Name: Förster homogênea de tempo-resolvido ressonância energia baseada em transferência ensaio para detecção de secreção de insulina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Aprenda a usar HTRF para quantificar secreção de insulina em células beta pancreáticas. Este método rápido e preciso auxilia na pesquisa de diabetes tipo 2 e descoberta de fármacos.

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Os autores não têm nada para divulgar.

1. INS-1E células: manutenção e chapeamento
<ol><li>Manter células INS-1E numa incubadora de2 ˚C/5% CO 37 umidificado e culta com meio RPMI 1640 suplementado com 5% (v/v) inactivadas pelo calor fetal soro bovino, 2 mM L-glutamina, 10 mM HEPES, piruvato de sódio de 1 mM, 100 U/mL penicilina/estreptomicina solução de 50 µM de β-Mercaptoetanol. Cultura de células em meio RPMI 1640 completo de 10 mL (por placa), até atingirem a confluência de 80-90%, quando podem ser trypsinized e passadas ou usados para o ensaio de secreção de insulina.</li>
	<li>
Dia 1: Aspirar a mídia e lavar as células uma vez com 5 mL de PBS pré-aquecido. Adicione 0,5 mL de tripsina (0.025%) diluído 1:1 em 0,5 mL de PBS trypsinize as células e incubar durante 3-4 minutos a 37 ˚ c. Desactive a tripsina adicionando mídia completa 9 mL e a transferência de células para um tubo de centrífuga de 15 mL por pipetagem.</li>
	<li>Células de pelotas por centrifugação e ressuspender o centrifugado em aproximadamente 5 mL fresco meios de comunicação.</li>
	<li>Pegue 10 µ l de células re-suspensas e misture com 10 µ l corante vital de Trypan azul para verificar a viabilidade celular. Contar as células vivas e mortas em 10 µ l desta mistura usando um hemocytometer. Nível de viabilidade deve ser acima de 90%. Dilua as células re-suspensas em mídia fresca para 1 milhão de células por mL.</li>
	<li>Células de INS-1E de 0,5 mL de semente por bem em um poli-L-Lysine pré-revestido placa de 24, com uma densidade de 500.000 células/poço.</li>
	<li>
Dia 2: Remova a mídia 18-24h depois de chapeamento e adicionar 500 µ l/poço de mídia de RPMI 1640 fresco. Incube as células para outro 24h permitir que as células para se recuperar totalmente da etapa passaging prévia. Esse tempo adicional permite que as células a se espalhar na placa de cultura de tecidos.</li>
</ol>2. insulina secreção ensaio (dia 3)
<ol><li>Preparar o tampão KRB: 132,2 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 5mm NaHCO3, 0.5 mM NaH2PO4, 0.5 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2e 0,001 g/mL albumina de soro bovino (BSA), pH 7,4.</li>
	<li>Aspire os meios de comunicação de células e lave duas vezes com PBS pré-aquecido.</li>
	<li>Para a etapa de fome de glicose, adicione 450 µ l/poço KRB (contendo BSA) sem glicose para 1h 37 ˚C/5% CO2.</li>
	<li>Durante a etapa de fome de glicose, preparar diluições em série da droga (s) em KRB contendo 200 mM glicose (10 x concentração).<ol>
<li>Prepare a droga em 10 x a concentração final em KRB suplementado com glicose 200 mM (também 10 x a concentração final de glicose). Se o estoque de drogas (e mais o adicionado 10 x glicose) é em DMSO, certifique-se de percentual de DMSO é mantido consistente durante todo o ensaio (idealmente final percentual inferior a 0,1% DMSO).</li>
		<li>Para tratamentos de dopamina e quinpirole, usar um intervalo de concentração de drogas de ensaio final de 100 µM a 100 pM (do maior para menor concentração), com o último ponto da resposta dose não contendo nenhuma droga. Para bromocriptina, use um intervalo de concentração de ensaio final de 10 µM para 22:00, com o último ponto da resposta dose sendo o controle de drogas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois da fome de glicose, adicione diluições em série drogas para o ensaio para produzir uma resposta de dose.</li>
	<li>Adicione 50 µ l/poço de cada diluição serial nos poços correspondentes (ensaio total volume 500 µ l).</li>
	<li>Para a etapa de estimulação de glicose, incubar as células com as diluições de série respectivas drogas (na presença de glicose de 20 mM) durante 90 minutos a 37 ˚C/5% CO2. Incluem um conjunto de poços de controle: (1) estimulação com glicose 20mm sozinho na ausência de qualquer droga adicional e (2) células que nem são estimuladas com drogas nem glicose (que fornece uma taxa basal de secreção).</li>
	<li>Após a etapa de estimulação, remova com cuidado os sobrenadantes (uso diretamente ou loja no 4 ˚ c). Nota: Um passo de centrifugação suave adicional 5 min (600 g de x, 1 min) pode ser introduzido neste momento para remover quaisquer células remanescentes nos sobrenadantes de ensaio.</li>
