Name: Identificar Sites de Factor de transcrição Olig2 vinculação genômica em agudamente purificado PDGFRα + células por imunoprecipitação da cromatina Low-célula sequenciamento análise (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Aprenda a analisar o vínculo genômico do fator de transcrição Olig2 em células precursoras de oligodendrócitos purificadas usando ChIP de baixa célula e sequenciamento. Este método robusto revela mecanismos epigenéticos e regulação transcricional na diferenciação celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JQW, XD, RCDD e YY foram apoiados por concessões dos institutos nacionais de saúde R01 NS088353; NIH conceder 1R21AR071583-01; a Fundação de Hermann Staman Ogilvie fundo-Memorial; a iniciativa do cérebro UTHealth e CTSA UL1 TR000371; e uma bolsa da Universidade do Texas sistema neurociência e Neurotecnologia Research Institute (Grant #362469).

<ol><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf7+is+an+important+regulator+of+the+switch+of+self-renewal+and+differentiation+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line.</a> PLoS Genet. 8 (3), e1002565(2012).</li>
<li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+control+of+oligodendrocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+oligodendrocyte+differentiation+by+Olig2+and+Sox10%3A+evidence+for+reciprocal+interactions+and+dosage-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms.</a> Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Identification+of+Long+Non-coding+RNAs+in+Purified+Cell+Types+from+the+Brain+Reveals+Functional+LncRNA+in+OPC+Fate+Determination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination.</a> PLoS Genet. 11 (12), e1005669(2015).</li>
<li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J Vis Exp. (10), e562(2007).</li>
<li>Emery, B., Dugas, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+oligodendrocyte+lineage+cells+from+mouse+cortices+by+immunopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).</li>
<li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein+signaling+and+olig1%2F2+interact+to+regulate+the+differentiation+and+maturation+of+adult+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells.</a> Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2018).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Team, R. C. <a target="_blank" href="https://www.gbif.org/tool/81287/r-a-language-and-environment-for-statistical-computing">A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2015).</li>
<li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2008-9-9-r137">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEME+SUITE%3A+tools+for+motif+discovery+and+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEME SUITE: tools for motif discovery and searching.</a> Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).</li>
<li>Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+depth+and+coverage%3A+key+considerations+in+genomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-based+mapping+of+developmental+transcriptional+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs.</a> Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).</li>
<li>Kheradpour, P., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+and+characterization+of+regulatory+motifs+in+ENCODE+TF+binding+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).</li>
<li>Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation.</a> J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645(2012).</li>
<li>Raskatov, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+NF-kappaB-dependent+gene+transcription+using+programmable+DNA+minor+groove+binders%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).</li>
<li>Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ReMap+2018%3A+an+updated+atlas+of+regulatory+regions+from+an+integrative+analysis+of+DNA-binding+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. , (2017).</li>
<li>Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTRD%3A+a+database+of+transcription+factor+binding+sites+identified+by+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).</li>
<li>Kulakovskiy, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOCOMOCO%3A+a+comprehensive+collection+of+human+transcription+factor+binding+sites+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).</li>
<li>Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+promoters+give+rise+to+false+positive+%27Phantom+Peaks%27+in+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).</li>
<li>Gerstein, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+human+regulatory+network+derived+from+ENCODE+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data.</a> Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Redes de regulamento do gene de mamíferos são muito complexas. ChIP-seq é um método poderoso para investigar interações proteína-ADN de todo o genoma. Este protocolo inclui como executar Olig2 ChIP-seq usando um número baixo de OPCs purificados de cérebro de rato (tão baixo quanto 20 mil células por reação). O primeiro passo fundamental para este protocolo é a purificação de OPCs de cérebro de rato por immunopanning com anticorpo PDGFRα. Para a selecção positiva de OPCs com placas PDGFRα revestido, OPCs frequentemente fr...

