Name: Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Aprenda a caracterizar o microbioma da raiz em diferentes compartimentos usando perfilamento da comunidade bacteriana do gene 16S rRNA. Este método padronizado permite analisar fatores bióticos e abióticos que influenciam a estrutura microbiana em plantas.

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Este trabalho foi financiado pelo USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS é suportado pelo NSF Research Fellowship graduação.

1. recolha e separação de raiz Endosphere, rizosfera e amostras de solo
<ol><li>Antes de entrar em campo, água ultrapura autoclave (pelo menos 90 mL de água por exemplo) para esterilizar. Prepare o buffer de remoção de epífitas (pelo menos 25 mL por amostra), acrescentando 6,75 g de KH2PO4, 8,75 g de K2HPO4e 1 mL de Triton X-100, para 1 L de água estéril. Esterilize o buffer usando um filtro de vácuo com tamanho de poro 0,2 µm.<ol>
<li>Para etapas de 1.2 a 1.5, desgaste luvas esterilizadas esterilizadas com etanol em todos os momentos e substituir as luvas entre cada amostra para evitar a contaminação. Esterilizar todos os equipamentos com etanol a 70% e limpe todos os equipamentos entre as amostras. Antes da amostragem, determinar a profundidade de amostragem ideal para sua experiência e ser coerente com todas as coleções de solo e raiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para coletar amostras de solo em massa, use um coletor de núcleo de solo etanol-esterilizados para obter solo que é livre de raízes de plantas, recolhendo um núcleo aproximadamente 23 a 30 cm da base da planta.</li>
	<li>Transferir o solo para um saco de plástico, homogeneizar o solo por agitação suave e transferir uma alíquota da amostra de solo (cerca de 600 mg) para encher um tubo de 2 mL. Imediatamente, coloque o tubo de 2 mL em gelo seco ou flash congelar o tubo no líquido N2 até estar pronto para prosseguir com a extração de DNA (etapa 2).<ol>
<li>Em alguns ambientes, do solo circundante pode conter material vegetal. Nesse caso, use uma peneira de 2mm esterilizado para separar os restos de plantas do solo antes de colocá-lo num saco de plástico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para coletar a raiz e a rizosfera, use uma pá de etanol-esterilizados para desenterrar a planta, tendo o cuidado de obter o máximo da raiz quanto possível. Profundidade é dependente da planta. Enquanto pequenas plantas como o trigo podem ser removidas por cavar vários centímetros, plantas maiores tais como sorgo podem exigir 30 cm ou mais. Agite delicadamente fora excesso solo das raízes até há cerca de 2 mm do solo, aderindo à superfície da raiz. Nota: tenha cuidado ao trabalhar com pequenas plantas, com raízes frágeis, ou em solos conteúdos secos, alta-argila. Idealmente, só deve haver uma camada fina de solo, permanecendo nas raízes após agitação. Se continuam a ser grandes agregados do solo, um martelo de borracha pode ser usado para deslocar o solo batendo suavemente a base da filmagem. Se a quantidade de solo restante após este processo excede ou fica aquém de 2 mm, a espessura aproximada deve notar-se.</li>
	<li>Para plantas grandes, use tesoura esterilizada e/ou tesouras para cortar uma subseção representativa das raízes e colocar um mínimo de 500 mg de tecido de raiz dentro de um frasco de Erlenmeyer de 50 mL. Para gramíneas menores, coloque todo o sistema de raiz dentro do frasco. Adicionar suficiente reserva de remoção de epífitas para cobrir as raízes, em seguida, imediatamente, colocar a amostra em gelo seco ou flash congelar a amostra do líquido N2. Nota: tenha cuidado para não encher demais o recipiente cónico de 50 mL, como ele vai fazer lavagem passo difícil. Deve haver bastante espaço vazio, tal que o buffer de epífitas é capaz de fluir para o fundo, cercam as raízes ao longo do frasco e cobrir o topo. Porque algumas gramíneas tem mais biomassa de raiz que vai caber dentro de um frasco de Erlenmeyer de 50 mL, uma subseção de raízes deve ser colhida. No entanto, deve notar-se que corte as raízes poderia levar a bactérias endofíticas sendo lavadas para fora para a fração de rizosfera, raízes o namoro deve ser minimizado. Se as amostras não são processadas imediatamente após retornar para o laboratório, eles podem ser armazenados a-80 ° C.</li>