</ol>3. HTRF a secreção de insulina medida
<ol><li>Dilua o ensaio sobrenadantes 01:10 em KRB (sem BSA), de preferência em placas de 96 poços claros.</li>
	<li>Prepare a curva padrão de insulina para o ensaio de insulina HTRF (tabela 1).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solução-padrão estoque 500 ng/ml</td>
			<td>Diluições em série</td>
			<td>Trabalhando [insulina] ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 7</td>
			<td>30 µ l estoque + 140 µ l KRB</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 6</td>
			<td>30 µ l STD 7 + 45 µ l KRB</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 5</td>
			<td>30 µ l STD 6 + 45 µ l KRB</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 4</td>
			<td>30 µ l STD 5 + 45 µ l KRB</td>
			<td>9.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>DST 3</td>
			<td>30 µ l STD 4 + 45 µ l KRB</td>
			<td>3,84</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 2</td>
			<td>30 µ l STD 3 + 45 µ l KRB</td>
			<td>1,54</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 1</td>
			<td>30 µ l STD 2 + 45 µ l KRB</td>
			<td>0,61</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 0</td>
			<td>µ l 45 KRB</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Nota: Estoque STD é 500 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Diluições em série para fazer a curva padrão de insulina.
<ol start="3"><li>Adicione as amostras de curva padrão e os sobrenadantes de ensaio diluída para a placa HTRF. A medição de insulina secretada por HTRF pode efectuar-se em um poço-96 ou um formato de placa 384, mantendo em mente que o volume de ensaio deve ser re-ajustado. Uso 10 µ l/poço amostra em brancas 96 poços meia-área chapas ou 5 µ l/poço em uma placa de baixo volume, fundo redondo 384-poço branco (consulte Tabela de materiais).</li>
	<li>Preparar a mistura de anticorpo no buffer de deteção (ver Tabela de materiais) em um doador de 1:2 (cryptate) / relação do aceitador (XL-665). Nota: Mais detalhes específicos sobre o ensaio HTRF estão disponíveis do fabricante.</li>
	<li>Adicione a mistura de anticorpos para o ensaio em 30 µ l/poço (para um formato de 96-placa de ensaio) ou 15 µ l/poço (para um formato de ensaio de placa 384).</li>
	<li>Selar a placa e incubar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Ler a placa depois de 2h, 4h, e/ou incubação durante a noite com anticorpos usando o leitor e o módulo de óptica de HTRF apropriado (337 665 620 nm) (ver Tabela de materiais e as instruções do fabricante). Definir o início da integração em 60 µs e o tempo de integração em 400 µs. uso 200 pisca por bem. Nota: Estes parâmetros foram baseados na utilização de nosso leitor específico. A leitura a 620 nm e 665 nm pode variar entre diferentes instrumentos. Esta é uma das razões que sugerimos usar a relação de 665/620. No cálculo deste rácio, quaisquer diferenças de potencial de leitor para leitor vão ser normalizadas em fornecem valores consistentes independentemente do instrumento utilizado para medir a HTRF.</li>
</ol>4. normalização e análise de dados
<ol><li>Calcular as concentrações de insulina dos poços de ensaio através de extrapolação de ratiometric leituras de fluorescência (665 nm/620 nm) para uma segunda ordem polinomial curva quadrática (Figura 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig2.jpg"> Figura 2 : Curva padrão insulina. Estoque de insulina humana de concentrações conhecidas foi usado para gerar a curva padrão de insulina. Os rácios HTRF resultantes (665 nm / 620 nm) foram plotados contra as concentrações de insulina. Os dados foram o melhor ajuste para uma segunda curva polinomial quadrático de ordem (R2 = 0.99996). Esta é uma curva padrão representativa. Barras de erro = SEM. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig2large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2"><li>Com os dados extrapolados como ng/mL de insulina secretada, normalize (insulina secretada em resposta ao aumento da concentração de ligante) para o valor médio de poços de teste a % máxima de insulina secreção (condição sozinho de glicose 20 mM).</li>
	<li>Use o ajuste de curva (R2) de uma única experiência para calcular a variação de intraplate. Dentro do experimento, derivado dos valores individuais de2 R as duplicatas intra experimentais, permitindo o cálculo do erro padrão da média para a curva de ajuste.</li>
	<li>Para determinar a variação interplate, use os dados de pelo menos três experimentos individuais para calcular o erro padrão da média para o valor de2 R da curva coletiva.</li>
</ol>

