opções de cálculo, incluindo "Mander usando limiares" para cada imagem de célula.</li>
			<li>Repita esse cálculo para todas as imagens de 100 células.</li>
			<li>Salvar e abrir os resultados usando uma folha de cálculo.</li>
			<li>Plotar a média e erros-padrão para "Coeficientes de Mattos thresholded" (n = 100, 0 significa nenhum colocalization e 1 significa colocalization perfeito). Use o teste t de Student para calcular o valor de p para a comparação entre grupos BaP-expostos e não-expostos (Figura 4B).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcular a porcentagem da intensidade thresholded pixel co localizada entre CD1d e Lamp1 para várias imagens de célula (n = 100) (Figura 4).<ol>
<li>Usar o mesmo protocolo de análise em 4.2.3 e além disso, selecione a opção de resultado "% intensidade limiar colocalized".</li>
			<li>Realizar esta análise juntamente com coeficientes de colocalization do Mattos.</li>
			<li>Da mesma forma, traça a média e erros-padrão para a intensidade de % colocalized entre CD1d e Lamp1. Use o teste t de Student para calcular o valor de p para comparação entre grupos BaP-expostos e não-expostos (Figura 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

Confirmação funcional do percurso gene alterado é um desafio, por causa da expressão do gene amplamente impactados envolvendo múltiplos caminhos e a dificuldade de integrar a actividade celular individual e populacional. Utilizamos a citometria de fluxo da imagem latente para especificamente teste CD1d tráfico de compartimentos endocítica. Citometria de fluxo de imagem integra a medição populacional das células e a demonstração individual da subcellular colocalization de várias proteínas. Microscopia confocal forneceu an...

Apresentação de antigénios normalmente envolve proteínas intracelulares tráfico, que tem sido investigada frequentemente usando a caracterização morfológica e Caracterização fenotípica das apresentadoras de antígenos de células1,2,3 . Para integrar as vantagens da imagem latente e métodos de fenotipagem, descrevemos uma plataforma de análise de imagem em nível de população para demonstrar uma colocalization de proteína alterada em células dendríticas (DCs) e unicelulares. Na apresentação de antigénios do peptide, complexo de histocompatibilidade (MHC) classe I moléculas vincular um peptídeo curto (resíduos de 8-10) no retículo endoplasmático para ativar o CD8 convencional+ T células, enquanto moléculas de MHC classe II vincular um relativamente mais peptídeo (~ 20 resíduos) em compartimentos endocítica para ativar convencional CD4 células de+ T1,4. Em contraste, as células T de lipídios específicos são ativadas por proteínas CD1 com antígenos lipídicos carregados principalmente em compartimentos endocítica5,6. Apresentação de antigénios de lipídios requer o fornecimento de lipídios metabolitos produzidos no metabolismo lipídico7,8,9,de10 e o carregamento de metabólitos de lipídios funcionais para CD1 proteínas em compartimentos endocítica5,6. Neste contexto, diversos fatores celulares modulando a apresentação de antigénios de lipídios, especialmente na exposição ambiental de poluentes lipofílicos e distúrbios imunológicos, são essenciais para ser definido. Neste estudo, usamos transcriptomic análise, imagem de perfil e análise de imagens celular e populacional de DCs derivados de monócitos humanos para determinar a proteína endocítica tráfico contribuindo para apresentação de antigénios de lipídios na exposição de poluentes. Certamente, esta plataforma combinada pode ser aplicada para estudar proteínas subcellular tráfico e colocalization em diferentes processos biológicos.
Tecnicamente, a Localização subcellular da proteína geralmente foi demonstrada usando microscopia confocal e analisados estatisticamente em um número limitado de células detectado1,2,3,11. Além disso, citometria de fluxo tem sido amplamente aplicada a populações de células de portão com sinais co manchadas de múltiplas proteínas em um nível celular12; no entanto, este não possui uma visualização detalhada de colocalization Subcellular da proteína. Para realizar análises abrangentes e estatísticas de colocalization de proteína percentagem a nível celular e população, podemos incorporar imagens de perfis e análise de abordagens para determinar as características de colocalization de proteína com biológico relevância. Especificamente, nós usamos a citometria de fluxo de imagem para detectar o colocalization de CD1d e proteína de membrana lisossomal-associado 1 (Lamp1) proteínas neste estudo. Análise quantitativa de moléculas colocalized anteriormente era difícil a ser realizada em escala populacional. Neste estudo, adaptamos o programa ImageJ-Fiji para examinar a porcentagem de colocalization de proteína com um grande número de células coradas co nível populacional e individual celular. Especificamente, Nós medimos áreas co localizadas, intensidade e tamanho populacional para apoiar a conclusão de que a proteína CD1d em grande parte foi mantida em compartimentos endocítica atrasados do DCs humanas em exposição a um poluente lipofílicos benzo [a] pireno (BaP),13 . Este celular combinada e população de análise de imagem fornecidos resultados altamente reprodutíveis, abrangentes e estatisticamente significativos de CD1d-Lamp1 colocalization relevante para a apresentação de antigénios de lipídios inibida.
A transcriptoma do BaP-expostos DCs humanos fortemente apoiado a hipótese de que o metabolismo lipídico endocítica e CD1d endocítica tráfico foram prejudicadas em exposição BaP. Para testar esta hipótese, nós aplicamos a citometria de fluxo de imagem para o perfil de imagens da população de DC que co estavam manchadas com várias proteínas, incluindo CD1d, marcadores endocítica e marcadores de DC. Finalmente, as células co manchadas foram analisadas estatisticamente para demonstrar o percentual de intensidade e áreas de colocalization CD1d e Lamp1.

