Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuromodulação para o tratamento da epilepsia, como qual área do cérebro e protocolo de estimulação são mais adequados. A principal vantagem dessa técnica é que as fatias de cérebro de roedores representam um modelo simplificado e realista de circuitos cerebrais, enquanto as matrizes de microeletrodos permitem vários pontos de observação a uma distância conhecida entre eletrodos. Para preparar o MEA, espalhe uniformemente o selante elastomérico na superfície inferior da câmara de registro e certifique-se de que não haja bolhas.

Em seguida, monte a câmara de gravação no MEA com a ajuda de uma pinça e aplique uma leve pressão. Espalhe uma camada de selante ao redor da borda externa da câmara de registro. Em seguida, coloque o conjunto MEA/câmara em um ambiente fechado e úmido e deixe-o curar em temperatura ambiente durante a noite.

Para preparar a bancada de gravação, ajuste o banho quente para 32 graus Celsius. Em seguida, despeje o ACSF de retenção nas câmaras de retenção e pré-aquecimento. Borbulhe as soluções com uma mistura de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono e remova quaisquer bolhas presas usando uma pipeta Pasteur invertida.

Mantenha a câmara de retenção em temperatura ambiente e coloque a câmara de pré-aquecimento no banho quente. Prepare fatias horizontais do cérebro do hipocampo-córtex de acordo com os procedimentos padrão e deixe-as se recuperar na câmara de retenção em temperatura ambiente por pelo menos 60 minutos. Despeje 4AP ACSF em uma câmara de incubação.

Em seguida, borbulhe com uma mistura de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono e remova as bolhas presas usando uma pipeta Pasteur invertida. Em seguida, cubra a câmara e transfira-a para o banho quente. Certifique-se de que as temperaturas de pré-aquecimento ACSF e 4AP ACSF sejam de 30 a 32 graus Celsius.

Use uma pipeta Pasteur de vidro invertido para transferir uma fatia de cérebro para a câmara de pré-aquecimento e deixe o tecido descansar por 25 a 30 minutos. Em seguida, transfira a fatia do cérebro para a câmara de incubação 4AP ACSF e deixe descansar por 60 minutos. Deixe o 4AP ACSF fluir através do tubo de perfusão para um béquer até que não haja ar dentro.

Em seguida, pare o fluxo da solução. Coloque o chip MEA seco dentro do amplificador MEA e prenda o cabeçote do amplificador. Em seguida, use uma pipeta de plástico Pasteur para transferir 4AP ACSF para o reservatório de entrada e saída da câmara de registro.

Prenda a cânula de aquecimento a um suporte magnético e coloque sua ponta dentro da porta de entrada da câmara de gravação. Em seguida, conecte o suporte magnético a uma faixa magnética no MEA ampcabeça do amplificador. Conecte o tubo de perfusão à cânula e a cânula ao termostato.

Em seguida, coloque a agulha de sucção no reservatório de saída. Verifique se há pressão negativa submergindo a agulha de sucção no ACSF e verifique se há um ruído de sucção constante de baixa frequência. Em seguida, defina o regulador de fluxo para permitir uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto e comece a perfundir.

Assim que o 4AP ACSF estiver fluindo pela cânula, ligue o termostato. Defina a cânula de aquecimento para 37 graus Celsius e a base MEA para 32 graus Celsius para atingir uma temperatura de 32 a 34 graus Celsius dentro da câmara de gravação. Em seguida, coloque o eletrodo de referência externo no reservatório de entrada da câmara de registro.

Assim que o nível 4AP ACSF e a temperatura de registro estiverem estabilizados conforme desejado, gire a perfusão e as torneiras de sucção para a posição desligada para pará-las temporariamente. Transfira rapidamente uma fatia de cérebro para a câmara de gravação MEA usando uma pipeta Pasteur de vidro invertido. Ajuste sua posição na área de gravação MEA conforme necessário usando uma pipeta Pasteur enrolada e polida a fogo ou uma escova macia, compacta e pequena.

