Name: Entrega de mediada por vírus adeno-associado de CRISPR para Gene cardíaco em ratos de edição (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a editar genes cardíacos in vivo em camundongos usando vírus adeno-associado recombinante e CRISPR para restaurar a expressão de distrofina. Este método oferece uma estratégia terapêutica promissora para cardiomiopatia distrofica.

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R.H. é suportado pelo U.S. National Institutes of subsídios saúde (R01HL116546 e AR064241 R01).

Os animais utilizados neste protocolo foram mantidos no estado com recursos de animais de laboratório Universidade The Ohio em conformidade com as diretrizes de uso de animais. Todos os estudos em animais foram autorizados pelo institucional Cuidado Animal, uso e o Comitê de revisão da Ohio State University.
1. design e clonagem de gRNAs no vetor CRISPR
<ol><li>Selecione 2 gRNAs segmentação distrofina intron 20 e intrão 23 (i20 e i23) para SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT e i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (a sequência de PAM é sublinhada e itálico). Nota: Os sites de destino para i20 e i23 são cerca de 23 quilos pares de base (kbp) afastado. Para interromper um gene de codificação, dois gRNAs alvejando os exões comuns com o NNGRRT PAM sequenciar para SaCas9 (de preferência, NNGAAT, NNGGGT e NNGAGT) e distância dentro 20 kbp são recomendados.</li>
	<li>Use os seguintes parâmetros PCR para recozer a gRNA oligos (100 µmol/L) em 1x tampão de recozimento (o 5x recozimento regulador contém 0,5 mol/L K-acetato, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L Mg-acetato, pH7.4): 95 ° C 10 min., diminuir a 90 ciclos de 95 a 59 ° C, com 0,4 ° C por ciclo de 20 s, 90 ciclos de 59 a 32 ° C, com uma diminuição de 0,3 ° C por ciclo de 20 s, 20 ciclos de 32 a 26 ° C, com uma diminuição de 0,3 ° C por ciclo de 20 s.</li>
	<li>Ligam os oligos recozido gRNA para o pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA usando BsaI e T4 DNA ligase em uma reação (1 µ l 50 ng / µ l pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA 1 µ l recozido oligos, buffer de ligase T4 DNA de 10 x 1,5 µ l, 0,5 µ l T4 DNA ligase, 1 µ l BsaI, 10 µ l ddH2O ), com a seguinte condição de reação em um cycler PCR: 5 ciclos de 37 ° C 5 min e 16 ° C 10 min; 37 ° C 20 min; 80 ° C 5 min.</li>
	<li>Transformar o produto de ligadura de 15 µ l de células competentes de 30 µ l, placa as células em placa de ágar com 100 mg/mL ampicilina e cultura a 37 ° C por 24 h.</li>
	<li>Pegar de 5 a 10 colônias e cultura em meio LB contendo 100 µ g/mL ampicilina a 37 ° C, 250 rpm numa incubadora shaker para 3-4 h.</li>
	<li>As colônias por PCR de tela: 10 µ l 2 x mestre mistura PCR 8 µ l ddH2O, cultura de Escherichia Coli 1 µ l, 1 µ l 10 µmol/L U6-forward da primeira demão, 1 µ l i20 ou i23 gRNA inversa da primeira demão. Os parâmetros de ciclismo de PCR: 95 ° C 5 min, 35 ciclos de 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s.</li>
	<li>Prepare a cultura 5ml dos clones positivos por adicionando 4 mL fresco LB médio containing100 µ g/mL ampicilina e cultura durante a noite a 37 ° C, 250 rpm.</li>
	<li>Purificar o plasmídeo de DNA usando o kit de extração de plasmídeo apropriado e verifique se o plasmídeo por Sanger sequenciando com o primer U6-para a frente.</li>
	<li>Cultura de células de C2C12 em DMEM suplementado com 10% FBS e 1% caneta-Strep até alcançar a confluência de ~ 70% para testar o gene edição eficácia dos Plasmideos.</li>
	<li>Electroporate um total de 5 µ g de mistura de plasmídeo SaCas9/gRNA em proporção molar de 1:1 em 1 x 106 C2C12 células de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Depois de pós-transfeccao 48 h, colher as células C2C12 e extrair DNA genômico.</li>
