Um protocolo de aspiração da bolha para estudar células T humanas Recall Responses In Vivo
11 de agosto de 2018
Aqui, nós fornecemos uma demonstração do modelo sucção bolha cutâneo de recordação. O modelo permite um acesso simples ao estudo humano na vivo adaptável respostas imunes, por exemplo, no contexto do desenvolvimento de vacinas.
O objetivo geral deste vídeo é demonstrar o método de recordação cutânea da bolha de sucção, que nos permite colher células T específicas do antígeno e citocinas representativas da resposta imune adaptativa in vivo. Este método pode ser usado para estudar respostas celulares e imunidade adaptativa em humanos. A principal vantagem dessa tecnologia é que ela nos permite coletar células T específicas do antígeno diretamente do local da reação imune usando um método relativamente não invasivo e seguro.
O princípio básico da recordação cutânea é depositar o antígeno na camada dérmica da pele. Em indivíduos com memória imunológica existente do antígeno, as células T migrarão para o local da reação e induzirão uma resposta imune local, onde células T específicas são expandidas clonalmente e diferenciadas in situ. A indução de bolhas de sucção sobre essa reação nos permite colher essas células T específicas, bem como as citocinas produzidas in vivo.
Nesta demonstração em vídeo, usamos o PPD como nosso antígeno de memória. A PPD é comumente usada para o diagnóstico da infecção por Mycobacterium tuberculosis. Mas, também induz reações cutâneas em pessoas previamente vacinadas com a vacina BCG, como você verá neste vídeo.
Os materiais para o teste tuberculínico incluem compressas com álcool, uma seringa de um mililitro com uma agulha curta de calibre 27 a 30 e uma solução de PPD aprovada para uso humano. Use uma solução de PPD de 20 unidades de tuberculina por mililitro. Desinfete o frasco usando um algodão embebido em álcool.
E observe que a composição pode variar entre os fabricantes. Em seguida, localize o local da injeção no lado ventral do antebraço do voluntário e desinfete a área usando um cotonete embebido em álcool. Use uma seringa estéril de um mililitro com uma agulha fixa de calibre 29 e 12 milímetros.
Misture suavemente e aspire 0,1 mililitros da solução de PPD. Certifique-se de que não haja bolhas visíveis. Tensione a pele e aponte a agulha em um ângulo de cinco a quinze graus com o chanfro voltado para cima.
Insira a ponta da agulha na camada dérmica da pele e certifique-se de que a ponta esteja quase visível através da epiderme. Injete lentamente 0,1 mililitro de solução PPD. Se administrado corretamente, uma pápula de seis a dez milímetros aparecerá imediatamente.
A pápula desaparece após aproximadamente dez minutos. Vários depoimentos de PPD são possíveis, mas podem exigir aprovação ética adicional. Se duas injeções forem administradas, procure a separação máxima, mantendo uma boa distância da área do cotovelo e do pulso.
A reação clínica da pele aparece nas primeiras 24 horas e é acompanhada por uma sensação de coceira. Meça o tamanho da reação cutânea 48 a 72 horas após a injeção. Ao avaliar a resposta, é importante medir o endurecimento e não o eritema.
Palpe o inchaço do chapéu usando o dedo. Em seguida, marque as bordas do endurecimento usando uma caneta esferográfica. Por fim, use uma régua macia para medir o diâmetro de endurecimento e anote os resultados em milímetros.
Após sete dias, é hora de induzir a bolha de sucção. Para indução do blister de sucção da pele, use uma bomba de vácuo com uma câmara de sucção acoplada. Use um dispositivo disponível comercialmente ou personalizado.
É importante ressaltar que a bomba precisa ser ajustável dentro da faixa de menos 20 a menos 40 quilopascal e fornecer uma pressão negativa constante e confiável. A parte inferior da câmara de sucção consiste em uma placa com um pequeno orifício que está em contato com a pele. As placas podem ter orifícios únicos ou múltiplos e tamanhos diferentes podem ser aplicados para se adequar à reação da pele.
A parte superior da câmara deve permitir o monitoramento visual do blister. Antes da indução, desinfete a pele e a placa da câmara. Certifique-se de que o braço esteja descansando confortavelmente.
Prenda e prenda a câmara, aqui usando alças ajustáveis. O centro da reação cutânea deve ser visível através do orifício da placa inferior. Ligue o dispositivo de sucção e ajuste a pressão negativa para menos 20 quilopascal.
