Name: Avaliação da inclusão Exon induzida pela Splice Oligonucleotides Antisentidos comutação em fibroblastos de paciente de SMA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprenda a técnica de lipotransfecção para introduzir oligonucleotídeos antissenso em fibroblastos de pacientes com atrofia muscular espinhal, avaliando a inclusão do éxon 7 no gene SMN2. Este método rápido e sensível permite testar diferentes químicas de AONs para terapia gênica.

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Os autores agradecer Nicole McRorie ajuda com os experimentos. Este trabalho foi apoiado pela faculdade de medicina e odontologia, Slipchuk SMA Research Foundation Research Grant, institutos canadenses de pesquisa da saúde (CIHR), os amigos de Garrett Cumming pesquisa fundos, HM Toupin neurológico da Universidade de Alberta Fundos de investigação científica, o Canadá de Distrofia Muscular, a Fundação do Canadá para a inovação, Alberta Enterprise e educação avançada e as mulheres e das crianças Instituto de pesquisa de saúde (WCHRI).

1. cultura de pilha
<ol><li>SMA de cultura de fibroblastos paciente no meio de crescimento (Dulbecco modificado águia médio 1:1-12 (presunto) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 0,5% penicilina/estreptomicina) numa incubadora de CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Determinar a concentração de células usando um contador de célula automatizada e diluir as células a 1 x 105 células/mL no meio de crescimento, em seguida, sementes no prato apropriado. Use placas boas 12 (1 mL por bem) por RT-PCR ou qPCR.</li>
	<li>Incubar as placas por 24 h numa incubadora de CO2 a 37 ° C.</li>
</ol>2. transfecção de mixmer LNA/DNA
<ol><li>Certifique-se de confluência de célula de cerca de 65-80% de eficiência optimal do transfection.</li>
	<li>Descongele a 10 μM LNA/DNA mixmers lentamente no gelo.</li>
	<li>Em um tubo de 1,5 mL, prepare uma solução de x mixmer a 20, adicionando o mixmers aos meios privados de soro para que o volume final atinge 50 μL.</li>
	<li>Misture a solução de mixmer com 50 μL de meios privados de soro contendo o reagente de Transfeccao de 3% (proporção de 1:1).</li>
	<li>Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicionar 900 μL privado de soro o meio com 5% FBS para cada tubo.</li>
	<li>Aspirar a velha mídia da placa e substituir com 1 mL de solução de mixmer LNA/DNA contendo o reagente de transfeccao.</li>
	<li>Incube as celulas por 24-48 h a 37 ° C numa incubadora de CO2 .</li>
</ol>3. extração do RNA
<ol><li>Remover o meio e adicione 1 mL do reagente de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidínio às células. Lave a parte inferior dos bem várias vezes com guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio e recolhê-la nos tubos de 1,5 mL.</li>
	<li>Vórtice em alta velocidade por 30 s e loja a-80 ° C durante 1 h ou durante a noite.</li>
	<li>Descongele as amostras em temperatura ambiente e vórtice bem.</li>
	<li>Adicionar 200 clorofórmio µ l, agitar vigorosamente por 15 s e incubar a temperatura ambiente por 3 min.</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Recolha a fase aquosa clara superior para um tubo novo. Certifique-se de evitar coletar qualquer a interfase branca que se forma entre as fases superiores e inferiores.</li>
	<li>Adicionar 500 µ l isopropanol e 1 µ l 8 µ g / µ l glicogênio (grau de RNA). Vórtice de 10 s e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos ou a-20 ° C durante a noite.</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C e remover todo o sobrenadante. Forma a uma bolinha branca na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de etanol a 75% frio e centrifugar a 7.500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Retire todo o etanol e seque a pelota à temperatura ambiente até não sobrar nenhuma etanol no tubo.</li>
	<li>Dissolva a pelota em 30 µ l DNase/RNase livre água e incubar durante 10 minutos a 60 ° C.</li>
	<li>Medir a concentração de RNA usando um espectrofotômetro (em 260 nm) e ajustar a concentração de RNA para 50 ng / µ l.</li>
</ol>4. um passo de RT-PCR para medir a taxa de inclusão exon de SMN2
<ol><li>Mix 12,5 µ l de 2x do amortecedor da reação de RT-PCR, mistura de 1,0 µ l da enzima de RT-PCR de uma etapa, 0,5 µ l de cada primer (SMN2 em frente: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 inverso: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH para a frente: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH inverso: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µ l de RNA total (50 ng / µ l), e água destilada, 8,5 µ l de RNase/DNase-livre.</li>
	<li>Depois que o cDNA é sintetizado a 50 ° C por 15 min, inicie a reação de PCR. Amplificar o SMN2 exon 6-8 com 30 ciclos PCR (94 ° C por 15 s, 60 ° C por 30 s, 68 ° C por 25 s). Amplificar a GAPDH com 20 ciclos PCR (94 ° C por 15 s, 60 ° C por 30 s, 68 ° C por 20 s).</li>
	<li>Adicionar 5 μL 6 x tintura para o produto do PCR, de carga e carregar 5 µ l da mistura em um gel de agarose 2% e correr por 40 min a 100 V.</li>