	<li>Uso 100 ng DNA genômico como modelo para realizar a reação de PCR para locus de distrofina rato: encaminhar cartilha 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µ l 10 µmol/L), reverter a primeira demão 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µ l 10 µmol/L), 10 µ l 2 x a verde PCR master mix, 7 µ l ddH2O, 1 µ l (de DNA genômico 100 ng). Use o PCR ciclismo condições como a 95 ° C 5 min, 35 ciclos de [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 min.</li>
</ol>2. produção de rAAV
<ol><li>Para cultura de células, células AD293 para 20 a 40 de pratos de 15 cm da semente e manter em DMEM suplementado com 10% FBS e 1% caneta-Strep até alcançar a confluência do ~ 90% para transfeccao.</li>
	<li>Diluir 3 plasmídeos com 200 µ l reduziram média de soro (por prato): 1) 10 µ g pHelper; 2) 5 µ g pXR (rh.74 ou outros sorotipos) e 3) num total de 5 µ g de mistura de pX601-i20 e pX601-i23 (proporção de 1:1). Executar o polyethylenimine (PEI) do transfection misturando com 80 µ l PEI e incubar a temperatura ambiente por 10 min. adicionar a mistura para as culturas de células AD293 em forma de gota a gota.</li>
	<li>Para a produção de vírus vírus adeno-associados, depois de Transfeccao de post de 72 h, use um raspador de célula para coletar tanto a mídia e as pelotas de célula AD293 por centrifugação a 1100 x g por 10 minutos.</li>
	<li>Resuspenda as pelotas de célula em 15 mL de tampão de Lise rAAV (50 mmol/L Tris Base, 150 mmol/L NaCl, pH 8,5) seguidas por 3 ciclos de congelamento e descongelamento com a alternância de incubação em nitrogênio líquido e um banho de água de 42 ° C. Armazene os lisados celulares em-80 ° C para processamento futuro se eles não estão sendo processados imediatamente.</li>
	<li>Os meios de cultura de filtragem com um filtro de 0,45 µm e adicionar um 40% PEG8000 em 2,5 mol/L NaCl, a uma concentração final de 8%. Incube a mistura a 4 ° C, durante 1 h e centrifugar 1100 x g por 15 min.</li>
	<li>Resuspenda as pelotas em tampão de Lise rAAV e combinar com os lisados celulares da etapa 2.3, seguido de tratamento benzonase (50 U/mL) a 37 ° C por 1h.</li>
	<li>Centrifugue o rAAV benzonase-tratados contendo mistura 1100 x g durante 15 minutos a 4 ° C e salvar o sobrenadante (preparação rAAV bruto).</li>
</ol>3. rAAV purificação e concentração
<ol><li>Carregar a preparação rAAV bruto em um gradiente de iodixanol num tubo se na seguinte ordem de cima para a parte inferior: bruto AAV lisado (~ 15 mL), 8 mL 15% Iodixanol, 6 mL 25% Iodixanol, 5ml 40% Iodixanol, 5ml 58% Iodixanol. Preencha o restante volume vazio do tubo até o topo usando 1 x DPBS.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 230.000 x g em um rotor se para 120 min a 10 ° C e coletar 3-4 mL da fração gradiente 40% contendo as partículas rAAV com uma agulha de 18 G.</li>
	<li>Dilua as partículas rAAV com 1 x DPBS e centrífuga usando a unidade de filtração centrífuga (MWCO 100 kDa). Repita este passo para 3 - 5 vezes e finalmente concentrar a preparação rAAV a 300-500 µ l.</li>
</ol>4. rAAV Titulagem
<ol><li>Extrair o DNA genômico de 2 µ l concentrado rAAV, precipitado com 3 M NaOAc em etanol e ressuspender em 20 µ l ddH2O.</li>
	<li>Obter a curva padrão para quantificação de rAAV por diluição serial do plasmídeo pX601: 1 x 109, 1x108,1 x 107, 1 x 106, 1 x 105 cópias em cada 10 µ l ddH2O. dilua o rAAV DNAase-tratados as amostras como 01:10, 01:50, 1: 100 e 1: 1000.</li>
	<li>Determinar o título de rAAV por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) usando qPCR Kit de acordo com as instruções do fabricante, em um sistema de PCR em tempo real: 1 µ l 10 µmol/L de cada primer (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC e 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µ l 2 x mestre mistura PCR, 1 µ l diluído rAAV amostras e 2 µ l ddH2O. executar a reação com os seguintes parâmetros de ciclismo: 95 ° C 3 min, 45 ciclos de 95 ° C 5 seg e 61 ° C 20 seg.</li>
</ol>5. intravenosa e injeção Intraperitoneal de rAAVrh.74-CRISPR em Neonatal mdx/Utrofina+ /- ratos
<ol><li>Imobilizar os mdx/Utrofina+ rato filhotes (dia 3), colocando no gelo por 1 min e então administrar com 1 x 1012 partículas virais em 50 µ l por rato sistemicamente através de uma abordagem retrô-orbital ou uma injeção intraperitoneal.</li>