É importante estudar a proteína (ou complexo proteico) ligações de DNA e as marcas epigenéticas para construir redes de regulação transcricionais envolvida em vários processos biológicos. Particularmente, as associações de fatores de transcrição com o DNA genômico podem desempenhar um papel importante no Regulamento do gene, a diferenciação celular e o desenvolvimento de tecido. Uma poderosa ferramenta para estudar a regulação transcricional e mecanismos epigenéticos é imunoprecipitação da cromatina (ChIP). Devido aos avanços rápidos na próxima geração de tecnologia de sequenciamento, ChIP, juntamente com o sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) é usado para as análises de associações de proteína-ADN e marcas epigenéticas1. No entanto, um protocolo padrão de ChIP-seq requer aproximadamente 20 milhões de células por reação, o que dificulta a aplicação desta técnica, quando o número de células é limitado, tais como células primárias isoladas e populações de células raras.
Células de linhagem oligodendrocyte incluindo células precursoras de oligodendrocyte (OPCs) e oligodendrócitos são amplamente distribuídas por todo o cérebro e são essenciais para o desenvolvimento e a função do cérebro. Como um tipo de células precursoras, OPCs são capazes de auto-renovação e diferenciação. OPCs não só servem como progenitoras de oligodendrócitos, mas também desempenham um papel importante na propagação de sinalização neuronal, comunicando-se com outros tipos de células de cérebro2. Estudos anteriores sugeriram que o desenvolvimento do oligodendrocyte é regulamentado por fatores de transcrição de linhagem-específicos tais como Olig2 e Sox103,4. Estes fatores de transcrição foram encontrados para ligar as regiões promotor ou potenciador de alguns genes cruciais para influenciar sua expressão durante oligodendrocyte especificação e diferenciação. No entanto, é difícil identificar DNA-ligando da proteína (ou complexo proteico) de interesse em OPCs primárias aguda purificadas com um número muito limitado de células.
Este protocolo descreve como investigar sistematicamente a immunoprecipitated DNA genômico pela Olig2 no rato purificada OPCs no genoma-larga escala usando a técnica de ChIP-seq. OPCs de cérebro de rato aguda foram purificados por immunopanning e usados em um experimento de ChIP sem proliferação in vitro. Um número limitado de OPCs pode ser obtido por immunopanning e é insuficiente para experimentos de ChIP-seq padrão. Neste documento, um protocolo de ChIP-seq baixo-célula com tão baixo quanto 20 mil células por reação de ChIP para fatores de transcrição é descrito. Em breve, reticuladas células foram lysed e lisadas por um dispositivo sonication de cisalhamento a cromatina. A cromatina cortada foi incubada com anticorpo Olig2, bem como proteína grânulos revestidos A para precipitar Olig2 anticorpo ligado DNA genômico. Após a eluição de grânulos de proteína A-revestido e cross-linking reversa, DNA genômico precipitado pelo anticorpo Olig2 foi purificado por extração fenol-clorofórmio. O produto resultante foi quantificado e submetido a T-tailing, primeira demão recozimento modelo de comutação e de extensão, a adição de adaptadores e amplificação, seleção de tamanho de biblioteca e purificação passos para construção de biblioteca de ChIP-seq.
Após o sequenciamento, foi analisada a qualidade do cru diz tanto a amostra preparada com anticorpos de factor de transcrição Olig2 e a amostra de controle. Pares de base de baixa qualidade e adaptador contendo leram fragmentos foram aparados. Próximo, aparadas leituras estavam alinhadas para o genoma de referência de rato. As regiões genômicas que foram significativamente enriquecidas para leituras de ChIP, em comparação com as amostras de controlo, foram detectadas como picos. Picos significativos, representando potenciais locais de ligação de fator de transcrição, foram filtrados e visualizados em um navegador de genoma.
Notavelmente, o método descrito neste protocolo pode ser amplamente utilizado para ChIP-seq de outros factores de transcrição com qualquer tipo de célula do número limitado.