Após trinta minutos, aumentar a pressão para menos 25 quilopascal. Após 60 minutos, aumente ainda mais a pressão para menos 30 quilopascais. E mantenha a pressão aqui até que uma única bolha esteja totalmente formada.
A fase de indução da bolha normalmente leva cerca de uma a três horas. Com a formação real de bolhas ocorrendo gradualmente nos últimos 30 minutos, conforme demonstrado aqui em alta velocidade. Se houver sinais de ruptura ou hemorragia da bolha, é aconselhável liberar lentamente a pressão e interromper a indução precocemente.
Os blisters podem aparecer como blisters de fusão única ou múltipla. O processo é frequentemente associado a uma sensação de coceira. Depois que a bolha estiver totalmente formada, libere a pressão e remova cuidadosamente a câmara de sucção.
Nas bolhas induzidas corretamente, a camada epidérmica é totalmente separada da camada dérmica da pele, deixando uma cavidade cheia de líquido. Proteja a bolha aplicando um curativo macio na área circundante da pele e colocando uma tampa dura sobre a bolha, aqui a partir de um tubo de plástico de 15 mililitros. Prenda a tampa com uma fita não alergênica seguida de um curativo macio e elástico.
Instrua o voluntário a manter o curativo protetor durante a noite. No dia seguinte, remova cuidadosamente o curativo e desinfete a área da bolha com spray. Use uma seringa estéril de 2 mililitros com uma agulha de calibre 23 para colher o conteúdo da bolha.
Insira a agulha na parte lateral superior do teto da bolha e aspire lentamente o fluido. Evite tocar no assoalho da cavidade, mas certifique-se de colher todo o fluido, pois o volume da bolha pode ser baixo, como neste exemplo. A bolha colapsada cicatrizará sem deixar cicatrizes.
Adicione um curativo protetor sobre a bolha. Em seguida, transfira o fluido da bolha para um tubo estéril. Centrifugar durante quatro minutos a 600 G utilizando uma centrífuga de mesa.
Em seguida, colha o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 500 microlitros de meio celular. As células frescas estão agora prontas para contagem e análise posterior. As células da bolha de sucção podem ser usadas para análise in vitro, como citometria de fluxo.
Neste experimento com voluntários vacinados com BCG, o rendimento celular variou de 15.000 a mais de 200.000 células por bolha. Aqui, isolamos células de uma única bolha de sucção e estimulamos as células com PPD in vitro seguido de uma citometria de coloração e fluxo. Para comparação, fizemos uma análise paralela em PBMCs do mesmo voluntário vacinado com PCG.
Nos painéis, você vê populações de células T CD4 positivas coradas para produção intercelular de TNF-alfa, interferon-gama e IL2. Neste voluntário, mais de 30% das células T CD4 positivas isoladas da pele eram antígeno-específicas. Em PBMCs, essa fração foi inferior a 1% Além disso, os perfis de citocinas individuais das células da bolha foram representativos das células T de memória central e das células T efetoras, ilustrando como esse método nos permite estudar respostas de memória de longa duração geradas in vivo.
Aqui, a figura A ilustra que o fluido obtido de bolhas de sucção pode ser analisado para citocinas produzidas in vivo. Na figura B, cultivamos células obtidas de bolhas de sucção por quatro dias na presença de mycobacterium tuberculosis, ilustrando como as células da bolha de sucção são capazes de produzir interferon-gama e TNF alfa ex vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como induzir e colher células de bolhas de sucção após a deposição de antígeno cutâneo.
Nesta demonstração, usamos um antígeno de especial relevância no campo da pesquisa da tuberculose. Mas, os princípios básicos dessa metodologia podem ser úteis nos campos da imunidade adaptativa ou em ensaios que investigam agentes direcionadores de células T. Além disso, lembre-se de que a ética e a segurança são a primeira prioridade ao trabalhar com voluntários humanos.
Lembre-se também de que trabalhar com amostras humanas pode ser perigoso e que as precauções de segurança devem sempre ser seguidas no laboratório.
Visão Geral
Este vídeo demonstra o método de recrutamento cutâneo por bolha de sucção, que permite a coleta de linfócitos T e citocinas específicas para antígenos in vivo. Esta técnica é particularmente útil para o estudo de respostas imunes adaptativas humanas, como no desenvolvimento de vacinas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Resposta imune adaptativa
- Desenvolvimento de vacinas
Contexto
- O método da bolha por sucção fornece uma maneira não invasiva de estudar respostas imunes.
- Permite a coleta de linfócitos T diretamente no local da reação imune.