	<li>Permitir que os ratos recuperar e colocar volta em suas gaiolas para casa. Às dez semanas após a administração de rAAV, eutanásia em ratos pela exposição de CO2 para a coleção de tecido.</li>
	<li>Snap-congelar tecidos para genômica extração de DNA e RNA e o uso de refrigeração em nitrogênio líquido para congelar tecidos com temperatura ideal de corte composto para cryosectioning o isopentano.</li>
</ol>6. análise do Gene alvo, resultados de edição
<ol><li>
Análise de PCR do DNA genômico
	<ol>
<li>Isole o DNA genômico de tecidos de camundongos mdx/Utrofina+ /- coração tratado com ou sem rAAV total.</li>
		<li>Use o mesmo protocolo em 1.12 passo para análise PCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de RT-PCR da expressão de distrofina
	<ol>
<li>Extrair o RNA total de tecidos do coração com o kit de extração de RNA seguindo o manual do fabricante.</li>
		<li>Para realizar a transcrição reversa, Pre-treat o RNA total com um livre de RNase DNase e uso 5 µ g de RNA tratado como modelo para a síntese do cDNA da primeiro-costa com o kit de transcrição reversa.</li>
		<li>Utilizar o produto de transcrição reversa para análise de RT-PCR da expressão de distrofina com os primers de cDNA de distrofina: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT e 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estimar o gene edição eficácia por qPCR análise
	<ol>
<li>Estimar o gene edição eficácia por RT-PCR quantitativo para detectar a redução da exon 22-contendo as transcrições usando o primer para a frente (exon 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA e o primer reverso (exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Use Gapdh como um gene de referência com o primer para a frente: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC e o primer reverso: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.</li>
		<li>Executar o PCR quantitativo em tempo real (qPCR) usando o qPCR Kit de acordo com as instruções do fabricante, em um sistema de PCR em tempo real e as condições de reação de 2-passo: 95 ° C 3 min, 45 ciclos de 95 ° C 5 seg e 61 ° C 30 seg.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mancha para analisar a expressão de distrofina
	<ol>
<li>Corte os tecidos congelados usando um criostato em uma espessura de 10 µm. Fix as seções congeladas com paraformaldeído 4% à temperatura ambiente por 15 min.</li>
		<li>Lave 2 vezes com PBS e incubar com bloqueio de solução (10% de soro de cavalo) por 1h.</li>
		<li>Incube o anticorpo primário antidistrofina, a 4 ° C durante a noite.</li>
		<li>Lave os slides com PBS 3 x 5 min e incubar com anticorpos secundários fluorescentes (1: 500) à temperatura ambiente durante 1 h.</li>
		<li>Monte as lâminas usando o meio de montagem com DAPI e imagem com um microscópio confocal invertido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. o alvo análise por meio de ensaio T7E1
<ol><li>Prever os potenciais sites fora do alvo usando o on-line CRISPR projetar ferramentas tais como < http://crispr.mit.edu>.</li>
	<li>Amplificar as regiões genômicas cobrindo o top 5-10 sites de fora do alvo potenciais por PCR: ng de 200 de DNA genômico, 1 µ l alta fidelidade DNA polimerase, 5 µ l 10 x PCR Buffer misturar 1,5 µ l 10 µmol/L de site-specific primers para diante e reversos, ajustando o volume total de 50 µ l, com ddH2O.</li>
	<li>Executar os produtos PCR por electroforese, extrair e purificar o DNA usando um kit de extração do gel. Medir a concentração usando espectrofotômetros.</li>
	<li>Promover a formação de doheteroduplex por desnaturação e re-recozimento os amplicons purificada lentamente no Buffer 2.1 usando um reciclador PCR. Use as mesmas condições de ciclismo conforme detalhado na etapa 1.2.</li>
	<li>Digerir os produtos re-recozidos por 30 min a 37 ° C, com a enzima de T7E1 0,5 µ l e analisar a reação a electroforese do gel do agarose 1-2%. Nota: Os amplicons também podem ser analisados pelo sequenciamento profundo orientado.</li>
</ol>

