Förster homogênea de tempo-resolvido ressonância energia baseada em transferência ensaio para detecção de secreção de insulina
10 de maio de 2018
Aqui, apresentamos homogênea tempo resolvido FRET (HTRF) como um método eficiente para detecção rápida de insulina secretada de células.
O objetivo geral deste procedimento é induzir e quantificar com precisão os níveis de insulina secretada pelas células secretoras de insulina. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do diabetes, como os principais mecanismos sob a secreção de insulina estimulada por glicose nas células beta pancreáticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode quantificar com precisão e rapidez a secreção de insulina em resposta à estimulação da glicose e detectar possíveis efeitos da droga na secreção.
As implicações dessa técnica se estendem à terapia e à descoberta de medicamentos para o tratamento do diabetes tipo 2, porque nos permitirá entender melhor os mecanismos da disfunção metabólica induzida por medicamentos. Embora esse método possa fornecer informações sobre a secreção de insulina de linhagens de células beta imortalizadas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como ilhotas pancreáticas intactas. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, devido a várias etapas de manuseio de células e preparações de medicamentos.
Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando queríamos criar um ensaio rápido para investigar as ações das drogas dopaminérgicas na secreção de insulina. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de manuseio das células são difíceis de aprender devido à natureza delicada das células e à importância da precisão para garantir a consistência do ensaio entre os experimentos. Primeiro, aumente as células INS-1E conforme descrito no protocolo de texto.
Assim que as células atingirem a confluência desejada, aspirar o meio. Lave as células com cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de 025% de tripsina às células e deixe-as na incubadora por três a quatro minutos a 37 graus Celsius.
Desative a tripsina adicionando nove mililitros de meio completo. Em seguida, transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue as células para formar um pellet.
Após centrifugação, dissolva o pellet em cinco mililitros de meio fresco. Pipete 10 microlitros das células ressuspensas do tubo e misture com 10 microlitros de corante vital azul de tripano para avaliar a viabilidade. Em seguida, use um hemocitômetro para contar o número de células vivas e mortas e garantir que 90% das células estejam vivas.
Após a contagem, adicione um milhão de células por mililitro em meio RPMI 1640 fresco e, em seguida, semeie 0,5 mililitros de 500.000 células INS-1E em cada poço de uma placa de 24 poços revestida com poli-L-lisina. Deixe o prato na incubadora por um dia inteiro. No dia seguinte, remova o meio e adicione 500 microlitros de meio RPMI 1640 fresco em cada um dos poços.
Incube a placa por mais 24 horas para que as células se espalhem nas superfícies do poço. Para realizar o ensaio, primeiro prepare o tampão KRB, depois aspire o meio de cada um dos poços e lave com solução salina tamponada com fosfato pré-aquecido, duas vezes. Em seguida, adicione 450 microlitros de tampão KRB, suplementado com albumina de soro bovino, mas sem glicose, em cada poço.
Deixe a placa de cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora. Prepare diluições seriadas dos medicamentos em tampão KRB, suplementado com concentração final de 10X de glicose 200 milimolar. Após a etapa de falta de glicose, pipetar 50 microlitros de medicamentos diluídos em série em cada um dos poços correspondentes.
Para estimulação da glicose, adicione os respectivos medicamentos diluídos em série na presença de glicose 20 milimolar. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius por 90 minutos. Terminada a estimulação, colete os sobrenadantes e transfira-os para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro rotulados.
Transfira 10 microlitros de cada sobrenadante coletado para uma placa de 96 poços. Adicione 90 microlitros de KRB a cada poço para obter uma proporção de diluição de um para 10. Misturar as diluições para assegurar a homogeneidade.
Em seguida, obtenha a curva padrão de insulina para o ensaio de insulina HTRF. Em seguida, adicione 10 microlitros a cada uma das amostras de insulina padrão e os sobrenadantes de ensaio diluídos a uma placa de 96 poços. Preparar a mistura de anticorpos num dador de um a dois dadores para aceitar uma proporção no tampão de detecção.
Depois de preparar a mistura de anticorpos, adicione 30 microlitros a cada um dos poços em uma placa de 96 poços. Sele a placa e incube em temperatura ambiente. Após duas horas de incubação, leia a placa com a mistura de anticorpos no leitor de placas.
Use o módulo óptico HTRF apropriado em 665 e 620 nanômetros para a leitura e use 200 flashes para cada poço. Primeiro, uma curva padrão de insulina é plotada para extrapolar os valores reais de insulina das amostras de ensaio. A curva padrão mostra que a leitura de fluorescência raciométrica obtida aumenta significativamente em função das concentrações padrão de insulina humana pré-definidas.
Em seguida, o nível basal de secreção de insulina das células INS-1E é estudado na presença ou ausência de glicose 20 milimolar. A partir do gráfico, mostra que as células secretam aproximadamente 100 nanogramas por mililitro de insulina na presença de glicose. Curiosamente, o nível de insulina é quase a metade, aproximadamente 15 nanogramas por mililitro na ausência de glicose.
Em seguida, as células são incubadas na presença de concentrações crescentes de dopamina com glicose 20 milimolar. A insulina secretada é normalizada para o valor médio da porcentagem máxima de insulina de cada poço. O gráfico mostra que a dopamina inibe o GSIS, indicando assim a importância funcional dos receptores dopaminérgicos no GSIS.