	<li>Para separar as raízes, a rizosfera, descongelar a amostra de raiz no gelo e, em seguida, proceda à sonicação das amostras de raiz a 4 ° C por 10 min com pulsos de 160 W por 30 s, separados por 30 s. transferência as raízes em um gelado (4 ° C), limpe 50 mL tubo usando Pinças esterilizadas. Não elimine o tubo original com amortecedor e solo, que é a fração de rizosfera (Figura 1).</li>
	<li>Centrifugar o tubo contendo tampão e rizosfera para 10 min a 4 ° C, 4.000 x g. decantar o sobrenadante, flash congelar o tubo contendo a fração de rizosfera em líquido N2e armazenar a fração de rizosfera a-80 ° C até que esteja pronto para prosseguir com o DNA extração (etapa 2).</li>
	<li>Para lavar as raízes, adicione cerca de 20 mL de água estéril refrigerados (4 ° C) para a fração de raiz. Lave a raiz agitando vigorosamente (à mão ou mixer, para 15 a 30 s) e em seguida, drenar a água.</li>
	<li>Repita este passo pelo menos duas vezes, até que nenhum solo permanece na superfície de raiz. Se a extração de DNA (etapa 2) não é executada imediatamente, envolva as raízes em folha de alumínio estéril, flash congelar as raízes no líquido N2e armazenar as amostras a-80 ° C até pronto para prosseguir com a extração de DNA.</li>
</ol>2. extração de DNA
Nota: Durante as etapas 2 e 3, luvas esterilizadas esterilizadas com etanol devem ser usadas em todos os momentos e todo o trabalho deve ser realizado sobre uma superfície esterilizada com etanol.
<ol><li>Extrai o DNA de amostras de solo e da rizosfera.<ol>
<li>Uso uma espátula estéril para transferir rapidamente 250 mg do solo e da rizosfera de passos 1.3 e 1.7 nos tubos de coleta seletiva fornecida em um kit de isolamento de DNA comercial projetado para extração do solo e, em seguida, prosseguir com isolamento de DNA utilizando o fornecedor kit protocolo.</li>
		<li>Após a eluição do DNA no buffer de eluição fornecido pelo kit de isolamento de DNA, armazene o DNA a-20 ° C até que esteja pronto para prosseguir com o passo 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extrai o DNA de amostras de raiz.<ol>
<li>Acalme um esterilizado pilão usando líquido N2. Meça 600 a 700 mg de tecido de raiz e coloque o tecido no almofariz. Cuidadosamente, adicione o suficiente de líquido N2 para cobrir as raízes.</li>
		<li>Moa as raízes em pedaços pequenos. Continuar o processo de adição de líquido N2 e moagem (pelo menos duas vezes, ser consistente entre amostras), até que as raízes são um pó fino. Certifique-se de que o tecido de raiz Não descongele durante esta etapa. Atenção: Utilize equipamento de protecção adequado (jaleco, óculos de proteção e luvas criogênicas) quando trabalhar com líquido N2. Nota: Para uma extração de DNA de baixa qualidade, pode ser benéfico moer raízes em excesso em pó e armazenar o pó a-80 ° C.</li>
		<li>Rapidamente, antes da raiz em pó começa a descongelar, use uma espátula estéril para transferir o pó da raiz em tubos pré-pesados 1,5 mL no gelo. Registre o peso do tubo e do pó. Normalmente, 300-400 mg de pó é transferida.</li>
		<li>Uso uma espátula estéril rapidamente transferir 150 mg de pó de raiz para o tubo de coleta fornecido em um kit de isolamento de DNA comercial projetado para extração do solo e, em seguida, prosseguir com isolamento de DNA usando o protocolo do kit fornecedor. Nota: Para algumas amostras de raiz, pode haver uma alta concentração de orgânicos, permanecendo na pelota do ADN, que impede a amplificação do DNA durante a PCR, especialmente quando um protocolo de extração de DNA diferente (ex., extração CTAB) é usado. Se necessário, limpe o DNA, seguindo as instruções fornecidas no kit de limpeza ambiental do DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir a concentração de todas as amostras de DNA usando um dados de bancada de alta sensibilidade.<ol>
<li>Adicione 1 a 20 µ l de cada amostra de DNA eluted em tubos fornecidos no kit de ensaio de alta sensibilidade de dsDNA. Adicione a solução de trabalho de dados (tintura: tampão de 1: 200) até 200 µ l.</li>
		<li>Prepare dois tubos adicionais contendo 10 µ l de DNA (0 em ng / µ l DNA) o padrão 1 ou 10 µ l de 2 padrão (100 ng / µ l) e adicionar 190 µ l da solução de trabalho de dados para cada norma.</li>