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<li>Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Sarcoglycan+gene+transfer+decreases+fibrosis+and+restores+force+in+LGMD2E+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice.</a> Gene therapy. 23, 57-66 (2016).</li>
<li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmapheresis+eliminates+the+negative+impact+of+AAV+antibodies+on+microdystrophin+gene+expression+following+vascular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery.</a> Mol Ther. 22, 338-347 (2014).</li>
<li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+delivery+of+rAAVrh74.MCK.GALGT2+to+the+gastrocnemius+muscle+of+the+rhesus+macaque+stimulates+the+expression+of+dystrophin+and+laminin+alpha2+surrogates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates.</a> Mol Ther. 22, 713-724 (2014).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5, 407-415 (2015).</li>
<li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).</li>
</ol>

Não há conflito de interesse existe.

Neste protocolo, detalhamos todas as etapas necessárias para alcançar na vivo cardíaca gene edição no pós-natal ratos usando entrega mediada por rAAVrh.74 de SaCas9 e dois gRNAs. Como já observado, esta abordagem pode ser usada para restaurar a expressão da distrofina em camundongos distróficos, conforme descrito em nosso trabalho27, mas isso também poderia permitir estudos de genética reversa rápida de genes relacionados ao cardíaco em camundongos sem o longo processo do abordagem tradic...