	<li>O gel de imagem e analisá-lo usando software ImageJ.</li>
	<li>Medir a intensidade das bandas completos e bandas Δ7. Calcular a taxa do exon 7 inclusão pelo valor de intensidade de (completos) / (full-length + Δ7 SMN2).</li>
</ol>5. quantitativo PCR (qPCR) para medir a taxa de inclusão exon de SMN2
<ol><li>Para a síntese do cDNA, misture 1 µ l Oligo dT, 1 µ l 10mm dNTPs e 11 µ l total do RNA (50 ng / µ l). Incube a 65 ° C por 5 min.</li>
	<li>Colocar as amostras no gelo e adicionar 4 µ l 5 x tampão, 1 µ l 0,1 M DTT, 1 inibidor de RNase µ l e o transcriptase reverso 1 µ l de cada amostra.</li>
	<li>Incubar a 50 ° C por 60 min e aquecer até 80 ° C por 10 min parar a reação. O cDNA pode ser armazenado a-20 ° C.</li>
	<li>Dilua os cDNAs com água livre de RNase (diluição 1:5). Mix 10 µ l 2 x mistura de enzima SYBR Green qPCR, primeira demão de 10 µM cada 0,8 µ l (longa-metragem SMN2 em frente: 5 '-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3 ', longa-metragem SMN2 reverso: 5 '-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3 ′, Δ7 SMN2 em frente: 5 ' - TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 inverso: 5 '-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3 ′, GAPDH para a frente: 5 '-GCAAATTCCATGGCACCGT-3 ′, GAPDH inverter: 5 '-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3 '), 3 µ l diluída de cDNA e água livre de RNase a µ l 5.4.</li>
	<li>Inicie a reação de qPCR. Use as condições: 95 ° C por 30 s e, em seguida, um ciclo de 40 repita a 95 ° C por 5 s e 60 ° C durante 20 s.</li>
	<li>Calcular a expressão relativa de longa-metragem SMN2 para GAPDH ou Δ7 SMN2e normalizar às células não tratadas com o algoritmo ΔΔCt.</li>
</ol>6. mancha ocidental
<ol><li>Remover a transfeccao de células e lave uma vez com tampão fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Adicione 100 µ l amortecedor do lysis com um inibidor da protease.</li>
	<li>Separar as células da parte inferior de cada poço com uma espátula de célula estéril e coletar em tubos de 1,5 mL. Incube as amostras no gelo por 30 min.</li>
	<li>Passe celular lisado agulha 21-G 10 vezes para esmagar as células.</li>
	<li>Centrifugar a 20.800 x g, durante 15 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante para novos tubos de 1,5 mL. A amostra pode ser armazenada em um congelador de-80 ° C.</li>
	<li>Determinar a concentração de proteína usando um Kit de ensaio de proteína BCA e ajustar a concentração de 1,0 µ g / µ l.</li>
	<li>Mistura de 5 µ l amostras e 5 µ l 2 x buffer de amostra de sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS) (SDS 10%; 14% 0,5 M solução de Tris-HCl, pH 6.7; 0,5 M 1% com a solução de EDTA-2Na, pH 8.0; 20% glicerol; tintura de azul de bromofenol 0,004%, 5% β-Mercaptoetanol) e aquecer a 70 ° C por 10 min.</li>
	<li>Carregar as amostras em um 4-12% proteína Bis-Tris géis e executada por 1h em 150 V.</li>
	<li>Molhe um papel de filtro grosso em cada buffer: (buffer de ânodo concentrado: 0.3 M Tris-HCl, 20% de metanol; buffer de ânodo: 0,03 M Tris-HCl, 20% de metanol; buffer de cátodo: 25 mM Tris, 20% de metanol, o ácido 6-amino-n-hexanoico 40mm, 0,01% SDS).</li>
	<li>Mergulhe uma membrana (PVDF) de difluoreto de polivinilideno em metanol por 20 s, em seguida, transferi-lo para o buffer do ânodo.</li>
	<li>Equilibrar o gel depois de SDS-PAGE com o buffer do cátodo por 5-10 min sob agitação.</li>
	<li>Coloque os papéis de filtro, membranas PVDF e o gel em uma máquina de mancha semi-seca, como segue: concentrado ânodo reserva papel/ânodo reserva papel/PVDF/proteína de membrana gel/cátodo reserva papel (Figura 2).</li>
	<li>Cobrir a pilha e iniciar a transferência de 20 V por 30 min.</li>
	<li>Após a transferência, enxágue a membrana PVDF com PBST (PBS com 0,05% Tween 20) uma vez.</li>
	<li>Bloquear a membrana à temperatura ambiente por 30 min em 5% leite desnatado em pó dissolvido em PBST ou a 4 ° C, durante a noite.</li>
	<li>Dilua um anticorpo anti-SMN de rato purificado e um anticorpo anti-Cofilin 1:10,000 em 5% de leite desnatado em pó em PBST. Incube a membrana nele por 1h à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Lavar 3 vezes com PBST por 10 min.</li>
	<li>Dilua a anticorpos secundários (anti-rato caprinos conjugados a HRP e anti-rabbit IgG (H + L)) para 1:10,000 em 5% de leite desnatado em pó em PBST. Encube por 1h à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Lave a membrana 3 vezes com PBST por 10 min.</li>
	<li>Detecta o sinal de banda usando a kit de deteção mancha ocidental de quimioluminescência.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O in vitro avaliação método descrito aqui é rápido, fácil e sensível o suficiente para o teste de vários AONs. Este protocolo é amplamente aplicável a exon saltando e inclusão de outros genes e vários tipos de células. Além disso, a maioria dos produtos químicos AON (exceto PMOs) podem transfected usando esse método. AONs pode regular a emenda de pre-mRNA de genes endógenos e artificialmente introduzidos e pode ser co transfectadas com vetores de plasmídeo carregando genes alvo.
Uma e...