<ol><li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+nodes+in+signalling+pathways%3A+Insights+into+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li>
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</ol>

Agradecemos Nicolas Pierre (Cisbio bioensaios) para conselhos úteis e Dr. Pierre Maechler (Universidade de Genebra) generosamente, fornecendo células INS-1E. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do departamento de defesa (grant PR141292 a Z.F.) e John F. e Nancy A. Emmerling fundo da Fundação de Pittsburgh (a Z.F.).

O ensaio de insulina HTRF descrito aqui oferece um sistema rápido e eficiente para medir a secreção de insulina de um sistema de baseados em células cultivada. Entre suas vantagens mais importantes, neste ensaio oferece um sinal baixo fundo devido a alta relação sinal-ruído. Além disso, confirmamos que o sinal HTRF é estável durante longos períodos de tempo (> 24 h)7. No entanto, desde que os anticorpos monoclonais de ligação de insulina rapidamente chegar a saturação de ligação após adição para o...

A regulação do metabolismo energético é aperfeiçoá-lo por um importante hormônio anabólico, a insulina. Insulina é sintetizada e liberada por células-beta do pâncreas em resposta aos níveis de glicose extracelular aumentado. A insulina liberada provoca a absorção de glicose pelos tecidos sensíveis à insulina1,2. Fisiologicamente, isto está ligado à elevação da concentração de glicose após uma refeição, seguida de secreção de insulina para regular a absorção de glicose. Perturbações na homeostase de glicose levam a deficiências metabólicas, culminando na resistência à insulina e, finalmente, no início da43,2,do diabetes tipo 2.
Embora a secreção de insulina tem sido extensivamente estudada, seus mecanismos regulatórios permanecem mal compreendidos. Uma área crítica de investigação tem sido a identificação de novos moduladores de secreção de insulina em células beta5,6,7,8. Estes estudos requerem uma melhor compreensão da relação de acoplamento entre a estimulação de glicose e a secreção de insulina. Portanto, a capacidade de precisão de monitorar e quantificar os níveis de secreção de insulina glicose-estimulada (GSIS) tem sido essencial. Até à data, no entanto, apenas um número limitado de métodos estava disponível para permitir a quantificação de GSIS usando linhas de células secretoras de insulina e/ou de ilhotas pancreáticas. Um é o radioimunoensaio (RIA), que utiliza anticorpos e insulina radioisótopo-tag. As principais limitações desta abordagem incluem questões de segurança devido à manipulação e eliminação de materiais radioactivos. Além disso, este método é trabalhoso, envolvendo múltiplos lavagem longa e etapas de incubação. Ensaio imunoenzimático (ELISA) é outra abordagem dispendiosa e trabalhosa que utiliza anticorpos para a deteção de insulina. Variação em afinidades de anticorpo e da eficiência de reconhecer a insulina estão limitando fatores desse método e pode afetar a reprodutibilidade dos resultados. ELISA, nem RIA foi projetado para experimentos de alta produtividade. AlphaScreen é um ensaio homogêneo usado para detectar e medir os níveis de secreção de insulina. AlphaScreen tecnologia baseia-se na conversão de oxigênio ambiente em um estado singlete oxigênio excitado que pode reagir com espécies quimioluminescente, resultando na geração de quimioluminescência. Porque o ensaio é homogêneo, muitas das etapas lavagem associadas a RIA e ELISA são eliminadas. No entanto, a instabilidade do sinal devido à natureza da reação é um fator limitante que possam afectar a leitura do ensaio. (TR-pinça, desenvolvido pela Heyduk e colegas9, é outra abordagem homogénea para medição de insulina com base na ligação de dois anticorpos separados para diferentes epitopos na molécula de insulina. Os anticorpos são cada DNA encalhado quimicamente ligado