		<li>Medir a concentração das normas e cada amostra. Se não for feito automaticamente, calcule a concentração de DNA na saída de absorvância por uma regressão linear das duas normas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Biblioteca de amplicons preparação e submissão
<ol><li>Conjunto de materiais para a reação de amplificação.<ol>
<li>Descongelar as amostras de DNA em 4 ° C e mantê-los no gelo em toda a etapa 3. Randomize a ordem das amostras de DNA para minimizar o viés devido à localização na placa do PCR (tabela 2).</li>
		<li>Em um prato PCR de 96 poços, dilua DNA de cada amostra em água molecular-classe a 5 ng / µ l em um volume total de 20 µ l. Adicionar 20 µ l de água molecular grau aos poços quatro canto como controles negativos para amplificação (vazias) (tabela 2).</li>
		<li>Organize os primers de código de barras (10 µM) em cadeia da polimerase tira ou uma placa de 96 poços, tais que podem ser adicionados com uma pipeta multicanal (Figura 2).</li>
		<li>Prepare a mistura de mestre PCR suficiente para amplificar cada amostra de DNA em triplicado. Prepare-se 1,5 µ l de BSA (20 mg/mL), 37,5 µ l de pre-feitos 2x mestre mix (composto de tampão PCR, MgCl2, dNTPs e Taq DNA polimerase), 0.57 µ l de cloroplasto PNA (100 µM), 0.57 µ l de PNA mitocondrial (100 µM) e 25.86 µ l de água molecular da classe.</li>
		<li>Deite a mistura de mestre para um estéril 25 mL de reservatório de pipeta multicanal e distribuir 66 µ l do mix mestre em cada poço de uma nova placa PCR de 96 poços, com uma pipeta multicanal. Nota: Quando calcular volumes de reagente para a mistura de mestre, certifique-se de incluir também os 4 poços em branco por placa.</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, adicione 6 µ l de 5 ng / µ l ADN (a partir da placa de DNA normalizada) para a placa de mistura de mestre. Em seguida, adicione ao µ l placa mestra 1.5 de primer para a frente de 10 µM, tal que cada coluna tem um código de barras para a frente diferente e 1,5 µ l de 10 µM reverter a primeira demão, tal que cada linha tem um código de barras reverso diferente (Figura 2). Nota: Antes da adição de cartilhas, as placas randomizadas e mestre mistura poderiam ser usados para amplificar os genes de fungos ITS ou ITS2 se diferentes iniciadores foram adicionados. Se este for o caso, um projeto da primeira demão semelhante pode ser usado.</li>
		<li>Spin-down a placa brevemente no 3.000 g. x Use uma pipeta multicanal para misturar suavemente e, em seguida, dividir em três placas com 25 µ l de mistura reacional. Nota: Apesar de três repetições não são estritamente necessárias, diminui o impacto da variabilidade técnica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplificar o DNA em cada placa usando um thermocycler definido para as seguintes condições: 180 s a 98 ° C, 30 ciclos de: 98 ° C por 45 s (desnaturação), 78 ° C, durante 10 s (PNA recozimento), a 55 ° C por 60 s (recozimento da primeira demão) e 72 ° C por 90 s (extensão) , então 600 s a 72 ° C, seguido por um 4 ° C segurar o passo. Após a amplificação, juntar as três placas de replicar em uma única placa de 96 poços.</li>
	<li>Quantificar o DNA usando reagentes de alta sensibilidade de dados em um leitor de placa de 96 poços.<ol>
<li>Adicione 2 µ l de cada produto do PCR para uma microplaca de 96 poços, juntamente com 98 µ l da solução de trabalho de dados (tintura: tampão de 1: 200). Inclui 4 poços como padrões: 5 µ l de DNA 1 padrão (0 ng / µ l DNA), 1 µ l de padrão 2 (10 ng / µ l), 2 µ l de padrão 2 (20 ng / µ l) e 5 µ l de padrão 2 (50 ng / µ l). Em seguida, adicione solução de trabalho de dados para um volume final de 100 µ l. Nota: Cada amostra pode ser medida usando um bancada de dados, conforme descrito na etapa 2.3 se um leitor não está disponível.</li>
		<li>Calcule a concentração de DNA na saída de absorvância por uma regressão linear dos quatro padrões.</li>
		<li>Para o código de barras com sucesso amplificado produtos (aqueles que têm uma concentração maior que 15 ng / µ l), piscina 100 ng de cada amostra em um tubo único 1,5 mL (tabela 2).</li>