Este gráfico mostra que a bromocriptina, um medicamento para diabetes tipo 2, é mais potente na indução de GSIS do que a dopamina. Este gráfico mostra que, com o aumento da concentração de quinpirol, um agonista D2, embora menos eficiente que a bromocriptina, mostra potência semelhante à dopamina na estimulação do GSIS. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro a cinco horas se for executada corretamente.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de pipetar com cuidado e consistência. Após este procedimento, outros ensaios funcionais, como o ensaio AMP HDRF cíclico, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como os efeitos dos medicamentos dopaminérgicos na sinalização a jusante. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do metabolismo explorarem outras vias secretoras endócrinas em linhagens celulares imortalizadas e ilhotas pancreáticas.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir com precisão a secreção de insulina das células usando HDRF.
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Visão Geral
Este artigo apresenta a FRET resolvida no tempo homogênea (HTRF) como um método eficiente para a detecção rápida de insulina secretada por células. A técnica é particularmente relevante para o entendimento da secreção de insulina estimulada por glicose em células beta pancreáticas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa sobre diabetes
- Mecanismos de secreção de insulina
- Ensaios celulares
Contexto
- A secreção de insulina é crucial para o metabolismo da glicose.
- Compreender os mecanismos de secreção pode auxiliar na terapia do diabetes.
- Os métodos atuais podem apresentar falta de velocidade e precisão.
- O HTRF oferece uma alternativa promissora para quantificação.
Objetivo do Estudo
- Quantificar com precisão a secreção de insulina por células secretoras de insulina.
- Explorar os mecanismos da secreção de insulina estimulada por glicose.
- Avaliar os efeitos de fármacos sobre a secreção de insulina.
Métodos Utilizados
- Técnica de FRET homogênea resolvida no tempo (HTRF).
- Indução da secreção de insulina em células beta pancreáticas.
- Quantificação dos níveis de insulina em resposta à glicose.
- Aplicação tanto a linhagens celulares imortalizadas quanto a ilhotas pancreáticas intactas.
Resultados Principais
- O HTRF permite a medição rápida e precisa da secreção de insulina.
- Identificou mecanismos-chave da secreção estimulada por glicose.
- Demonstrou o potencial para aplicações na descoberta de fármacos.
- Forneceu insights sobre a disfunção metabólica relacionada ao diabetes.
Conclusões
- O HTRF é uma ferramenta valiosa para a pesquisa sobre diabetes.
- Amplia a compreensão da dinâmica da secreção de insulina.
- Pode facilitar avanços nas estratégias terapêuticas para o diabetes tipo 2.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação precisa da secreção de insulina é essencial para reduzir os riscos em programas de descoberta de fármacos para o diabetes, permitindo a avaliação mecanicista dos efeitos de compostos sobre a secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS). O ensaio baseado em HTRF fornece uma leitura rápida, reprodutível e escalonável, que apoia a validação precoce de alvos e a identificação de compostos promissores na pesquisa de doenças metabólicas. Ao fornecer dados quantitativos de fluorescência ratiométricos, o método aumenta a confiança preditiva no perfil farmacológico de moduladores dopaminérgicos e outros secretagogos de insulina.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relativas à regulação dopaminérgica da secreção de insulina.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos, como receptores semelhantes ao D2, por meio da inibição dependente da dose da secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS).
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao distinguir a potência e eficácia de compostos na modulação da liberação de insulina.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão para ensaio: Gera medições quantitativas padronizadas de insulina adequadas para formatos de triagem de alto rendimento.
- Reprodutibilidade: Fornece sinais robustos com baixa variância devido à resistência à interferência do FRET com resolução temporal.
- Escalabilidade: Compatível com formatos de placas de 96 poços, permitindo testes paralelos de bibliotecas de fármacos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela a dinâmica secretória humana de insulina utilizando células INS-1E, uma linhagem derivada de insulinoma de rato relevante para a função das células beta.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas iniciais à validação pré-clínica ao confirmar os efeitos de fármacos na SISG.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece o envolvimento de vias específicas (por exemplo, sinalização dopaminérgica) antes de avançar compostos para estudos in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio de insulina HTRF insere-se na continuidade da descoberta, desde a triagem do engajamento do alvo até a validação funcional em programas de doenças metabólicas, especialmente nos casos em que a secreção de insulina atua como um biomarcador farmacodinâmico fundamental.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias que regulam a exocitose da insulina, como a inibição mediada por RCPG do cAMP.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios e a quantificação reprodutível de insulina em sobrenadantes de cultura.
- Análises: Fornece leituras ratiométricas HTRF em 665 nm e 620 nm que permitem a extrapolação das concentrações de insulina por meio de curvas-padrão.
- Pesquisa Translacional: Conecta dados de secreção in vitro a relevância pré-clínica ao modelar as respostas de células beta humanas à glicose e a fármacos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar diversos secretagogos e compostos inibitórios em diferentes indicações metabólicas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo ao reduzir a ambiguidade nas interpretações mecanicistas dos efeitos de fármacos sobre a secreção.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade entre experimentos por meio de protocolos padronizados de manipulação celular e reagentes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer insights quantitativos precoces sobre a suscetibilidade metabólica ou o potencial terapêutico.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base na sua modulação da SIAG.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas de cultura celular, particularmente no manuseio de linhagens celulares secretoras de insulina, como a INS-1E.
- Depende do acesso a leitores de placas compatíveis com HTRF, com capacidades de excitação e emissão em duplo comprimento de onda.
- Necessita padronização na preparação de reagentes, incluindo tampão KRB, misturas de anticorpos e diluições de fármacos.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir o método de linhagens celulares imortalizadas para ilhotas pancreáticas primárias ou modelos derivados de humanos.
- Limitado pela necessidade de cuidadosa otimização da densidade de semeadura celular e dos tempos de incubação para garantir respostas consistentes de secreção.