<table><tbody><tr><td>Reagente/Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banderiaea simplicifolia lectina 1</td><td>Vector Laboratories</td><td># L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-PDGFRa anticorpo</td><td>BD Bioscience</td><td># 558774</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissociação de tecido neural (P)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td># 130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Tecnologias</td> <td>de células-tronco# 07920</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Fisher</td><td># 15596026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Sulfato de Condroitina Proteoglicano Anticorpo</td><td>Millipore</td><td># AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Pico dispositivo de sonicação</td><td>Diagenode</td><td># B01060001</td><td></td></tr><tr><td>True MicroChIP kit</td><td>Diagenode</td><td># C01010130</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico (25:24:1, v/v)</td><td>Thermo Fisher</td><td># 15593031</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e kit de limpeza de PCR</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td># 740609</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td># P11496</td><td></td></tr><tr><td>DNA SMART ChIP-Seq kit</td><td>Clontech Laboratories</td><td># 634865</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Voulter</td><td># A63880</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Thermo Fisher</td><td># AM9516</td><td></td></tr><tr><td>pico-verde</td><td>Thermo Fisher</td><td># P11496</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td># 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green master mix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td># 1725124</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Fisher Scientific</td><td># 11-320-033</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (P/S)</td><td>Fisher Scientific</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N-2</td><td>Fisher Scientific</td><td># 17502048</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B-27 Fisher</td><td>Scientific</td><td># 17504044</td><td></td></tr><tr><td>insulina</td><td>Sigma</td><td># I6634</td><td>Prepare a solução de insulina 0,5 mg/ml dissolvendo 5 mg de insulina em 10 ml de água e 50 &mu; l de 1 N HCl.</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino, adequada para cultura de células (BSA)</td><td>Sigma</td><td># A4161</td><td>Prepare a solução de BSA a 4% dissolvendo 4 g de BSA em 100 ml de D-PBS e ajuste o pH para 7,4</td></tr><tr><td>Proteína básica do fator de crescimento de fibroblastos, recombinante humano (bFGF)</td><td>EMD Millipore</td><td># GF003</td><td></td></tr><tr><td>HUMAN PDGF-AA</td><td>VWR</td><td># 102061-188</td><td></td></tr><tr><td>poli-D-lisina</td><td>VWR</td><td># IC15017510</td><td>Preparar 1 mg/ml de solução de poli-D-lisina dissolvendo 10 mg de poli-D-lisina em 10 ml de água e diluir 100 vezes durante a utilização.</td></tr><tr><td>Placas de Petri descartáveis Falcon, estéreis, Corning, 100x15mm</td><td>VWR</td><td># 25373-100</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri descartáveis Falcon, estéreis, Corning, 150x15mm</td><td>VWR</td><td># 25373-187</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, 10X, sem cálcio, sem magnésio, sem fenol Red</td><td>Fisher Scientific</td><td># 14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Stemcell Technologies</td><td># 07050</td><td></td></tr><tr><td>coquetel de inibidores de protease</td><td>Sigma</td><td># 11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastQC</td><td>[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td> <td>Obtenção de métricas de controle de qualidade de leituras brutas e aparadas</td></tr><tr><td>Trimmomatic 0.33</td><td>[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td><td></td><td>Corte e filtragem de leituras brutas</td></tr><tr><td>GENCODE mm10</td><td>ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz</td><td></td><td>Genoma de referência do camundongo</td></tr><tr><td>Bowtie2 2.2.4</td> <td>[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td><td>Alinhamento de leituras a um genoma de referência</td></tr><tr><td>SAMTools 1.5</td> <td>[13] http://samtools.sourceforge.net/</td><td></td> <td>Convertendo arquivo SAM para o formato BAM</td></tr><tr><td>HOMER 4.9.1</td><td>[14] http://homer.ucsd.edu/homer/</td><td></td> <td>Criando um diretório de tags e anotando regiões genômicas enriquecidas com símbolos de genes</td></tr><tr><td>R 3.2.2</td><td>[15] https://www.R-project.org/</td><td></td> <td>Scripts de programação e funções em execução</td></tr><tr><td>SPP 1.13</td><td>[16] https://github.com/hms-dbmi/spp</td><td></td><td>Criando um gráfico de correlação cruzada de fita</td></tr><tr><td>MACS2 2.2.4</td><td>[17] https://github.com/taoliu/MACS</td><td></td><td>Encontrando regiões de enriquecimento de ChIP sobre o controle</td></tr><tr><td>BEDTools 2.25</td> <td>[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</td><td></td> <td>aritmética do genoma</td></tr><tr><td>bedGraphToBigWig</td><td>http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/</td><td></td> <td>Convertendo o arquivo bedGraph em bigwig</td></tr><tr><td>IGV browser 2.3.58</td> <td>[19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td><td></td> <td>Visualização e navegação de picos significativos de ChIP-seq</td></tr> Lista negra do <tr>programa<td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>Spreasheet</td></tr><tr><td>ENCODE https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists</td><td></td><td>Picos de filtragem</td><td></td></tr><tr><td>mm10.chrom.sizes</td><td>http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes.</td><td></td><td>Convertendo o arquivo bedGraph no</td></tr><tr><td>banco de dados de motivos do bigwig ENCODE</td><td>[25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/</td><td></td> <td>Banco de dados de motivos abrangente necessário para enriquecimento de motivos</td></tr><tr><td>MEME-ChIP</td><td>[20] http://meme-suite.org/index.html</td><td></td><td>Análise de enriquecimento de motivos e descoberta de motivos</td></tr><tr><td>Nomes de primer usados para qPCR</td><td></td><td></td><td>Sequências de primer usadas para qPCR</td></tr><tr><td>Mbp-F:</td><td></td><td></td><td>CTATAAATCGGCTCACAAGG</td></tr><tr><td>Mbp-R:</td><td></td><td></td><td>AGGCGGTTATATTAAGAAGC</td></tr><tr><td>Iba1-F:</td><td></td><td></td><td>ACTGCCAGCCTAAGACAACC</td></tr><tr><td>Iba1-R:</td><td></td><td></td><td>GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC</td></tr><tr><td>Mog-F:</td><td></td><td></td><td>GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC</td></tr><tr><td>Mog-R:</td><td></td><td></td><td>TGAATTGTCCTGCATAGCTGC</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td></td><td></td><td>ATGACATCAAGAAGGTGGTG</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td></td><td></td><td>CATACCAGGAAATGAGCTTG</td></tr><tr><td>Tuj1-F</td><td></td><td></td><td>TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG</td></tr><tr><td>Tuj1-R</td><td></td><td></td><td>GATGACCTCCCAGAACTTGGC</td></tr><tr><td>PDGFR&alpha;-F</td><td></td><td></td><td>AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC</td></tr><tr><td>PDGFR&alpha;-R</td><td></td><td></td><td>GTCCCTCCACGGTACTCCT</td></tr></tbody></table>