Atrofia muscular espinhal (SMA) é uma desordem neuromuscular fatal herdada em um padrão autossômico recessivo. É caracterizado pela degradação dos neurônios motores e tronco progressivo e21,paralisia do músculo membro. A maioria das ocorrências de SMA são devido a uma mutação homozigótica no gene de sobrevivência do neurônio motor 1 (SMN1)3. O gene de sobrevivência do neurônio motor 2 (SMN2) é uma duplicata inversa de SMN1e tem uma sequência praticamente idêntica, diferindo por apenas cinco bases4,5. Uma transição de C-a-T em SMN2 localizado no exon 7 faz o gene quase não funcionam porque a mutação leva o essencial exon 7 sendo excluídos em quase 90% de SMN2 transcrições (Figura 1um). MRNAs SMN2 faltando exon 7 não pode compensar a função SMN1 porque seu produto proteico é instável e é rapidamente degradado.
Terapia antisentida recentemente emergiu como uma estratégia promissora para o tratamento de SMA6. A recente aprovação de nusinersen por o E.U. Food and Drug Administration (FDA) disponibilizou o primeiro medicamento para o tratamento de SMA7. Nusinersen é uma 18-mer antisentido oligonucleotide (AON) com uma modificação de 2 '-O-metoxietílico (MOE) e um backbone phosphorothioate. A droga alveja o silenciador emenda intrônicas N1 (ISS-N1) localizado no intron 7 do gene SMN2 . Ligação de nusinersen de ISS-N1 promove a recuperação funcional expressão de proteína SMN completos do gene SMN2 endógenos induzindo exon 7 inclusão (Figura 1um)8,9,10 . Atualmente, muitos estudos envolvendo terapia AON para SMA focar investigando romance químicos AON que podem ser mais eficaz e menos tóxico do que nusinersen. Foi demonstrado que AONs com outros químicos induzem também eficientemente exon inclusão em SMN2 exon 7 tanto in vitro e in vivo11,12,13.
Ácidos nucleicos bloqueados (LNAs) são modificados quimicamente análogos de RNA contendo uma ponte metileno conectando ocarbono 4 ' - com o 2 ' -oxigênio dentro da estrutura (Figura 1b) de furanose14,15. Em comparação com DNAs ou RNAs, LNAs têm uma maior afinidade para ligação a sequências de RNA complementares e têm o benefício adicionado de ser altamente resistente à nucleases endógenas. A química do LNA foi aplicada para uso como sondas de fluorescência em situ da hibridação (peixe) e qPCR16,17. Além disso, é utilizado para regular a expressão gênica tanto in vitro e in vivo. GapmeR AONs são uma combinação de moléculas de ADN single-stranded, ladeado por vários LNAs nas extremidades 5 ' e 3 '. Eles Derrubem a expressão gênica por ligação complementares de mRNAs alvo, levando-os a ser degradada por RNase H registrados18. LNA/DNA mixmers são AONs que são compostas de nucleotídeos do DNA integrados entre LNAs. Apresentados na presente orientação eles podem vincular miRNA para inibir sua função (LNA-antimiR)19. Alguns LNA-antimiRs atingiram o desenvolvimento clínico. Para exemplos, miravirsen (AntimiR-122) é um LNA-antimiR que inibe a miR-122 para tratar a infecção da hepatite C e vários ensaios clínicos de fase II estão actualmente em curso19,20. Recentemente, foi demonstrado que o LNA/DNA mixmers também pode modular21o splicing de RNA. Pode ligar uma sequência específica de mRNA e induzir exon saltando na inclusão de mRNA e exon distrofina em SMN2 mRNA em vitro13,22.
Neste artigo, descrevem uma metodologia para a indução do exon inclusão usando AONs e a avaliação de eficácia a nível do RNA e proteína. Para exemplificar este método, usamos o LNA/DNA mixmers direcionamento ISS-N1 no intron 7 de SMN2. AONs transfectadas em SMA pacientes células por lipotransfection induziram exon 7 inclusão no final SMN2 transcrição e upregulation de produção de proteína SMN. Uma das vantagens de usar o LNA/DNA mixmers para induzir a exon inclusão é que a concentração eficaz para o transfection é significativamente menor do que outros produtos químicos13. Esse método pode ser usado para muitos outros AONs exceto phosphorodiamidate Morpholinos oligómeros (PMOs), que, devido a sua carga neutra, precisam inserir células através de endocitose induzida pelo reagente de transfeccao co Endo-Porter.