		<li>Calcule o volume médio de amostras adicionado ao pool usando a função =AVERAGE() em um programa de planilha. Adicione o volume dos produtos do PCR "em branco" para as amostras em pool. Nota: Desde que os produtos PCR "em branco" têm suas próprias combinações de código de barras único, eles podem ser sequenciados para verificar se há quaisquer contaminantes de laboratório.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir a concentração do produto em pool usando um bancada de dados conforme descrito no passo 2.3 e tomar 600 ng de DNA e diluir em água molecular grau até um volume final de 100 µ l em um tubo de 1,5 mL. Armazenar o produto em pool restante a-20 ° C.</li>
	<li>Lave a 600 ng DNA alíquota, seguindo o processo de purificação do PCR estabelecido com grânulos de purificação paramagnética em um formato de 96 poços, com algumas exceções.<ol>
<li>Fazer um fresco µ l 600 alíquota de etanol a 70%. Agite bem o frasco de grânulos magnéticos para re-suspender contas que resolver até o fundo.</li>
		<li>Adicione 1 volume x (100 µ l) da solução de grânulo de alíquota 600 ng de DNA. Misture bem, pipetando 10 vezes. Incube durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Coloque o tubo sobre o carrinho magnético por 2 min (ou até solução é clara) para separar os grânulos de solução. Enquanto o tubo é ainda no suporte magnético, aspirar o sobrenadante claro, cuidadosamente, sem tocar as esferas magnéticas e descartar o sobrenadante claro. Nota: neste ponto, os amplicon produtos são obrigados às esferas magnéticas. Quaisquer contas que são perturbada ou perdida durante a aspiração resultará em perda de DNA.</li>
		<li>Deixar o tubo no suporte magnético e adicionar 300 µ l de etanol 70% para o tubo; incube a temperatura ambiente por 30 s. Aspire o etanol e o descarte. Repita este processo e remover todos os etanol após a segunda lavagem. Retire o tubo do suporte magnético e o ar seco por 5 min.</li>
		<li>Adicionar 30 µ l de água molecular grau para os grânulos secos e misture pipetando 10 vezes. Incube a temperatura ambiente por 2 min. o tubo de retorno para o suporte magnético para 1 min para separar as contas da solução. Transfira o eluato para um tubo novo. Nota: Grânulos magnéticos não afetará as reações a jusante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir a concentração final de limpos, DNA agrupado usando um bancada de dados, conforme descrito na etapa 2.3. Diluir uma alíquota de 10 nM em um volume final de 30 µ l, ou para a concentração e volume preferido pela facilidade de sequenciamento.</li>
	<li>Utilize os serviços de uma instalação de sequenciamento para sequenciar o DNA em uma plataforma NGS, 2 x 300 sequenciamento de bp emparelhado-final.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo demonstra um pipeline estabelecido para explorar a raiz endosphere, rizosfera e composições de comunidade microbiana do solo, de amostragem de campo de processamento de amostra e sequenciamento a jusante. Estou estudando microbiomes associada a raiz apresenta desafios únicos, devido em parte às dificuldades inerentes em amostragem do solo. Os solos são altamente variável em termos de propriedades físicas e químicas, e as condições do solo diferentes podem ser separadas por tão pouco quanto alguns milímetro...

Microbiomes planta-associado consistem em comunidades microbianas dinâmicas e complexas, compostas de archaea, bactérias, vírus, fungos e outros microorganismos eucarióticos. Além de seu papel bem estudado em causar doença de planta, planta associada micróbios também positivamente podem influenciar fitossanidade, melhorando a tolerância a estresses bióticos e abióticos, promovendo a disponibilidade de nutrientes e realçando o crescimento das plantas através de a produção de fitohormônios. Por esta razão, particular interesse existe em caracterizar os táxons que associam a planta raiz endospheres, rhizospheres e o solo circundante. Enquanto alguns micróbios podem ser cultivados em isolamento no laboratório de mídia gerado, muitos não podem, em parte porque eles podem confiar em relações simbióticas com outros micróbios, crescem muito lentamente, ou exigem condições que não podem ser replicadas em um ambiente de laboratório. Porque evita a necessidade de cultivo e é relativamente barato e de alta produtividade, baseada em sequência filogenética caracterização das amostras microbianas ambientais e associado anfitrião tornou-se um método preferido para análise do comunidade microbiana composição.