à dupla com curto complementares único encalhado DNA saliências. Ligação dos anticorpos à insulina reúne-os e leva a um duplex de DNA encalhado dobro. Cada anticorpo também está associado com um fluoróforo dador ou aceitador respectivo, e a associação do duplex de DNA reúne estes fluorophores para gerar a transferência de energia de ressonância de Förster (FRET). Uma limitação potencial de TR-pinça, baseia-se no entanto, com o traste em si. A incapacidade de dissipar rapidamente fluorescência de fundo durante a reação de FRET pode levar a níveis relativamente elevados de fluorescência de fundo e um baixo sinal à relação de ruído dentro do ensaio. Portanto, ainda existe uma necessidade para um ensaio confiável, robusto e econômico para quantificar GSIS em uma maneira de alta produtividade.
Avanços recentes em Biofísica culminaram no desenvolvimento de um ensaio de transferência (HTRF) com base de ressonância de energia homogênea fluorescência tempo-resolvido. Especificamente, enquanto a energia de transferência dentro o ensaio pode ser descrito como baseado no traste, mais precisamente, HTRF depende da luminescência energia ressonância transferência (LRET)10 que é non-radiative transferência de energia entre o doador e o aceptor espécie de11,12,13. Esta distinção é importante, desde o momento de uma fluorescência ou têmpera interação com base de FRET é muito diferente do que é para LRET, embora os mesmos tipos de retenção podem ser usados para FRET e LRET. Além disso, o uso de terras raras lantanídeos cryptate compostos tais como o európio ou térbio cryptate em HTRF produz fluorescência longa meia-vida de12,14. Isto oferece a vantagem exclusiva da introdução de um atraso de tempo (microssegundos por) entre a excitação do doador e a medição das emissões do aceitador (isto é, tempo-resolvido do ensaio). Este atraso do tempo permite tempo suficiente para que a fluorescência de fundo a dissipar-se antes da medição de fluorescência de emissão aceitador. Consequentemente, a leitura é livre de fluorescência não-específica e assim, uma alta relação sinal-ruído é alcançada (Figura 1). Além disso, a natureza homogênea de HTRF elimina a necessidade de etapas de lavagem para lavar a espécie desacoplada, fazendo o ensaio muito mais rápido do que os métodos baseados em RIA ou ELISA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> Figura 1: esquemático do mecanismo para a deteção de insulina HTRF. Dois anticorpos monoclonais independentemente gerados especificamente reconhece e vincule a insulina em locais separados. Estes anticorpos são conjugados para o doador de cryptate de európio ou o aceitador de XL665. Excitação do doador em 337 resultados de nm em emissão a 620 nm. A transferência de energia resultante faz com que XL665 emitir um comprimento de onda mais longos, 665 nm. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para usar uma abordagem baseada em HTRF para determinar os níveis de GSIS de células INS-1E, uma bem estabelecida insulina secretoras derivado de células beta rato insulinoma célula linha15. Além disso, este ensaio pode ser utilizado para identificar o perfil farmacológico de reguladores moleculares da secreção de insulina. Aplicamos este ensaio de insulina com base em HTRF para examinar a dopamina D2-como o Regulamento do receptor de GSIS. Cada vez mais estudos têm revelado que o neurotransmissor dopamina é um importante regulador do GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. dopamina afeta GSIS de maneira autócrina/parácrina negativa através de ações sobre a dopamina D2-como os receptores (D2, D3, receptores de4 D) expressados na superfície de células pancreáticas beta8 , 16 , 19. usando este ensaio, confirmar o papel da dopamina como um regulador negativo de GSIS e demonstrar que a dopamina D2-como receptor agonistas bromocriptina e quinpirole também reduzem GSIS.