<table><tbody><tr><td>Fibroblastos SMA</td><td>Coriell NIGMS repositório de células genéticas humanas</td><td>GM03813</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho</td> <td>de fenolThermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Meios privados de soro</td><td>Reagente</td><td>de</td> transfecção 31985070 <td></td>Thermo</tr><tr><td></td><td>Fisher Thermo Fisher</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>tiocianato-fenol-clorofórmio de guanidínio (TRIzol)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR Primers</td><td></td><td></td><td>Sequência 5' a 3'SMN2</td></tr> <tr><td>para frente:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>CTGCCTCCATTTCCTTCTG</td></tr><tr><td>SMN2 reverso:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC</td></tr><tr><td>GAPDH para a frente:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>TCCCTGAGCTGAACGGGAAG</td></tr><tr><td>GAPDH reverso:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>GGAGGAGTTTGGTCGCTGT</td></tr><tr><td>qPCR Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMN2 de comprimento total para a frente:</td><td></td><td></td><td>GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT</td></tr><tr><td>SMN2 de comprimento total reverso:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT</td></tr><tr><td>GAPDH para a frente:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>GCAAATTCCATGGCACCGT</td></tr><tr><td>GAPDH reverso:</td><td></td><td></td><td>AGGGATCTCGCTCCTGGAA</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio, grau de RNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de coquetel de protease&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr>Amortecedor <td></td><td></td><td>Catódico</td><td>0.025 M Base Tris + 40&nbsp; mM Ácido 6-aminocapróico + 20%</td></tr><tr><td>de tampão</td><td></td><td></td> de ânodo de metanol <td>0,03 M Base de Tris + 20%</td></tr><tr><td>de tampão</td><td></td><td></td> de ânodo concentrado de metanol <td>0,3 M de base de Tris + 20% de metanol</td></tr><tr><td>Beta mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Membrana Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>PVDF&nbsp;</td><td>GE</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de carregamento/amostra para Western blotting</td><td>NuPage Invitrogen</td><td>NP007</td><td></td></tr><tr><td>One-Step RT-PCR kit&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Clontech</td><td>3040</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da inclusão exon induzida pela splice oligonucleotides antisentidos comutação em fibroblastos de paciente de sma