A cluster, regularmente intercalada, curta palíndromo repetição (CRISPR) tecnologia representa o mais recente avanço na engenharia de genoma e revolucionou a prática atual da genética em células e organismos. Edição baseada em CRISPR genoma utiliza um guia único RNA (gRNA) para direcionar uma endonuclease CRISPR associadas tais como proteínas associadas CRISPR 9 (Cas9) e Cpf1 para um alvo de DNA genômico complementar em sequência para o protospacer codificada pela gRNA com um protospacer específico motivo adjacentes (PAM)1,2. O PAM varia dependendo da espécie bacteriana do gene Cas9 ou Cpf1. O mais comumente usado nuclease Cas9 derivado de Streptococcus pyogenes (SpCas9) reconhece uma sequência de PAM de NGG que encontra-se diretamente a jusante da sequência alvo no DNA genômico, na vertente não-alvo. No local de destino, as proteínas Cas9 e Cpf1 geram uma ruptura da dobro-Costa (DSB), que então é reparada via intrínsecos mecanismos reparação DNA celulares, incluindo não-homóloga final juntando (NHEJ) e reparação de homologia-dirigido (HDR) vias3, 4. Na ausência de um modelo de DNA para recombinação homóloga, ORL é reparado principalmente por via NHEJ propenso a erro, que pode resultar em inserções ou exclusões (puntuais) de nucleotídeos, causando mutações frameshift se o ORL foram criado na codificação região de um gene5,6. Assim, o sistema CRISPR amplamente serviu para engenheiro-perda da função de mutações em vários modelos de celulares e organismos de todo, a fim de investigar a função de um gene. Além disso, o Cas9 cataliticamente inactiva e Cpf1 têm sido desenvolvidos para transcricionalmente e epigenetically modulam a expressão de genes de alvo7,8.
Mais recentemente, tanto SpCas9 e SaCas9 (derivado de Staphylococcus aureus) foram embalados em vetores de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) para correção do gene pós-natal no modelo animal de doenças humanas, particularmente, Duchenne distrofia muscular (de Duchenne DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD é uma doença fatal e ligada ao X recessiva causada por mutações no gene DMD , que codifica a distrofina proteína16,17, afetando aproximadamente 1 em 3500 nascimentos masculinos de acordo com o teste do pezinho18 , 19. é caracterizada por fraqueza muscular progressiva e a perder. Os pacientes DMD geralmente perdem a habilidade de andar entre 10 e 12 anos de idade e morrem de insuficiência respiratória e/ou cardíaca com a idade de 20-30 anos20. Notavelmente, cardiomiopatia desenvolve em > 90% dos pacientes DMD e representa a principal causa de morte em pacientes DMD21,22. Embora o Deflazacort (um medicamento anti-inflamatório) e Eteplirsen (um exon saltando de medicina para saltar o exon 51) recentemente foram aprovados para DMD pelo Food and Drug Administration (FDA)23,24, nenhum destes tratamentos corrigi o defeito genético no nível do DNA genômico. O mdx mouse, que transporta uma mutação pontual no exon 23 do gene da distrofina, tem sido amplamente utilizado como um DMD modelo25. Além disso, temos demonstrado anteriormente que a expressão de distrofina funcional foi restaurada por exclusão em-frame do DNA genômico cobrindo exões, 21, 22 e 23 em músculos esqueléticos de camundongos mdx usando intramuscular entrega de Ad-SpCas9/gRNA9 e dos músculos do coração de camundongos mdx/Utrofina+ /- usando intraperitoneal e intravenosa entrega de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA26.
Neste protocolo, descrevemos em detalhe cada etapa no gene cardíaca pós-natal de edição para restaurar a distrofina em camundongos mdx/Utrofina+ /- usando vetores de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA, desde a concepção de gRNA para análise de distrofina nas seções de músculo do coração.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 555 cabra anti-coelho IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Bio Gabinetes de Segurança</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1347</td><td>1300 Série A2 Classe II, Tipo A2</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>RO535S</td><td></td></tr><tr><td>Células competentes</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td>200314</tr><tr><td>Placas de cultura celular, 150 mm</td><td>Nest Scientific EUA</td><td>715001</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Leica CM3050S</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td>Corning cellgro</td></tr><tr><td>anticorpo de distrofina</td><td>Spring Bioscience</td><td>E2660</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Ion Midi Plasmdi Kits</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47111</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-140-079</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Filtro, 0.45&mu; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Master Mixes</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit de plasmídeo de alta velocidade</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47102</td><td></td></tr><tr><td>Soro para cavalos</td><td>Abcam</td><td>ab139501</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 2239 Banho-maria</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-460-11Q</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Heat Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal invertido</td><td>Carl Zeiss Microscopy, LLC LSM</td><td></td><td>780</td></tr><tr><td>LightCycler 480 instrumento</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480 Instrumento II</td></tr><tr><td>Centrífuga de grande capacidade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-910</td><td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002445</td><td>Espectrofotômetros Nanodrop Sorvall Legend Micro 21R</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>NanoDrop&trade; 2000/2000c</td></tr><tr><td>Oligos para i20-F</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC</td></tr><tr><td>Oligos para i20-R</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;</td></tr><tr><td>Oligos para i23-F</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC</td></tr><tr><td>Oligos para i23-R</td> Integrated <td>DNA Technologies</td><td></td><td>GACCTTCCCTCTCATCGGTGc</td></tr><tr><td>Oligos</td><td>Integrated DNA</td><td></td><td></td></tr> Technologies <tr><td>OptiPrep Gradiente de Densidade Médio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>31985070</tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510-1kg-F</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenonimina</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td> Tubo de centrífuga <td>Quick-Seal Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Kits de qPCR Hi-ROX SYBR Green Radiante</td><td>Alkali Scientific</td><td>QS2005</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid RT Kit de Transcrição Reversa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>337922</td><td>Tipo 70Ti</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>8043-30-1192</td> Unidade de filtro ultracentrífugo <td>Optima le-80k</td></tr><tr><td>Meio de montagem</td> MilliporeSigma UFC510096 <td></td><td></td> VECTASHIELD com DAPI Vector Laboratories, Inc H-1200 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

entrega de mediada por vírus adeno-associado de crispr para gene cardíaco em ratos de edição