<table><tbody><tr><td>Placa branca de meia área de 96 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-042</td><td></td></tr><tr><td>Placa branca de baixo volume, fundo redondo de 384 poços</td><td>Corning</td><td>15100157</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Insulina de Alta Gama</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62IN1PEH&nbsp;</td><td>Kit de ensaio de insulina baseado em HTRF de 10.000 testes</td></tr><tr><td>Leitor de placas PHERAstar FSX</td><td>BMG Labtech</td><td>FSX</td><td>Leitor de placas adaptado para leituras de ensaios baseadas em HTRF</td></tr><tr><td>Seladores de placas</td><td>Fisher Scientific</td><td>DY992</td><td>Para selar a placa enquanto os anticorpos incubam</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11875-093</td><td>[+] L-glutamina</td></tr><tr><td>tripsina 0,05%&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>0.53 mM EDTA, (-) bicarbonato de sódio</td></tr><tr><td>DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco)</td> <td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Sem cálcio e magnésio</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>156-30-080</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>11360070</tr><tr><td>Solução de Penicilina/Estreptomicina 100x</td><td>Corning</td><td>30-002 CT</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M1348</td><td></td></tr><tr><td>Mancha Azul de Tripano (0,4%)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de dopamina</td><td>Sigma</td><td>8502</td><td></td></tr><tr><td>Mesilato de bromocriptina</td><td>Tocris</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>(-)-Cloridrato de quinpirole</td><td>Tocris</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimetilsulfóxido)</td> <td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr></tbody></table>

förster homogênea de tempo-resolvido ressonância energia baseada em transferência ensaio para detecção de secreção de insulina

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

A detecção de secreção de insulina é fundamental para elucidar os mecanismos de secreção regulamentado, bem como em estudos de metabolismo. Apesar de inúmeros ensaios de insulina já existem há décadas, o recente advento da tecnologia de Förster ressonância energia de transferência (HTRF) de tempo-resolvido homogênea simplificou significativamente estas medições. Isto é um ensaio óptico rápido, econômico, reprodutível e robusto depende dos anticorpos conjugados a brilhante fluorophores com emissão de longa duração, que facilita o tempo-resolvido Förster ressonância transferir energia. Além disso, a detecção de insulina HTRF é favorável para o desenvolvimento de ensaios de rastreio com throughput alto. Aqui usamos o HTRF para detectar a secreção de insulina em células INS-1E, uma linha de celular insulinoma-derivado de rato. Isso nos permite estimar os níveis basais de insulina e suas mudanças em resposta à estimulação de glicose. Além disso, nós usamos este sistema de deteção de insulina para confirmar o papel da dopamina como um regulador negativo da secreção de insulina glicose-estimulada (GSIS). De forma semelhante, outros de dopamina D2-como agonistas dos receptores, quinpirole e bromocriptina, reduzem GSIS de forma concentração-dependente. Nossos resultados destacam o utilitário do formato HTRF insulina ensaio para determinar o papel de numerosas drogas em GSIS e seus perfis farmacológicos.

Nós validado o nosso ensaio HTRF de insulina, gerando uma curva padrão de insulina, usando insulina humana purificada padrões predefinidos concentrações (Figura 2). Geração da curva padrão nos permitiu extrapolar as leituras de fluorescência ratiometric e, portanto, para determinar os níveis de insulina secretada em resposta aos tratamentos de drogas (Figura 2). Intraplate variação para o encaixe de curva foi mínima (R<s...

Aqui, apresentamos homogênea tempo resolvido FRET (HTRF) como um método eficiente para detecção rápida de insulina secretada de células.

Förster homogênea de tempo-resolvido ressonância energia baseada em transferência ensaio para detecção de secreção de insulina