identificar sites de factor de transcrição olig2 vinculação genômica em agudamente purificado pdgfrα + células por imunoprecipitação da cromatina low-célula sequenciamento análise

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Em células de mamíferos, a transcrição do gene é regulada de maneira específica de tipo de célula pelas interações dos fatores transcricionais com DNA genômico. Fatores de transcrição de linhagem-específicos são considerados desempenham um papel essencial na especificação de célula e diferenciação durante o desenvolvimento. ChIP, juntamente com o sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) é amplamente utilizado para analisar os locais obrigatórios de todo o genoma de fatores de transcrição (ou seu complexo associado) de DNA genômico. No entanto, um grande número de células é necessário para uma reação de ChIP padrão, que torna difícil estudar o número limitado de células primárias isoladas ou populações de células raras. Para entender o mecanismo regulatório de transcrição de linhagem específica oligodendrocyte fator Olig2 no rato agudamente purificado OPCs, um método detalhado usando ChIP-seq para identificar os sítios de ligação de todo o genoma de Olig2 (ou Olig2 complexo) é mostrado. Primeiro, o protocolo explica como purificar a alfa do receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRα) OPCs positivos de cérebro de rato. Em seguida, Olig2 anticorpo mediada ChIP e construção de biblioteca são executadas. A última parte descreve o software de bioinformatic e procedimentos utilizados para análise de Olig2 ChIP-seq. Em resumo, este trabalho relata um método para analisar as ligações de todo o genoma do fator transcricional Olig2 no cérebro agudamente purificado OPCs.

Realizou-se baixo-celular ChIP-seq e bioinformatic análises foram feitas para investigar as potenciais interações do fator transcricional Olig2 com DNA genômico no cérebro agudamente purificado OPCs. A Figura 1 mostra um fluxo de trabalho geral de ambos os experimentais e os procedimentos de análise de dados. Neste protocolo, cérebros de ratos pós-natal foram dissociados em uma suspensão de célula única. Após dissociação de tecido, immunopanning foi realizada...

Aqui nós apresentamos um protocolo que visa analisar todo o genoma ligação do factor de transcrição do oligodendrocyte 2 (Olig2) em agudamente purificada oligodendrocyte precursor as células do cérebro (OPCs) através da realização de imunoprecipitação da cromatina de baixo-celular (ChIP) , preparação de biblioteca, elevado-throughput sequenciamento e análise de dados de bioinformatic.

Identificar Sites de Factor de transcrição Olig2 vinculação genômica em agudamente purificado PDGFRα + células por imunoprecipitação da cromatina Low-célula sequenciamento análise

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

O objetivo geral deste experimento é analisar a ligação de todo o genoma do fator de transcrição de oligodendrócitos dois em células precursoras de oligodendrócitos cerebrais agudamente purificadas, realizando imunopanning, imunoprecipitação de cromatina de baixa célula, sequenciamento de alto rendimento e análise de dados de bioinformática. Este método é uma ferramenta poderosa para estudar a regulação transcricional de todo o genoma e os mecanismos epigenéticos, que desempenham papéis importantes na diferenciação e desenvolvimento celular. A principal vantagem desta técnica é que ela é amplamente aplicável em ChIP-seq de outros fatores de transcrição com qualquer tipo de célula de número limitado, incluindo células primárias agudamente purificadas sem proliferação in vitro.Demonstrando o procedimento estará Yanan You, um pós-doutorado do meu laboratório. Ela é coautora deste artigo. Para selecionar as células PDGFR-alfa-positivas, prepare uma placa para imunopanning.Prepare outras duas placas para células endoteliais e depleção da microglia. Em seguida, cubra uma placa de Petri de 10 centímetros com 30 microlitros de imunoglobulina anti-rato caprino. Em seguida, agite a placa par

identifying-transcription-factor-olig2-genomic-binding-sites-acutely

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui estamos apresentando uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) procedimento para análise do genoma localização das isoformas de proteínas que diferem em um domínio de ligação de histonas. Estamos aplicando-a-CHIP Seq análise para identificar os alvos da demetilase KDM5A/JARID1A/RBP2 histonas.

Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

CHIRP é uma técnica recente e rápida de mapa genômico sítios de ligação de RNAs não-codificantes longos (lncRNAs). O método tira partido da especificidade dos oligonucleótidos anti-sentido ladrilhos para permitir que a enumeração de sítios lncRNA-bound genómicos.

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Este vídeo descreve o protocolo para ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP), que é uma técnica clássica para demonstrar interações proteína-DNA. Esta técnica é usada para identificar genes-alvo em células de leucemia linfocítica crônica humana.

Ensaio de imunoprecipitação de cromatina: uma técnica para estudar interações proteína-DNA em células

Neste vídeo, demonstramos a técnica de imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação a proteínas em regiões específicas do DNA genômico de células precursoras de oligodendrócitos por meio da imunoprecipitação seletiva de fragmentos de cromatina ligados a proteínas. Este método ajuda a estudar a interação de várias proteínas reguladoras, incluindo fatores de transcrição envolvidos na regulação gênica.

Imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação de proteínas-alvo no DNA genômico

Nós descrevemos um método robusto para cromatina imunoprecipitação utilizando células T primárias. O método baseia-se em métodos normais, mas utiliza um conjunto específico de condições e reagentes que melhoram a eficiência de uma quantidade limitada de células. Importante, é apresentada uma descrição detalhada da fase de análise de dados.

Imunoprecipitação da Cromatina eficiente usando Limitando quantidades de biomassa

A combinação de cromatina imunoprecipitação e sequenciamento ultra-high-throughput (CHIP-seq) pode identificar e mapear as interações DNA-proteína em uma determinada linha de tecido ou célula. Delineado é como gerar um modelo de alta chip de qualidade para o seqüenciamento posterior, utilizando a experiência com o fator de transcrição TCF7L2 como um exemplo.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

Neste trabalho, fornecemos um fluxo de trabalho experimental de como os intensificadores ativos podem ser identificados e validados experimentalmente.

Previsão e Validação de elementos reguladores de genes ativada durante ácido retinóico induzida estaminais embrionárias Diferenciação Celular

Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Leucemia linfocítica crônica (CLL) é a leucemia mais comum no mundo ocidental. Fatores de transcrição NFAT são importantes reguladores do desenvolvimento e ativação em numerosos tipos de células. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) em células humanas de CLL identificar genes alvo romance de NFAT2.

Um ensaio de imunoprecipitação da cromatina para identificar Genes-alvo NFAT2 novela em leucemia linfocítica crônica

A imunoprecipitação de cromatina, juntamente com o sequenciamento de última geração (ChIP-seq), é um método usado para estabelecer interações entre fatores de transcrição e as sequências genômicas que eles controlam. Este protocolo descreve técnicas para a realização de ChIP-seq com biofilmes bacterianos, usando salmonella enterica serovar Typhimurium biofilme bacteriano como um exemplo.

Descobrindo metas regulatórias csgd em salmonella biofilme usando imunoprecipitação de cromatina e sequenciamento de alta produtividade (ChIP-seq)

Relatamos a aplicação da captura de conformação de cromossomos quantitativos seguida de sequenciamento de alto throughput em corpos embrionários gerados a partir de células-tronco embrionárias. Esta técnica permite identificar e quantificar os contatos entre melhoradores putativos e regiões promotoras de um determinado gene durante a diferenciação de células-tronco embrionárias.

Identificação de contatos intensificadores-promotores em corpos embrionários por captura quantitativa de conformação de cromossomo (4C)

Aprenda a analisar o vínculo genômico do fator de transcrição Olig2 em células precursoras de oligodendrócitos purificadas usando ChIP de baixa célula e sequenciamento. Este método robusto revela mecanismos epigenéticos e regulação transcricional na diferenciação celular.

Identificar Sites de Factor de transcrição Olig2 vinculação genômica em agudamente purificado PDGFRα + células por imunoprecipitação da cromatina Low-célula sequenciamento análise (Vídeo) | JoVE Journal

Identificar Sites de Factor de transcrição Olig2 vinculação genômica em agudamente purificado PDGFRα + células por imunoprecipitação da cromatina Low-célula sequenciamento análise

Explorar mais vídeos