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

O sistema (CRISPR) repetição clusterizado regularmente intercalado, curto, palíndromo tem facilitada engenharia do genoma em culturas de células e organismos vivos de uma grande variedade de espécies. A tecnologia CRISPR também tem sido explorada como romance terapêuticas para um número de doenças humanas. Dados de prova de conceito são altamente animadores, como exemplificado por estudos recentes que demonstram a viabilidade e a eficácia da abordagem terapêutica baseada em edição de gene para a distrofia muscular de Duchenne (DMD) usando um modelo murino. Em particular, a injeção intraperitoneal e intravenosa do sorotipo de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) rh.74 (rAAVrh.74) permitiu cardíaca uma entrega eficiente de proteínas associadas CRISPR 9 o Staphylococcus aureus (SaCas9) e dois Guia de RNAs (gRNA) para excluir uma região genômica com um códon mutante no exon 23 do gene Dmd de rato. Esta mesma abordagem também pode ser usada para nocautear o gene de interesse e estudar sua função cardíaca em camundongos pós-natal quando a gRNA destina-se a região codificante do gene-alvo. Neste protocolo, mostramos em detalhes como engenheiro vector rAAVrh.74-CRISPR e como conseguir altamente eficiente entrega cardíaca em camundongos neonatais.

A eficácia do gRNAs para induzir a exclusão da região de DNA genômica de destino deve ser avaliada em culturas de células antes de empacotar em rAAV para estudos in vivo. Para este fim, o gRNAs e SaCas9-expressando construções foram electroporated em C2C12 de células e o DNA genômico foi analisado por PCR com primers flanqueando os sites de destino (Figura 1). Um produto PCR de ~ 500 bp indica exclusão bem-sucedida do DNA genômico alvo resultantes da edição d...

Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para realizar na vivo edição de gene cardíaca em ratos usando recombinantes Adeno-Associated vírus (rAAV)-mediada entrega de CRISPR. Este protocolo oferece uma promissora estratégia terapêutica para tratar a cardiomiopatia distrófica em distrofia muscular de Duchenne e pode ser usado para gerar o nocaute cardíaco-específicas em ratos pós-natal.

Entrega de mediada por vírus adeno-associado de CRISPR para Gene cardíaco em ratos de edição

