Avaliação da inclusão Exon induzida pela Splice Oligonucleotides Antisentidos comutação em fibroblastos de paciente de SMA
11 de maio de 2018
Vários oligonucleotídeos antisenso (AONs) foram mostrados para induzir exon inclusão (modulação da tala) e resgatar a expressão SMN para atrofia muscular espinhal (SMA). Aqui, descrevemos um protocolo para lipotransfection AON induzir inclusão exon do gene SMN2 e os métodos de avaliação para determinar a eficácia em pacientes fibroblastos SMA.
O objetivo geral deste protocolo de lipotransfecção é introduzir oligonucleotídeos antisense nas células e avaliar a eficácia desses medicamentos na inclusão de éxons em células SMA. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da terapia antisense. Tais como, a eficácia de novos oligos antisense para fornecer tratamento aos pacientes.
A principal vantagem desta técnica é que ela é rápida, fácil e sensível o suficiente para o teste de vários produtos químicos de oligonucleotídeos antisense. Embora esse método possa ser usado para a transfecção de oligos antisense em fibroblastos, ele também pode ser aplicado a outros tipos de células, como mioblastos primários e várias outras linhagens celulares. Demonstrando o procedimento estará Aleks, um técnico do meu laboratório.
Primeiro, descongele uma solução 10 micromolar de misturador de LNA / DNA no gelo. Diluir a solução do misturador em meios privados de soro até à concentração necessária num tubo de 1,5 mililitros. Em seguida, dilua o reagente de transfecção e adicione o reagente de transfecção diluído ao misturador na proporção de um para um.
É fundamental que a confluência celular seja de cerca de 65 a 80% durante a transfecção. Se a confluência for superior a 80%, a eficiência da transfecção será reduzida. Em seguida, incube a mistura de reagentes de transfecção em temperatura ambiente por 10 minutos.
Após 10 minutos, pipete 900 microlitros de meio privado de soro com 5% de soro bovino fetal para o tubo. Não adicione o FBS antes da incubação com o reagente de transfecção e os misturadores de LNA/DNA, pois isso também afeta a eficiência da transfecção. Em seguida, aspire o meio antigo da placa de cultura.
Agora, adicione um mililitro do meio contendo o misturador LNA / DNA à placa de cultura. Em seguida, deixe a placa na incubadora a 37 graus Celsius por 24 a 48 horas. Após a incubação, aspirar o meio da placa de cultura.
Em seguida, pipete um mililitro de reagente GPC para as células. Em seguida, lave os poços várias vezes com o reagente GPC. Após várias lavagens, recolher as células num tubo de 1,5 mililitros e manter as amostras no gelo.
Em seguida, vortex o tubo em alta velocidade por 30 segundos. Em seguida, armazene o tubo a menos 80 graus Celsius por uma hora. Agora, descongele a amostra em temperatura ambiente e rapidamente a vortex.
Em seguida, adicione 200 microlitros de clorofórmio à amostra e agite-a vigorosamente por 15 segundos. Em seguida, incube o tubo em temperatura ambiente por três minutos. Após três minutos, centrifugar a amostra a 12 000 g durante 15 minutos a quatro graus Celsius.
Terminada a centrifugação, recolher a fase aquosa da parte superior do tubo de centrifugação. Em seguida, transfira a fase aquosa para um novo tubo. Em seguida, adicione 500 microlitros de isopropanol e um microlitro de oito microgramas por microlitro de glicogênio grau RNA à fase aquosa.
Rapidamente vórtice a amostra por 10 segundos e incube em temperatura ambiente por 10 minutos. Após a incubação, centrifugar a amostra a 12 000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Transvase o sobrenadante após o término da corrida.
Adicione um mililitro de etanol frio a 75% e faça um vórtice breve para lavar o pellet obtido. Centrifugar novamente a amostra a 7500 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, expulse todo o etanol e seque o pellet em temperatura ambiente.
Depois que o pellet secar, dissolva-o em 30 microlitros de água livre de DNAse/RNAse. Em seguida, incube a amostra a 60 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, leia a concentração do RNA a 260 nanômetros no espectrofotômetro e ajuste-a para 15 nanogramas por microlitro.