<table><tbody><tr><td>Transcriptômica</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500 v4</td><td>Sistema Illumina HiSeq</td></tr><tr><td>ImagingStream X</td><td>Millipore</td><td>100220</td><td>Citometria de fluxo de imagem</td></tr><tr><td>mirVana miRNA Kit de isolamento</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Extração total de RNA</td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td></td><td>Análise de controle de qualidade de RNA total</td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>PCR, reação enzimática</td></tr><tr><td>NEBNext Poly(A) mRNA Módulo de Isolamento Magnético&nbsp;</td><td>Purificação de RNA PolyA</td>da <td>New England Biolab</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Apollo automatizado SMARTer</td><td>Purificação de RNA PolyA</td>da <td>Takara</td><td></td></tr><tr><td>NEBTamp Ultra RNA Kit de Preparação para Biblioteca para Illumina</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>Preparação da Biblioteca</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP contas magnéticas</td><td>Purificação de DNA Beckman Coulter</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Library QC, análise de distribuição de tamanho</td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td></td><td>Library QC, análise de distribuição de tamanho</td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td><td>Quantificação</td> da <td>Thermo Fisher</td><td></td> Library</tr><tr><td>NEBNext Library Quant Kit</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>Quantificação</td></tr> <tr><td>da bibliotecacBot</td><td>Illumina</td><td></td><td>Library geração de cluster</td></tr><tr><td>TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &ndash; Geração</td> de cluster HS <td>Illumina</td><td></td><td>Library</td></tr><tr><td>HiSeq 1000</td><td>Sequenciamento Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 ciclos)</td><td>Sequenciamento Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoeritrina/Cianina 7 (PE/Cy7)</td><td>Bio Legend</td><td>L243</td><td></td></tr><tr><td>Ficoeritrina/Cianina 5 (PE/Cy5)</td><td>Bio Legend</td><td>3.9</td><td></td></tr><tr><td>Violeta brilhante 421</td><td>Bio Legenda</td><td>L161</td><td></td></tr><tr><td>PE-anti-mouse IgG2b</td><td>Bio Legend</td><td>51.1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (AF647)</td><td>Bio Legend</td><td>CD107a(H4A3)</td><td></td></tr></tbody></table>

integrar a citometria de fluxo de imagem e transcriptomic de criação de perfil para avaliar alterados cd1d endocítica tráfico

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Análises populacionais da alteração morfológica e funcional de proteínas endocítica são um desafio devido à demanda de captura de imagem em uma análise de imagem de nível e estatística única célula em um nível populacional. Para superar esta dificuldade, usamos imagens citometria de fluxo e transcriptomic (RNA-seq) de criação de perfil para determinar a Localização subcellular alterada do cluster da proteína de 1D de diferenciação (CD1d) associada com expressão gênica endocítica prejudicada em humanos células dendríticas (DCs), que foram expostas à comum lipofílico ar poluente benzo [a] pireno. O colocalization de CD1d e endocítica marcador Lamp1 proteínas de milhares de células imagens capturadas com imaging citometria de fluxo foi analisada usando ideias e ImageJ-Fiji programas. Numerosas imagens celulares com proteínas CD1d e Lamp1 co manchadas foram visualizadas após retenção na CD1d+Lamp1+ DCs usando ideias. O colocalization CD1d e Lamp1 reforçada em cima BaP exposição demonstrou-se ainda mais usando thresholded scatterplots, testado com coeficientes de Mander para intensidade co localizada e plotados com base na porcentagem de áreas co localizadas usando o ImageJ-Fiji. Nossos dados fornecem uma abordagem instrumental e bioinformatic vantajosa para medir colocalization de proteína em níveis celulares único e populacionais, apoiando um resultado funcional prejudicado de transcriptomic alteração em humanos expostos a poluentes DCs.

Os poluentes lipofílicos BaP altera aglomerados endocítica gene humano DCs. humanos derivados de monócitos DCs de cada doador (n = 3) foram incubadas com BaP e classificados para DCs convencionais, que foram mais utilizados para a análise do RNA extração e transcriptomic conforme descrito . Após a normalização da expressão gênica, genes alterados entre grupos BaP-expostos e não-expostos foram agrupados de acordo com a correlação funcional de genes diferencialmente expressos. Nós de entrad...

Citometria de fluxo de imagem fornece uma abordagem ideal para detectar a alteração morfológica e funcional das células em níveis individuais e populacionais. Função endocítica interrompida para apresentação de antigénios de lipídios em células dendríticas humanas expostas ao poluente foi demonstrada com um combinado transcriptomic perfis de expressão genética e morfológica demonstração do tráfico de proteína.