Coloque a âncora de retenção na fatia do cérebro. Reinicie a perfusão e a sucção girando suas torneiras de volta para a posição ligada. Tire uma foto da fatia do cérebro usando uma câmera montada em um microscópio invertido.

Em seguida, execute o script mapMEA no software do computador para iniciar a GUI para mapear os eletrodos. Clique no botão Procurar para carregar a imagem da fatia de cérebro. Certifique-se de que o eletrodo de referência apareça na coluna superior da metade esquerda do MEA.

Em seguida, clique no botão Ativar ponteiro. Selecione os eletrodos superior e inferior na coluna mais à esquerda da matriz para marcar as coordenadas XY para endireitamento de imagem e mapeamento de eletrodos. No menu suspenso Tipo de fatia, selecione Horizontal.

Marque a caixa de seleção Estruturas padrão. Usando os botões numerados abaixo da imagem da fatia do cérebro, selecione os eletrodos correspondentes ao ROI e clique nos botões correspondentes no painel da estrutura para atribuí-los. Repita esta etapa para cada ROI.

Depois, pressione o botão Salvar. O software gerará uma pasta de resultados contendo uma tabela relatando os eletrodos e ROIs selecionados. Para estudo eletrofisiológico, ligue a unidade de estímulo pelo menos 10 minutos antes do protocolo de estimulação para permitir a autocalibração e estabilização.

Em seguida, inicie o software de controle de estímulo e verifique se o estimulador e o amplificador MEA estão conectados corretamente, conforme indicado por um LED verde no painel principal do software de controle de estímulo. Configure a estimulação na configuração bipolar. Conecte a unidade de estímulo ao solo.

Em seguida, conecte os pares de eletrodos em contato com a camada de células piramidais do CA1/subículo proximal entre os mapeados com o script mapMEA. Para adquirir dados, pressione o botão play no painel principal do software de gravação. Registre pelo menos quatro descargas ictais.

Em seguida, execute um teste rápido de entrada/saída para identificar a melhor intensidade de estímulo. Para fazer isso, use o painel principal para projetar um pulso de corrente bifásico quadrado positivo-negativo com uma duração de 100 microssegundos por fase. Na guia amplitude de pulso, insira uma amplitude de pulso inicial de 100 microamperes por fase.

Defina o pulso de estimulação em 0.2 hertz ou menos, adicionando um intervalo entre pulsos de cinco segundos ou mais. Aumente a amplitude do estímulo em 50 a 100 passos de microamperes em cada tentativa até que a estimulação possa evocar de forma confiável eventos semelhantes à interictal nos córtices parahipocampais. Para modulação elétrica da ictogênese límbica, programe a unidade de estímulo para fornecer o protocolo de estimulação de interesse e use a amplitude do estímulo identificada durante o teste de entrada/saída.

Após a interrupção da estimulação, verifique a recuperação da rede à condição pré-estímulo registrando pelo menos quatro descargas ictais. Esta figura mostra os registros da atividade ictal induzida por 4AP no córtex entorrinal e no córtex perirrinal durante a condição de controle, estimulação periódica em um hertz e durante a recuperação após a retirada do estímulo. Este gráfico mostra a quantificação do efeito da estimulação periódica em um hertz, o que indica uma redução significativa do tempo total de apreensão durante a estimulação.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de colocar rápida e corretamente a fatia do cérebro no MEA. Após este procedimento, outros métodos, como a manipulação farmacológica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a contribuição dos neurotransmissores ou do canal iônico para a atividade epileptiforme e para o efeito da neuromodulação.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem a interação da rede neuronal na saúde e na doença em neurônios cultivados, bem como em fatias de cérebro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como registrar e modular eletricamente a atividade epileptiforme induzida pela quatro aminopiridina em fatias de cérebro de roedores acopladas a MEAs.