Para constituir a mistura principal de RT-PCR, adicione o tampão de reação de dois X RT-PCR, mistura enzimática de RT-PCR de uma etapa, primers direto e reverso e água destilada livre de RNAse/DNAse. Distribua a mistura principal em tubos de PCR de 0,2 milímetro e adicione o RNA total para cada amostra respectiva. Em seguida, inicie a reação de PCR.
Após a conclusão do RT-PCR, adicione cinco microlitros de seis corantes de carga X ao produto amplificado. Em seguida, carregue cinco microlitros da mistura em um gel de agarose a 2%. Ligue a unidade de eletroforese a 100 volts por 40 minutos.
Primeiro, a eficiência de diferentes mixmers é estudada. Para isso, é analisada a inclusão dos níveis do exon 7 e GAPDH do SMN2 em fibroblastos SMA transfectados com os mixmers. A imagem do gel mostra a inclusão do éxon 7, onde as bandas superior e inferior representam o éxon 7 incluído e excluído do RNA SMN2.
A eficiência de inclusão também é quantificada em 78 a 98% quando transfectada com os misturadores de um a cinco. Por outro lado, nenhum resultado significativo é obtido quando o mixmer seis a oito é usado para transfectar os fibroblastos da AME do paciente em comparação com o controle. No experimento, o GAPDH é usado como controle.
Em seguida, a PCR quantitativa é feita para analisar a expressão relativa do SMN2 de comprimento total em comparação com o GAPDH. Um aumento acentuado na quantidade do nível de transcrito de SMN2 é observado quando transfectado com mixmers de um a três e número cinco, em comparação com o controle. O nível de expressão da proteína SMN também é estudado, o que mostra um aumento no nível de expressão da proteína SMN no fibroblasto do paciente transfectado com mixmers de um a cinco.
Observa-se um aumento acentuado de 1,5 a 1,9 vezes no nível de proteína SMN. Aqui, o controle usado é a cofilina. Pelo contrário, o misturador seis a oito não altera o nível de expressão da proteína SMN.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transfectar oligo antisense em fibroblastos e avaliar a eficácia in vitro.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo de lipotransfeção para introduzir oligonucleotídeos antisense (AONs) em células, com o objetivo de induzir a inclusão de éxons no gene SMN2, voltado para o tratamento da atrofia muscular espinhal (AME). A eficácia deste método é avaliada em fibroblastos de pacientes com AME.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Genética
- Biologia Celular
Contexto
- A atrofia muscular espinhal (AME) é uma doença genética que afeta os neurônios motores.
- Os oligonucleotídeos antissenso podem modular o splicing e restaurar a expressão de SMN.
- Métodos eficazes de entrega de OANs são cruciais para aplicações terapêuticas.
- Este protocolo permite o teste de diversas químicas de OANs.
Objetivo do Estudo
- Introduzir AONs em células de AME de forma eficaz.
- Avaliar a eficácia dos AONs na indução da inclusão de éxons.
- Fornecer um método rápido e sensível para testar AONs.
Métodos Utilizados
- Lipotransfeção de oligonucleotídeos antissenso em fibroblastos.
- Avaliação da inclusão de éxons no gene SMN2.
- Aplicação do método a diversos tipos celulares, incluindo mioblastos primários.
- Demonstração do procedimento por um técnico de laboratório.
Resultados Principais
- O método de lipotransfeção é eficaz para a entrega de AONs.
- A inclusão de éxons no gene SMN2 foi induzida com sucesso.
- O protocolo é adaptável a diferentes tipos celulares.
- Os resultados apoiam o potencial dos AONs como tratamento para a AME.
Conclusões
- Este protocolo de lipotransfeção é uma ferramenta valiosa para a pesquisa em terapia com oligonucleotídeos antissenso.
- Permite a avaliação rápida da eficácia de OANs em células de AME.