Integrar a citometria de fluxo de imagem e Transcriptomic de criação de perfil para avaliar alterados CD1d endocítica tráfico

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Esses métodos integram a análise de imagem de sequenciamento e citometria de fluxo da próxima geração. Pode ajudar a responder perguntas interessantes, como se algumas alterações fenotípicas estão implicando, em vez do transcriptome, especialmente no ambiente de exposição ao poluente. A principal vantagem deste método simples para nós é que podemos usá-lo para medir a colocalização de proteína biologicamente importante, para interpretar os resultados da expressão genética diferencial chave em um nível funcional.As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de desfechos patológicos e toxicológicos. Como uma abordagem normal de imager, forsee tem a capacidade de conectar expressão genética à função proteica. Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão devido às altas demandas técnicas da análise de imagem e transcrição.Para sequenciar a biblioteca de células dendríticas derivadas do monócito humano, primeiro carregue os reagentes sequenciamento e indexação na biosíntese e na indexação dos racks de reagentes, respectivamente, e coloque os racks em um banho de água de nível laboratorial por uma hora, até que todo o gelo tenha derretido, e os reagentes sejam misturados c

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O método IP-FCM é apresentado, o que permite uma sensível, avaliação, robusto bioquímica de espécies nativas interações proteína-proteína, sem a necessidade de engenharia genética ou grandes amostras.

FCM-IP: Imunoprecipitação Detectado por citometria de fluxo

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular fornece um método quantitativo de alto rendimento para estudar a interação proteína-proteína. Esta metodologia pode ser aplicada ao mapeamento de locais de ligação de proteína e para o rastreio de factores que regulam a interacção proteína-proteína.

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

fagocitose microglial é crítica para a manutenção da homeostase do tecido e da função fagocítica inadequada tem sido implicada na patologia. No entanto, a avaliação da função microglia in vivo é tecnicamente desafiador. Nós desenvolvemos uma técnica simples, mas robusta para monitorar com precisão e quantificar o potencial fagocítica da microglia em um ambiente fisiológico.

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Descrevemos aqui um método de isolamento para obtenção de linfócitos intraepiteliais endocervicais humanos para análise de células T gama delta intraepiteliais. Este protocolo pode ser estendido para a purificação de células T gama delta endocervicais por esferas magnéticas ou por classificação de células.

Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho completo para a análise qualitativa e quantitativa das sinapses imunes entre primárias células T humanas e células apresentadoras de antígeno. O método baseia-se na imagem citometria de fluxo, que permite a aquisição e a avaliação de várias imagens de milhares de células dentro de um período relativamente curto de tempo.

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

Um fluxo de ensaio de ligação celular baseados em citometria é descrito que é usado principalmente como uma ferramenta de triagem para identificar compostos que inibem a ligação de um ligante de chemokine CXC fluorescente etiquetada 12 (CXCL12) para o receptor do chemokine CXC 4 (CXCR4).

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para identificar compostos que interrompem a ligação do ligante de Chemokine fluorescente-etiquetadas CXC 12 a CXC Chemokine Receptor 4

O isolamento de células de implantes dissecados e sua caracterização por citometria de fluxo podem contribuir significativamente para o entendimento do padrão de resposta imune contra implantes. Este trabalho descreve um método preciso para o isolamento de células de implantes dissecados e sua coloração para análise por citometria de fluxo.

Citometria de fluxo de alta dimensionalidade para análise da função imune de tecidos dissecados de implantes

Este protocolo descreve um método de triagem de alto rendimento baseado em citometria de fluxo para identificar drogas de moléculas pequenas que inibem a ativação de integrinas β2 em neutrófilos humanos.

Uma Técnica de Alto Rendimento Baseada em Citometria de Fluxo para Triagem de Drogas Inibidoras de Integrinas

O influxo de cálcio, uma medida da sinalização de células T, é uma maneira eficaz de analisar as respostas à estimulação de receptores de células T. Este protocolo para multiplexação de Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular aproveita as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo.

Análise do Influxo de Cálcio Induzido por Receptores de Células T em Células T Primárias Murinas por Citometria de Fluxo de Espectro Completo

Este protocolo combina citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única para isolar e caracterizar os estados das células microgliais no cerebelo de cérebros de camundongos pós-natais precoces. Ele usa dissociação enzimática, centrifugação de Percoll e imunocoloração para revelar a heterogeneidade da microglia e melhorar a compreensão de seus papéis no desenvolvimento e doença cerebelar.

Citometria de fluxo e análise de célula única para caracterizar a ativação da micróglia no desenvolvimento cerebral de camundongos pós-natais precoces

Aprenda a integrar citometria de fluxo de imagem e transcriptômica para avaliar alterações no tráfego endocítico de CD1d em células dendríticas humanas expostas a poluentes. Este método conecta expressão gênica à função proteica.

Integrar a citometria de fluxo de imagem e Transcriptomic de criação de perfil para avaliar alterados CD1d endocítica tráfico

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