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

Atrofia muscular espinhal (SMA), uma doença neurológica letal causada pela perda de SMN1, apresenta um caso único no campo do oligonucleotide antisentido (AON)-mediada por terapia. Enquanto SMN1 mutações são responsáveis pela doença, AONs tala intrônicas silenciador (ISS) em sítios em SMN2, incluindo nusinersen aprovado pela FDA, foram mostrados para restaurar a expressão SMN e amenizar os sintomas. Atualmente, muitos estudos envolvendo terapia AON para SMA focar investigando romance químicos AON direcionamento SMN2 que pode ser mais eficaz e menos tóxico do que nusinersen. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliação em vitro de exon inclusão usando lipotransfection de AONs seguido por reação em cadeia da polimerase transcrição reversa (RT-PCR), reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e mancha ocidental. Esse método pode ser empregado para vários tipos de produtos químicos da AON. Usando esse método, demonstramos que AONs composto de alternadas (LNAs) os ácidos nucleicos bloqueados e nucleotídeos do DNA (LNA/DNA mixmers) levam a eficiente SMN2 exon inclusão e restauração da proteína SMN em uma concentração muito baixa e portanto, LNA / Oligonucleotides antisentido baseado em mixmer de DNA podem ser uma estratégia terapêutica atraente para tratar a emenda defeitos causados por doenças genéticas. O in vitro avaliação método descrito aqui é rápido, fácil e sensível o suficiente para o teste de vários AONs romance.

Usando o pacientes fibroblastos SMA, escolhemos a região de silenciador de ISS-N1 no intron 7 do gene SMN2 com oito mixmers LNA/DNA antisentidos diferentes que foram transfectadas com uma concentração de 5 nM (Figura 3). Cada um do mixmers contido uma espinha dorsal modificada phosphorothioated que lhes permitiu resistir a degradação da nuclease. Para avaliar a eficácia da mixmers, a taxa de SMN2 exon 7 inclusão foi quantificada por RT-PCR e...

Vários oligonucleotídeos antisenso (AONs) foram mostrados para induzir exon inclusão (modulação da tala) e resgatar a expressão SMN para atrofia muscular espinhal (SMA). Aqui, descrevemos um protocolo para lipotransfection AON induzir inclusão exon do gene SMN2 e os métodos de avaliação para determinar a eficácia em pacientes fibroblastos SMA.

Avaliação da inclusão Exon induzida pela Splice Oligonucleotides Antisentidos comutação em fibroblastos de paciente de SMA

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

O objetivo geral deste protocolo de lipotransfecção é introduzir oligonucleotídeos antisense nas células e avaliar a eficácia desses medicamentos na inclusão de éxons em células SMA. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da terapia antisense. Tais como, a eficácia de novos oligos antisense para fornecer tratamento aos pacientes.A principal vantagem desta técnica é que ela é rápida, fácil e sensível o suficiente para o teste de vários produtos químicos de oligonucleotídeos antisense. Embora esse método possa ser usado para a transfecção de oligos antisense em fibroblastos, ele também pode ser aplicado a outros tipos de células, como mioblastos primários e várias outras linhagens celulares. Demonstrando o procedimento estará Aleks, um técnico do meu laboratório.Primeiro, descongele uma solução 10 micromolar de misturador de LNA / DNA no gelo. Diluir a solução do misturador em meios privados de soro até à concentração necessária num tubo de 1,5 mililitros. Em seguida, dilua o reagente de transfecção e adicione o reagente de transfecção diluído ao misturador na proporção de um para um.É fundamental que a confluência celular seja de cerca de 65 a 80% durante a t

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Medicine

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Os eventos de splicing em tandem ocorrem em locais separados por menos de 12 nucleotídeos. A quantificação das proporções de tais variantes de splice é viável usando uma abordagem de PCR quantitativa absoluta. Este manuscrito descreve como as variantes de splice do gene STAT3, nas quais dois eventos de splicing resultam na inclusão/exclusão de Serine-701 e α/β C-termin, podem ser quantificadas.