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

O objetivo geral deste procedimento é induzir e quantificar com precisão os níveis de insulina secretada pelas células secretoras de insulina. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do diabetes, como os principais mecanismos sob a secreção de insulina estimulada por glicose nas células beta pancreáticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode quantificar com precisão e rapidez a secreção de insulina em resposta à estimulação da glicose e detectar possíveis efeitos da droga na secreção.As implicações dessa técnica se estendem à terapia e à descoberta de medicamentos para o tratamento do diabetes tipo 2, porque nos permitirá entender melhor os mecanismos da disfunção metabólica induzida por medicamentos. Embora esse método possa fornecer informações sobre a secreção de insulina de linhagens de células beta imortalizadas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como ilhotas pancreáticas intactas. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, devido a várias etapas de manuseio de células e preparações de medicamentos.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando queríamos criar um ensaio rápido para investigar as ações das drogas dopaminérgicas na secreção de insulina. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de manuseio das células são difíceis de aprender devido à natureza delicada das células e à importância da precisão para garantir a consistência do ensaio entre os experimentos. Primeiro, aumente as células INS-1E conforme descrito no protocolo de texto.Assim que as células atingirem a confluência desejada, aspirar o meio. Lave as células com cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de 025% de tripsina às células e deixe-as na incubadora por três a quatro minutos a 37 graus Celsius.Desative a tripsina adicionando nove mililitros de meio completo. Em seguida, transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue as células para formar um pellet.Após centrifugação, dissolva o pellet em cinco mililitros de meio fresco. Pipete 10 microlitros das células ressuspensas do tubo e misture com 10 microlitros de corante vital azul de tripano para avaliar a viabilidade. Em seguida, use um hemocitômetro para contar o número de células vivas e mortas e garantir que 90% das células estejam vivas.Após a contagem, adicione um milhão de células por mililitro em meio RPMI 1640 fresco e, em seguida, semeie 0,5 mililitros de 500.000 células INS-1E em cada poço de uma placa de 24 poços revestida com poli-L-lisina. Deixe o prato na incubadora por um dia inteiro. No dia seguinte, remova o meio e adicione 500 microlitros de meio RPMI 1640 fresco em cada um dos poços.Incube a placa por mais 24 horas para que as células se espalhem nas superfícies do poço. Para realizar o ensaio, primeiro prepare o tampão KRB, depois aspire o meio de cada um dos poços e lave com solução salina tamponada com fosfato pré-aquecido, duas vezes. Em seguida, adicione 450 microlitros de tampão KRB, suplementado com albumina de soro bovino, mas sem glicose, em cada poço.Deixe a placa de cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora. Prepare diluições seriadas dos medicamentos em tampão KRB, suplementado com concentração final de 10X de glicose 200 milimolar. Após a etapa de falta de glicose, pipetar 50 microlitros de medicamentos diluídos em série em cada um dos poços correspondentes.Para estimulação da glicose, adicione os respectivos medicamentos diluídos em série na presença de glicose 20 milimolar. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius por 90 minutos. Terminada a estimulação, colete os sobrenadantes e transfira-os para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro rotulados.Transfira 10 microlitros de cada sobrenadante coletado para uma placa de 96 poços. Adicione 90 microlitros de KRB a cada poço para obter uma proporção de diluição de um para 10. Misturar as diluições para assegurar a homogeneidade.Em seguida, obtenha a curva padrão de insulina para o ensaio de insulina HTRF. Em seguida, adicione 10 microlitros a cada uma das amostras de insulina padrão e os sobrenadantes de ensaio diluídos a uma placa de 96 poços. Preparar a mistura de anticorpos num dador de um a dois dadores para aceitar uma proporção no tampão de detecção.Depois de preparar a mistura de anticorpos, adicione 30 microlitros a cada um dos poços em uma placa de 96 poços. Sele a placa e incube em temperatura ambiente. Após duas horas de incubação, leia a placa com a mistura de anticorpos no leitor de placas.Use o módulo óptico HTRF apropriado em 665 e 620 nanômetros para a leitura e use 200 flashes para cada poço. Primeiro, uma curva padrão de insulina é plotada para extrapolar os valores reais de insulina das amostras de ensaio. A curva padrão mostra que a leitura de fluorescência raciométrica obtida aumenta significativamente em função das concentrações padrão de insulina humana pré-definidas.Em seguida, o nível basal de secreção de insulina das células INS-1E é estudado na presença ou ausência de glicose 20 milimolar. A partir do gráfico, mostra que as células secretam aproximadamente 100 nanogramas por mililitro de insulina na presença de glicose. Curiosamente, o nível de insulina é quase a metade, aproximadamente 15 nanogramas por mililitro na ausência de glicose.Em seguida, as células são incubadas na presença de concentrações crescentes de dopamina com glicose 20 milimolar. A insulina secretada é normalizada para o valor médio da porcentagem máxima de insulina de cada poço. O gráfico mostra que a dopamina inibe o GSIS, indicando assim a importância funcional dos receptores dopaminérgicos no GSIS.Este gráfico mostra que a bromocriptina, um medicamento para diabetes tipo 2, é mais potente na indução de GSIS do que a dopamina. Este gráfico mostra que, com o aumento da concentração de quinpirol, um agonista D2, embora menos eficiente que a bromocriptina, mostra potência semelhante à dopamina na estimulação do GSIS. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro a cinco horas se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de pipetar com cuidado e consistência. Após este procedimento, outros ensaios funcionais, como o ensaio AMP HDRF cíclico, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como os efeitos dos medicamentos dopaminérgicos na sinalização a jusante. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do metabolismo explorarem outras vias secretoras endócrinas em linhagens celulares imortalizadas e ilhotas pancreáticas.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir com precisão a secreção de insulina das células usando HDRF.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Förster transferência de energia por ressonância (FRET) microscopia é uma técnica poderosa para monitoramento em tempo real de eventos de sinalização em células vivas usando biossensores diversos como repórteres. Aqui descrevemos como construir um epifluorescência personalizado FRET sistema de imagens a partir de componentes disponíveis comercialmente e como usá-lo para FRET experimentos.

