Identificar Sites de Factor de transcrição Olig2 vinculação genômica em agudamente purificado PDGFRα + células por imunoprecipitação da cromatina Low-célula sequenciamento análise

O objetivo geral deste experimento é analisar a ligação de todo o genoma do fator de transcrição de oligodendrócitos dois em células precursoras de oligodendrócitos cerebrais agudamente purificadas, realizando imunopanning, imunoprecipitação de cromatina de baixa célula, sequenciamento de alto rendimento e análise de dados de bioinformática. Este método é uma ferramenta poderosa para estudar a regulação transcricional de todo o genoma e os mecanismos epigenéticos, que desempenham papéis importantes na diferenciação e desenvolvimento celular. A principal vantagem desta técnica é que ela é amplamente aplicável em ChIP-seq de outros fatores de transcrição com qualquer tipo de célula de número limitado, incluindo células primárias agudamente purificadas sem proliferação in vitro.

Demonstrando o procedimento estará Yanan You, um pós-doutorado do meu laboratório. Ela é coautora deste artigo. Para selecionar as células PDGFR-alfa-positivas, prepare uma placa para imunopanning.

Prepare outras duas placas para células endoteliais e depleção da microglia. Em seguida, cubra uma placa de Petri de 10 centímetros com 30 microlitros de imunoglobulina anti-rato caprino. Em seguida, agite a placa para garantir que toda a superfície da placa seja coberta uniformemente com a solução de revestimento.

Deixe a placa de Petri durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, dilua 40 microlitros de anticorpo anti-PDGFR-alfa de rato com 12 mililitros de DPBS contendo 0,2% de albumina sérica bovina. Em seguida, lave a placa revestida com imunoglobulina G com 10 mililitros de 1X DPBS por três vezes consecutivas.

Em seguida, incubar a placa revestida com imunoglobulina G com solução de anticorpo PDGFR-alfa em temperatura ambiente por quatro horas. Após quatro horas, adicione cuidadosamente a DPBS ao longo da parede lateral da placa para lavar a placa revestida com anticorpo anti-PDGFR-alfa de rato três vezes. Não perturbe a superfície revestida da placa.

Em seguida, use 20 mililitros de DPBS com 2,3 microgramas por mililitro de BSL-1 para revestir duas placas de Petri de 15 centímetros por duas horas. Após a incubação, adicione cuidadosamente 20 mililitros de DPBS ao longo da parede lateral da placa para lavar a placa BSL-1 três vezes. Não perturbe a superfície revestida.

Após a lavagem, centrifugue a suspensão monocelular a 300 vezes g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, adicione 15 mililitros de tampão de imunopanning ao pellet celular. Em seguida, incube as suspensões unicelulares de dois cérebros de camundongos sequencialmente em duas placas de Petri revestidas com BSL-1.

Em seguida, deixe os pratos por 15 minutos em temperatura ambiente. Agite a placa a cada cinco minutos durante a incubação. Em seguida, gire suavemente a placa para coletar todas as células não aderentes da suspensão celular.

Em seguida, semeie as células na placa revestida com anticorpos PDGFR-alfa de rato. Incube a placa por 45 minutos em temperatura ambiente. Ao final de 45 minutos, gire o prato novamente.

Em seguida, descarte a suspensão celular. Em seguida, enxágue a placa com DPBS por oito vezes para remover as células não aderentes. Examine a placa ao microscópio.

Em seguida, adicione a solução de descolamento de células na placa revestida com anticorpos PDGFR-alfa de rato. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos. Enquanto isso, agite a placa para desalojar as células aderentes e examine-a ao microscópio.

Em seguida, centrifugue as células a 300 vezes g à temperatura ambiente. Após centrifugação, ressuspender o sedimento celular com um mililitro de meio de cultura de células OPC. Em seguida, conte as células utilizando o método de exclusão de azul de tripano em um hemocitômetro.

Depois de contar em um hemocitômetro, adicione 20.000 OPCs purificados em um mililitro de meio de cultura de células OPC para a reação ChIP. Em seguida, adicione 27 microlitros de 36,5% de formaldeído em temperatura ambiente por 10 minutos. Isso corrigirá as células.

Após 10 minutos, adicione 50 microlitros de glicina 2,5 molar nas células fixas por cinco minutos em temperatura ambiente. A adição de glicina interromperá a reticulação DNA-proteína. Em seguida, lave as células reticuladas com um mililitro de tampão HBSS com coquetel inibidor de protease.