Mesclando Absoluto e dados relativos PCR quantitativo para quantificar STAT3 Splice Variant Transcrições

Este relatório descreve um método de bioengenharia para conceber e construir novos factores de splicing artificial (ASFS) que modulam especificamente a splicing de genes alvo em células de mamífero. Este método pode ser expandido para manipular vários fatores artificiais para manipular outros aspectos do metabolismo do ARN.

Engenharia de fatores artificiais para manipular Especificamente splicing alternativo em células humanas

É descrito um em situ protocolo de hibridação (ISH) que usa oligonucleotides antisentidos curtos para detectar padrões de splicing alternativo pre-mRNA nas seções de cérebro de rato.

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

São protocolos detalhados para ambos in vitro e na célula seletiva 2'-hidroxila acilação analisados por experiências de extensão (forma) da primeira demão para determinar a estrutura secundária das sequências pre-mRNA de interesse na presença de uma pequena molécula de RNA-direcionamento apresentada neste artigo.

Usando em forma de Vitro e na célula para investigar a pequena molécula induzida por alterações estruturais Pre-mRNA

Aqui, apresentamos a caracterização molecular da expressão distrofina 38 usando sequenciamento Sanger, RT-PCR e mancha ocidental no ensaio clínico.

Caracterizando Exon Pulando Eficiência em Amostras de Pacientes DMD em Ensaios Clínicos de Oligonucleotídeos Antisamescenos

Este protocolo descreve a conversão de fibroblastos de pele em míobios e sua diferenciação em miotubes. As linhas celulares são derivadas de pacientes com distúrbios neuromusculares e podem ser usadas para investigar mecanismos patológicos e testar estratégias terapêuticas.

Reprogramação Direta de Fibroblastos Humanos em Myoblasts para investigar terapias para distúrbios neuromusculares

Este protocolo apresenta uma ferramenta rápida e útil para avaliar o papel de uma proteína com função não caracterizada na regulação alternativa de emenda após o tratamento quimioterápico.

Usando a ferramenta E1A Minigene para estudar alterações de emenda mRNA

O splicing alternativo (AS) e a poliadenilação alternativa (APA) expandem a diversidade de isoformas de transcritos e seus produtos. Aqui, descrevemos protocolos de bioinformática para analisar ensaios de RNA-seq em massa e sequenciamento final de 3' para detectar e visualizar AS e APA variando entre condições experimentais.

Identificação de Splicing Alternativo e Poliadenilação em Dados de RNA-seq

Este protocolo descreve um ensaio de repórter minigene para monitorar o impacto de mutações de 5'-splices no splicing e desenvolve snRNA supressor U1 para o resgate da inibição de emenda induzida por mutação. As construções de snRNA do repórter e supressor U1 são expressas em células HeLa, e o splicing é analisado por extensão de primer ou RT-PCR.

Um ensaio celular baseado em repórter para monitorar a eficiência do splicing

O ensaio ACT1-CUP1, um ensaio de crescimento de cobre, fornece uma leitura rápida do splicing de RNA mensageiro precursor (pré-mRNA) e do impacto que os fatores de splicing mutantes têm na função spliceossomal. Este estudo fornece um protocolo e destaca a personalização possível para abordar a questão do splicing de interesse.

Ensaios de ACT1-CUP1 determinam as sensibilidades específicas do substrato de mutantes spliceossomais em leveduras em brotamento

Aprenda a técnica de lipotransfecção para introduzir oligonucleotídeos antissenso em fibroblastos de pacientes com atrofia muscular espinhal, avaliando a inclusão do éxon 7 no gene SMN2. Este método rápido e sensível permite testar diferentes químicas de AONs para terapia gênica.

Avaliação da inclusão Exon induzida pela Splice Oligonucleotides Antisentidos comutação em fibroblastos de paciente de SMA

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