- Estudos futuros podem aprimorar este método para explorar novos OANs.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite uma avaliação rápida e sensível da eficácia de oligonucleotídeos antissenso (AON) na indução da inclusão do éxon SMN2 em fibroblastos derivados de pacientes, apoiando a validação precoce de alvos e a identificação de compostos líderes para terapias moduladoras de splicing. Ao quantificar a inclusão do éxon e a restauração da proteína em baixas concentrações de AON, fornece confiança preditiva para priorizar candidatos com maior potência e perfis reduzidos de toxicidade. A adaptabilidade do método entre diferentes tipos celulares e químicas facilita a redução de riscos pré-clínicos e a continuidade translacional nos pipelines de desenvolvimento de medicamentos para a AME.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a medição da eficiência da inclusão do éxon 7 do SMN2 como leitura funcional do engajamento do alvo.
- Valor Operacional: Utiliza RT-PCR e qPCR para quantificar a inclusão de éxons e os níveis de transcritos, fornecendo saídas quantitativas e reprodutíveis para a validação de alvos.
- Valor Preditivo: Demonstra a restauração dose-dependente da proteína SMN por meio de Western blot, apoiando a desconsideração mecanicista de riscos e a triagem de candidatos a AON no portfólio.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão do Ensaio: Estabelece um fluxo de trabalho baseado em lipotransfeção compatível com testes de alto rendimento de diversas químicas de AON, incluindo mixômeros de LNA/DNA.
- Reprodutibilidade: Padroniza as condições de transfeção (confluência de 65–80%, proporções de reagentes) e a normalização em relação aos controles de GAPDH e cofilina, garantindo consistência entre experimentos.
- Escalabilidade: Compatível com mioblastos primários e outras linhagens celulares, permitindo a reutilização da plataforma em diferentes modelos relevantes para doenças.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Utiliza fibroblastos de pacientes com AME para manter a fidelidade genética e fenotípica, aumentando a validade translacional dos dados de triagem de OANs.
- Continuidade Pré-clínica: Relaciona a inclusão de éxons à expressão da proteína SMN, fornecendo uma conexão mecanicista da modulação do alvo molecular à recuperação fenotípica funcional.
- Progressão com Risco Ajustado: Permite decisões de avançar/não avançar com base na eficiência de inclusão de éxons (78–98%) e na variação da expressão proteica (1,5–1,9), reduzindo o risco biológico em estágios avançados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e avaliação pré-clínica, permitindo a avaliação iterativa da eficácia de oligonucleotídeos antisense antes de estudos in vivo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos de mudança de sítio de corte mediante a quantificação da inclusão de éxons e a exclusão de efeitos fora do alvo por meio da normalização com GAPDH.
- Triagem: Oferece prontidão do ensaio e resultados quantitativos (porcentagem de inclusão de éxons, variação da expressão do transcrito) para avaliação confiável de compostos em diferentes químicas de AON.
- Análises: Gera resultados mensuráveis (quantificação de bandas de RT-PCR, expressão relativa de qPCR, níveis proteicos em Western blot) que permitem análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a eficácia molecular à restauração proteica em células derivadas de pacientes, apoiando o alinhamento de biomarcadores e a continuidade pré-clínica.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um protocolo padronizado de lipotransfeção aplicável a diversos tipos de AON e sistemas celulares, reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos por meio da medição direta da inclusão de éxons e restauração da proteína SMN.
- Valor Operacional: Garante padronização, reprodutibilidade e sensibilidade para testar diversas químicas de AON em baixas concentrações.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não ao associar a eficiência da inclusão de éxons à expressão proteica, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos a AON com base em limiares quantitativos de eficácia.
Considerações de Implementação
- Exige experiência no manuseio de ácidos nucleicos, otimização de transfeção e análise de RNA/proteínas.
- Depende da compatibilidade do reagente de transfeção, espectrofotômetro para quantificação de RNA e instrumentação para eletroforese em gel, qPCR ou Western blot.
- Requer padronização entre equipes das condições de transfeção (confluência, proporções de reagentes) e normalização com controles (GAPDH, cofilina) para resultados reprodutíveis.
- A adaptação a mioblastos primários ou outras linhagens pode exigir otimização da eficiência de transfeção e avaliação de citotoxicidade.
- As limitações práticas incluem a variabilidade no número de passagens de fibroblastos de pacientes e a necessidade de preservar a integridade do RNA durante a extração.