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

O objetivo geral deste protocolo de edição de genes cardíacos in vivo é restaurar a expressão de distrofina no coração de camundongos distróficos usando vírus adeno-associado recombinante rh. 74 com CRISPR SaCas9 e vetores de RNA guia. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da distrofia muscular, como se a edição de genes é uma estratégia terapêutica confiável para tratar a causa raiz da cardiomiopatia associada à distrofia muscular de Duchenne.A principal vantagem dessas técnicas é que a expressão do gene da distrofina corrigida está sob seu controle regulatório endógeno, e esse efeito de resgate é permanente. A implicação dessa técnica se estende ao tratamento de outras doenças genéticas, onde a correção do gene mutante pode ser alcançada pela tecnologia de edição de genes CRISPR Cas9. Este método não apenas fornece informações sobre a restauração da distrofina no coração distrófico, mas também pode ser usado para eliminar o gene de interesse para estudos genéticos reversos.Demonstrando o procedimento estará Yandi Gao, um técnico do nosso laboratório. O design adequado dos RNAs guia, ou gRNAs, é fundamental para o sucesso deste protocolo. Selecione dois gRNAs direcionados ao íntron 20 e ao íntron 23 da distrofina para a proteína nove associada ao Staphylococcus aureus CRISPR.A sequência de motivos adjacentes ao protoespaçador para cada gRNA é sublinhada e em itálico. Para recozer os oligonucleotídeos de gRNA, estabeleça uma reação contendo 100 micromoles por litro dos oligonucleotídeos de gRNA em tampão de recozimento 1x. Use os seguintes parâmetros de PCR: 95 graus Celsius por 10 minutos, 90 ciclos de 95 a 59 graus Celsius com uma redução de 0,4 graus Celsius por ciclo por 20 segundos, 90 ciclos de 59 a 32 graus Celsius com uma diminuição de 0,3 graus Celsius por ciclo por 20 segundos e 20 ciclos de 32 a 26 graus Celsius com uma diminuição de 0,3 graus Celsius por ciclo por 20 segundos.Em seguida, prepare-se para ligar os oligonucleotídeos de gRNA recozidos no vetor CRISP em uma reação. Adicione o seguinte a um tubo: um microlitro de 50 nanogramas por vetor CRISPR de microlitro, um microlitro de oligonucleotídeos recozidos, 1,5 microlitros de tampão 10x T4 DNA ligase, 0,5 microlitros de T4 DNA ligase, um microlitro de Bsal e 10 microlitros de água bidestilada Execute a seguinte reação em um termociclador: cinco ciclos de 37 graus Celsius por cinco minutos e 16 graus Celsius por 10 minutos, 37 graus Celsius por 20 minutos e 80 graus Celsius por cinco minutos.Transforme o produto de ligação de 15 microlitros em 30 microlitros de células competentes e coloque as células em uma placa de ágar contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Cultura a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, colher cinco a 10 colónias da placa de ágar e cultivar em meio LB contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina a 37 graus Celsius e 250 rpm durante três a quatro horas.Para rastrear as colônias por PCR, prepare reações que contenham 10 microlitros de master mix de PCR, oito microlitros de água bidestilada Use os seguintes parâmetros de ciclo de PCR: 95 graus Celsius por cinco minutos, seguidos por 35 ciclos de 95 graus Celsius por 30 segundos, 61 graus Celsius por 30 segundos e 72 graus Celsius por 30 segundos. Uma vez identificados os clones positivos, preparar uma cultura de cinco mililitros de cada clone positivo, adicionando quatro mililitros de meio LB fresco contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina e cultivando a 37 graus Celsius e 250 rpm durante a noite.No dia seguinte, purificar o ADN do plasmídeo utilizando o kit de extracção de plasmídeos adequado. O plasmídeo é posteriormente verificado por sequenciamento de Sanger com o primer U6-forward. Para testar a eficácia da edição gênica dos plasmídeos, cultive células C2C12 em DMEM suplementadas com 10% de FBS e 1% de Pen-Strep até que as células atinjam aproximadamente 70% de confluência.Eletroporar um total de cinco microgramas de mistura de plasmídeo SaCas9/gRNA na proporção molar de um para um em células C2C12 de acordo com o protocolo do fabricante. 48 horas após a transfecção, colher as células C2C12 e extrair o DNA genômico conforme descrito no protocolo de texto. Use o DNA genômico como modelo para realizar PCR para o locus de distrofina de camundongo.Configure reações contendo o primer direto, o primer reverso, a mistura master de PCR verde, água bidestilada e 100 nanogramas de DNA genômico. Utilizar as mesmas condições de PCR que para o rastreio de clones positivos. Antes de iniciar este procedimento, prepare o vírus adeno-associado recombinante, ou rAAV, conforme descrito no protocolo de texto.Administre filhotes de camundongos mdx do terceiro dia com partículas virais sistemicamente por meio de uma injeção intraperitoneal. Permita que os ratos se recuperem e coloque-os de volta em suas gaiolas domésticas. Às 10 semanas após a administração de rAAV, colete tecidos dos camundongos.Congele os tecidos para extração de DNA e RNA genômico e use isopentano resfriado em nitrogênio líquido para congelar tecidos com composto de temperatura de corte ideal para criossecção. Comece o protocolo de coloração por imunofluorescência fixando as seções de tecido congelado com paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente por cinco minutos. Após 15 minutos, lave as seções de tecido duas vezes com PBS.Incubar com solução de bloqueio à temperatura ambiente durante uma hora. Em seguida, incube com o anticorpo primário antidistrofina a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, lave as lâminas com PBS e, em seguida, incube com anticorpos secundários fluorescentes em temperatura ambiente por uma hora.Monte as lâminas usando o meio de montagem com DAPI e a imagem com um microscópio confocal invertido. A eficácia dos gRNAs em induzir a deleção da região do DNA genômico alvo em culturas celulares foi avaliada por PCR. Um produto de PCR de aproximadamente 500 pares de bases indica a deleção bem-sucedida do DNA genômico alvo resultante da edição de genes, enquanto as células de controle não devem produzir uma banda.Uma vez confirmada a eficácia dos gRNAs em culturas de células, os gRNAs são empacotados em rAAV. As partículas virais do rAAV são purificadas e a pureza analisada por SDS-PAGE. A presença de apenas três bandas correspondentes às três proteínas do capsídeo indica alta pureza.Essas imagens representativas de imunofluorescência de seções cardíacas de camundongos selvagens, mdx e mdx tratados com AAV SaCas9 gRNA sistemicamente mostram que AAV SaCas9 gRNA restaura a expressão de distrofina em camundongos distróficos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter edições de genes cardíacos in vivo em camundongos pós-natais usando rAAV rh. Entrega mediada por 74 de SaCas9 e gRNAs.

adeno-associated-virus-mediated-delivery-crispr-for-cardiac-gene

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Neste vídeo, demonstramos a entrega de genes baseados em adenovírus associados recombinantes no filhote de camundongo. Este método ajuda no estudo da expressão gênica nas células-alvo.