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

Este vídeo descreve a transferência de energia de ressonância de Förster resolvida no tempo ou ensaio TR-FRET para determinar a fosforilação de proteínas endógenas com a ajuda de fluoróforos doadores e aceptores marcados em anticorpos específicos para uma proteína de teste. Esta técnica é projetada para medir a fosforilação de proteínas de teste em lisados celulares.

Transferência de energia de ressonância de Forster resolvida no tempo para monitorar a fosforilação de proteínas em células

Este vídeo mostra a detecção de eletroquimioluminescência de autoanticorpos de ilhotas no soro humano. Os anticorpos no soro fazem a ponte entre o antígeno conjugado com rutênio e o antígeno de captura biotinilado, formando complexos que são detectados por medições de eletroquimioluminescência.

Detecção de autoanticorpos de ilhotas humanas usando um ensaio de eletroquimioluminescência

Uma descrição de como calibrar transferência Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) no perfil metabólico situ é apresentado. Os FIBS pode ser utilizado para medir os níveis intracelulares de metabolitos de forma não invasiva, contribuindo para o desenvolvimento de modelos metabólicas e elevado rendimento de rastreio de condições de bioprocessamento.

FIBS habilitado Noninvasive Metabolic Profiling

Este protocolo descreve a quantificação rápida e altamente sensível dos dados do sensor Förster transferência de energia de ressonância (FRET), usando um analisador de FRET portáteis feitos sob medida. O dispositivo foi utilizado para detectar a maltose dentro de uma gama de temperatura crítica que maximiza a sensibilidade de detecção, permitindo a avaliação prática e eficiente do teor de açúcar.

Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

O objetivo do presente protocolo é medir o efeito da glicose mediada por alterações de respiração mitocondrial na presença de compostos naturais intactos 832/13 beta células usando respirometria de alta resolução.

Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais

Este protocolo descreve como executar rápidos ensaios de luciferase de baixo custo em média taxa de transferência usando uma luciferase de Gaussia ligada à insulina como um proxy para a secreção de insulina de células beta. O ensaio pode ser realizado com a maioria dos leitores de placas de luminescência e pipetas multicanal.

Medindo a secreção relativa de insulina usando um substituto de luciferase co-secretado

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Estabelecemos um ensaio de hibridização in situ Duplex para mapear as isoformas do receptor de insulina IR-A e IR-B no plexo coróide murino, superando as limitações dos métodos tradicionais. Essa abordagem de alta resolução revela a expressão específica da isoforma, oferecendo novos insights sobre a sinalização da insulina cerebral e possíveis terapias direcionadas à isoforma para distúrbios neurológicos.

Visualização precisa dos receptores de insulina A e B no cérebro murino com um ensaio de hibridização in situ de RNA

Aprenda a usar HTRF para quantificar secreção de insulina em células beta pancreáticas. Este método rápido e preciso auxilia na pesquisa de diabetes tipo 2 e descoberta de fármacos.

Förster homogênea de tempo-resolvido ressonância energia baseada em transferência ensaio para detecção de secreção de insulina

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