A seleção de tecnologias de sequenciamento apropriados fornecidos por vários próxima geração (NGS) plataformas1 de sequenciamento é dependente de necessidades dos usuários, com importantes fatores incluindo: cobertura desejada, comprimento de amplicons, espera-se comunidade diversidade, bem como taxa de erro, leia-comprimento e o custo-por-gerência/megabase de sequenciamento. Outra variável que precisa ser considerado em experimentos de sequenciamento baseado em amplicon é que gene vai ser amplificado e que as primeiras demão serão usadas. Quando projetando ou escolhendo as primeiras demão, pesquisadores muitas vezes são forçados a fazer compensações entre a universalidade da amplificação e a resolução taxonômica realizáveis dos amplicons resultante. Por esta razão, estes tipos de estudos muitas vezes escolheram primers e marcadores que alvejar seletivamente subconjuntos específicos da microbiome. Avaliando a composição das comunidades bacterianas é comumente realizado por sequenciamento de uma ou mais das regiões hipervariáveis do bacteriana 16S rRNA gene2,3. Neste estudo, descrevemos um amplicon baseado sequenciamento protocolo desenvolvido para uma plataforma NGS região alvos a 500 bp V3-V4 do gene bacteriano 16S rRNA, que permite ampla amplificação de táxons bacterianas, proporcionando também variabilidade suficiente para distingui entre diferentes táxons. Além disso, este protocolo pode ser facilmente adaptado para o uso com outros conjuntos de cartilha, tais como os alvos o marcador ITS2 de fungos ou a subunidade de rRNA 18S de eucariotas.
Enquanto outras abordagens tais como espingarda metagenômica, metatranscriptomics e sequenciamento de célula única, oferecem outras vantagens, incluindo genomas microbianas resolvidas e medida mais direta da função da Comunidade, estas técnicas são normalmente mais caro e computacionais do que os perfis filogenética descrevem aqui4. Além disso, realizando metagenomics espingarda e metatranscriptomics em amostras de raiz produz uma grande percentagem de leituras pertencentes ao genoma vegetal hospedeiro, e métodos para superar esta limitação ainda estão sendo desenvolvidos5,6.
Tal como acontece com qualquer plataforma experimental, criação de perfil baseada em amplicon pode introduzir um número de possíveis enviesamentos que devem ser considerados durante a análise de dados e projeto experimental. Estes incluem os métodos de coleta de amostra, DNA extração, seleção de primers PCR e como é realizada a preparação da biblioteca. Diferentes métodos podem significativamente afetar a quantidade de dados utilizáveis gerados e podem também prejudicar os esforços para comparar os resultados entre os estudos. Por exemplo, o método de remoção de bactérias rizosfera7 e a utilização de técnicas diferentes de extração ou escolha de extração de DNA a kits8,9 foram mostrados para impacto a jusante análise, que leva a conclusões diferentes sobre os quais os micróbios são presente e suas abundâncias relativas. Desde a criação de perfil baseada em amplicon pode ser personalizada, fazer comparações entre estudos pode ser um desafio. O projeto de Microbiome terra sugeriu que pesquisadores estudando sistemas complexos tais como a planta associada microbiome beneficiaria o desenvolvimento de protocolos padronizados como um meio de minimizar a variabilidade causada pela aplicação de diferentes métodos entre estudos10,11. Aqui, discutimos muitos dos tópicos acima e oferecer sugestões sobre as melhores práticas onde apropriado.
O protocolo demonstra o processo de coleta de solo rizosfera e amostras de raiz de Sorghum bicolor e extrair DNA usando uma bem-estabelecida kit isolamento de DNA11. Além disso, o nosso protocolo inclui um fluxo de trabalho sequenciamento detalhado amplicon, usando uma plataforma NGS comumente utilizada, para determinar a estrutura das comunidades bacterianas12,13,14. Este protocolo foi validado para o uso em uma ampla gama de hospedeiros de planta em um recente estudo publicado das raízes e rizosfera associado-solos de 18 espécies de plantas, incluindo Sorghum bicolor, Zea mays e Triticum aestivum15. Este método também foi validado para uso com outros genes marcadores, como demonstrado pela sua aplicação bem sucedida para estudar o gene marcador ITS2 fúngico em estudos do agave microbiome16,17 e microbiome morango 18.