Entrega de genes baseada em vírus adeno-associados recombinantes: uma técnica para entrega de transgenes e expressão cardíaca específica em modelo de roedor

O sistema / Cas9 CRISPR oferece o potencial para fazer genoma segmentado edição acessível e disponível para a comunidade científica. Este protocolo destina-se a demonstrar como criar vírus que vai nocaute um gene de interesse utilizando o sistema / Cas9 CRISPR, e depois injetá-las estereotáxicamente no cérebro do rato adulto.

Concepção, embalagem, entrega e de alto título CRISPR retro e lentivírus via estereotáxica Injection

Neste manuscrito, é descrito um método para preparar vetores recombinantes do vírus adeno-associado 9 (rAAV9) para manipular a expressão gênica no coração de camundongos.

Preparação de rAAV9 para superexpressão ou Knockdown Genes em mouse Corações

O cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repetições/CRISPR associado da proteína 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornece uma ferramenta promissora para a engenharia genética e abre a possibilidade de integração específica de transgenes. Descrevemos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-baseado estratégia eficiente DNA alvo integração na vivo e alvo de terapias do gene usando CRISPR/Cas9.

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

Aqui nós apresentamos um protocolo para a manipulação do gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia, os corações de rato foram exteriorizados através do quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus codificação de genes específicos foram injetados com uma seringa o miocárdio, seguido por medição de expressão de proteínas via na vivo de imagem e Western blot análise.

Um método simples e eficiente para In Vivo cardíaco-específicas do Gene manipulação por injeção Intramiocárdica em ratos

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

O desenvolvimento de modelos de urina com genes específicos mutados em pacientes com câncer de cabeça e pescoço é necessário para a compreensão da neoplasia. Aqui, apresentamos um protocolo para a transformação in vitro das células primárias da língua murina usando um sistema de vírus-Cas9 associado ao adeno para gerar linhas celulares murine HNC com alterações genômicas específicas.

In Vitro Estabelecimento de uma linha de células de câncer de urina de urina geneticamente modificada usando um sistema adeno associado de vírus-cas9

Neste protocolo, descrevemos os procedimentos técnicos para gerar camundongos knockout específicos para tecido adiposo marrom (BAT) utilizando um sistema combinado de RNA guia único (sgRNA) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e vírus adenoassociado (AAV). As etapas descritas incluem o planejamento dos sgRNAs, a preparação das partículas de AAV-sgRNA e a microinjeção de AAV nos lóbulos BAT.

Geração de camundongos knockout específicos para gordura marrom usando um sistema combinado de RNA guia único Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e vírus adenoassociado

Este protocolo apresenta uma abordagem otimizada para a produção de modelos de ratos geneticamente modificados. O vírus adenoassociado (AAV) é usado para entregar um modelo de reparo de DNA, e a eletroporação é usada para entregar reagentes CRISPR-Cas9 para completar o processo de edição do genoma em embrião de 2 células.

CRISPR-Cas9 Edição Genômica de Embriões de Rato usando Vírus Adenoassociado (AAV) e Eletroporação de Embriões de 2 Células

Este relatório detalha o método de injeção localizada de vetores AAV através da pelve renal para transferência eficaz e segura de genes para o rim de camundongo.

Entrega de genes eficaz e segura ao rim de camundongo por meio de injeção lenta e retrógrada da pelve renal de vetores de vírus adeno-associados

Aprenda a editar genes cardíacos in vivo em camundongos usando vírus adeno-associado recombinante e CRISPR para restaurar a expressão de distrofina. Este método oferece uma estratégia terapêutica promissora para cardiomiopatia distrofica.

Entrega de mediada por vírus adeno-associado de CRISPR para Gene cardíaco em ratos de edição

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