- A PPD é utilizada como antígeno de recordação para avaliar a memória imunológica.
- Este método pode auxiliar na compreensão dos mecanismos celulares da imunidade.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a técnica de bolha por sucção para a coleta de células imunes.
- Analisar respostas de linfócitos T específicas a antígenos em humanos.
- Fornecer um guia prático para implementar este método em pesquisas.
Métodos Utilizados
- Injeção de PPD na camada dérmica da pele.
- Indução de bolhas por sucção para coletar linfócitos T e citocinas.
- Medição das reações cutâneas após a injeção.
- Coleta do líquido das bolhas para análise posterior.
Resultados Principais
- Demonstrada a indução bem-sucedida de bolhas por sucção.
- Os linfócitos T e citocinas coletados podem ser analisados in vitro.
- Metodologia clara para medir respostas imunes estabelecida.
- Efetividade e segurança da técnica de bolhas por sucção demonstradas.
Conclusões
- O método da bolha por sucção é eficaz para estudar a imunidade adaptativa.
- Essa técnica pode auxiliar na pesquisa e desenvolvimento de vacinas.
- Ele fornece uma ferramenta valiosa para estudos imunológicos em humanos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estudo das respostas de memória de linfócitos T humanos in vivo fornece informações mecanicistas essenciais para o desenvolvimento de vacinas e a validação de alvos em imunoterapia. O método de bolha de sucção para resposta cutânea de memória permite o acesso direto a linfócitos T específicos para antígenos e aos microambientes de citocinas no local da reação imune, apoiando a redução de riscos pré-clínicos de agentes direcionados aos linfócitos T. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta ao vincular achados ex vivo à biologia humana in vivo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante o isolamento direto de linfócitos T CD4+ polifuncionais específicos por antígeno a partir de tecido humano.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio da validação funcional de alvos de linfócitos T em um sistema relevante para a doença.
- Valor Estratégico: Facilita a identificação de candidatos promissores ao fornecer uma alta fração de células específicas por antígeno para triagem mecanicista.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para padronização de ensaios subsequentes utilizando leituras multiplex e citometria de fluxo.
- Valor Operacional: Fornece saídas quantitativas e reprodutíveis da produção de citocinas e funcionalidade de linfócitos T ex vivo.
- Valor Estratégico: Permite a reutilização escalonável da plataforma para avaliar os efeitos de compostos sobre as respostas de linfócitos T de memória humana.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra relevância para doenças por meio de um modelo humano vacinado com BCG de resposta ao tuberculina, alinhado a estratégias translacionais de biomarcadores.
- Valor Operacional: Garante continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, capturando perfis de linfócitos T de memória central e efetora gerados in vivo.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao reduzir ambiguidades mecanicistas em estudos de imunidade celular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a verificação de hipóteses no início da descoberta até a identificação de compostos líderes e validação pré-clínica, especialmente para terapias que modulam linfócitos T e candidatos a vacinas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao colher linfócitos T diferenciados e clonalmente expandidos no local da reação imune.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios por meio de protocolos padronizados de indução de bolhas e coleta de fluido, gerando viabilidade celular consistente para análises posteriores.
- Análises: Fornece medidas quantitativas da frequência de linfócitos T específicos para antígenos e perfis polifuncionais de citocinas (por exemplo, IFN-γ, TNF-α, IL-2) para avaliação comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao demonstrar como as células derivadas de bolhas por sucção refletem respostas de memória de longa duração geradas in vivo.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade reutilizável para o estudo da imunidade adaptativa humana em programas de vacinas e imunoterapias.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista nas respostas imunes humanas.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade do isolamento de linfócitos T específicos para antígenos provenientes da pele humana.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar ou interromper o desenvolvimento mais precisas, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados do desenvolvimento de imunoterapias.
- Impacto sobre o Portfólio: Priorização e tomada de decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em dados de resposta imune relevantes para o ser humano.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em estudos com voluntários humanos, entrega cutânea de antígenos e técnicas de indução de bolhas por sucção.
- Exige uma bomba de vácuo ajustável (–20 a –40 kPa), seringas estéreis, antígeno PPD e equipamentos de centrifugação para o processamento celular.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de medição de bolhas, coleta e transferência de fluido entre equipes de imunologia e clínicas.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes modelos de antígenos e locais de reação cutânea, mantendo gradientes de pressão negativa consistentes.
- Inclui limitações práticas, como rendimento variável de células (15.000–200.000 células/bolha) e dependência da memória imunológica pré-existente nos voluntários.