Em seguida, centrifugue as células em uma centrífuga pré-resfriada a 300 vezes g a quatro graus Celsius. Após a reticulação dos OPCs purificados, as células reticuladas devem ser lavadas com solução HBSS gelada, e as etapas restantes do ChIP devem ser realizadas a quatro graus, caso contrário, o anticorpo não pode precipitar o DNA genômico adequadamente. Em seguida, adicione 25 microlitros de tampão de lise completo ao pellet celular e deixe no gelo por cinco minutos.

Em seguida, pipete 75 microlitros de tampão HBSS gelado com coquetel inibidor de protease. Em seguida, cisalhar a cromatina do lisado celular em um sistema de sonicação pré-resfriado com cinco ciclos de 30 segundos de programa ligado e 30 segundos desligado. Uma vez cortada a cromatina, centrifugar o lisado celular a 14 000 vezes g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

No final da centrifugação, recolher o sobrenadante. Em seguida, dilua 100 microlitros da cromatina cisalhada com um volume igual do tampão ChIP gelado com inibidor de protease. Em seguida, adicione um microlitro de anticorpo anti-Olig2 de coelho a 180 microlitros da cromatina cortada diluída.

Incubar os tubos numa roda rotativa durante 16 horas a quatro graus Celsius a 40 rotações por minuto. Em seguida, adicione 10 microlitros de esferas revestidas de proteína A pré-lavadas ao tubo de reação ChIP em uma câmara fria. Novamente, incube os tubos ChIP a quatro graus Celsius por mais duas horas na roda giratória.

Após duas horas, deixe o tubo de reação ChIP no rack magnético por um minuto. Em seguida, lave o grânulo com 100 microlitros de quatro amortecedores de lavagem cada por quatro minutos em uma roda giratória a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão de eluição ao pellet do grânulo.

Incubar o tubo de reação a 65 graus Celsius por quatro horas. Uma vez que o DNA de fita dupla é desnaturado, desfosforile a extremidade de três primos do DNA de fita simples adicionando fosfatase alcalina de camarão. Em seguida, adicione a cauda poli-T ao DNA de fita simples usando a desoxinucleotidil transferase terminal.

Em seguida, recoza o primer de DNA poli-dA para o molde de DNA de fita simples. Em seguida, amplifique a biblioteca de sequências ChIP usando primers diretos e reversos para indexação. O número de ciclos de PCR para preparação da biblioteca depende da quantidade de DNA inicial.

Uma boa preparação da biblioteca requer uma quantificação precisa da quantidade de DNA de entrada. Muitos ou poucos ciclos de PCR podem influenciar a concentração da biblioteca, bem como a complexidade, levando a artefatos de PCR. Use contas paramagnéticas para selecionar os fragmentos que variam de 250 a 500 pares de bases da biblioteca de sequências ChIP amplificada por PCR.

Use um dispositivo de eletroforese capilar de chip microfluídico para examinar a qualidade da biblioteca de sequências ChIP selecionada. Para avaliar a pureza dos OPCs imunopanados, são realizados estudos de imunocoloração. Ao usar o anticorpo NG2 do marcador de linhagem OPC, mostra que a maioria das células imunopanadas do anticorpo PDGFR-alfa são NG2 positivas.

Em seguida, é feita PCR quantitativa para verificar o enriquecimento de PDGFR-alfa. O gráfico obtido mostra pouca expressão de Tuj1, um marcador neuronal que indica enriquecimento significativo de PDGFR-alfa em comparação com as células cerebrais dissociadas. Resultados semelhantes são obtidos mostrando pouca expressão para todos os outros marcadores, como GFAP, Mog e Mbp, indicando enriquecimento de PDGFR-alfa.

Em seguida, a qualidade da biblioteca de sequências ChIP é analisada. O eletroferograma representa um pico claro para o fator de transcrição Olig2 variando de 250 a 500 pares de bases após a seleção do tamanho do produto de PCR da biblioteca. Aqui, o histograma mostra a clonalidade da tag, para verificar as métricas de controle de qualidade obtidas antes do pico de chamadas.

A barra indica que mais de 90% das leituras são mapeadas para apenas um local genômico. Em seguida, obtém-se um gráfico de correlação de fitas, que representa um pico enriquecido correspondente ao comprimento do fragmento predominante. No gráfico, as linhas vermelhas representam o comprimento de leitura em 50 pares de bases e o comprimento do fragmento em 130 pares de bases, respectivamente, indicando dados de alta qualidade.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três dias se for executada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem o local de ligação ao DNA em todo o genoma de fatores de transcrição e outras proteínas em células primárias ou células raras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar OPCs primários do cérebro de camundongo por imunopanning e como realizar o experimento ChIP-seq usando um baixo número de células.