<table><tbody><tr><td>0,1-10/20 e micro; L pontas de micropipeta filtradas</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>10 &micro; L pipeta multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>3122000027</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>10 &micro; L, 100 &micro; L e 1000 &micro; L micropipetas</td><td>Eppendorf</td><td>3120000909</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>100 &micro; L pipeta multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>1000 &micro; L pontas de micropipeta filtradas</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 2 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1620-2700</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Peneira de solo de 2 mm</td><td>Fornecedores florestais</td><td>60141009</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>200 &micro; L pontas de micropipeta filtradas</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Reservatórios de 25 mL VWR</td><td>International LLC</td><td>89094-664</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Frascos cônicos de 50 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Filtros de vácuo de 500 mL (0,2 &micro; tamanho dos poros m)</td><td>VWR International LLC</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas de 96 poços</td><td>USA Scientific</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Placas PCR de 96 poços</td><td>BioRad</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9933872</td><td>Instruções de uso: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf</td></tr><tr><td>Calçadão de folha de alumínio</td><td></td><td>7124</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Balança analítica com resolução de 0,001 g</td><td>Ohaus Pioneer</td><td>PA323</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Bioruptor Plus ultrassônico</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA) 20 mg/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5811000908</td><td>Incluindo adaptadores de balde de placa de 50mL e 96 poços</td></tr><tr><td>Luvas criogênicas</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z183490</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Kit DNeasy PowerClean (opcional)</td><td>Qiagen Inc.</td><td>12877-50</td><td>Anteriormente MoBio</td></tr><tr><td>DNeasy PowerSoil kit</td><td>Qiagen Inc.</td><td>12888-100</td><td>Anteriormente MoBio</td></tr><tr><td>Gelo seco</td><td>Qualquer</td><td></td> ímã NA <td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Não substitua o</td></tr><tr><td>etanol</td><td>VWR International LLC</td><td>89125-188</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Sacos de congelação do tamanho de um galão</td><td>Ziploc</td><td>NA</td><td>Pode substituir com equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas Gemini EM</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>EM</td><td>Pode usar outro fluorômetro que lê placas de 96 poços a partir do topo.</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Jaleco</td><td>Workrite</td><td>J1367</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Líquido N2</td><td>Qualquer</td><td>NA</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Líquido N2 dewar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4150-9000</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Sistema de purificação de água ultrapura Milli-Q</td><td>Minicentrífuga Millipore Sigma</td><td>SYNS0R0WW</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água de grau molecular</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4387937</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Argamassas</td><td>VWR International LLC</td><td>89038-150</td><td>Pode ser substituído por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Luvas de nitrilo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19167032B</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Toalhas de papel</td><td>VWR International LLC</td><td>BWK6212</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Película de vedação de placa PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9684493</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de tiras PCR</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td></td></tr><tr><td>Pilões</td><td>VWR International LLC</td><td>89038-166</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Espátulas de plástico</td><td>LevGo, Inc.</td><td>17211</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13000014</td><td></td></tr><tr><td>PNAs - cloroplasto e mitocondrial</td><td>PNA Bio</td><td>NA</td><td>Certifique-se de verificar a sequência bioinformaticamente</td></tr><tr><td>Óculos de proteção</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z759015</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS kit de ensaio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Martelo de borracha (opcional)</td> <td>Ace Hardware</td><td>2258622</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Tesouras ou tesouras</td><td>VWR International LLC</td><td>89259-936</td><td>Pode substituí-las por equivalentes de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Pá</td><td>Home Depot</td><td>2597400</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Coletor de núcleo de solo (pequeno diâmetro: < 1 polegada)</td> <td>Ben Meadows</td><td>221700</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Frascos de spray</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-395278</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Primers padrão com código de barras dessalinizados (10 &micro; M) (Tabela 1)</td> <td>IDT</td><td>NA</td><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo com dessalinização padrão. O adaptador NGS e o primer de sequenciamento (Tabela 1) são projetados para uso com o Illumina MiSeq usando química v3.</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E950040015</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Barcos de pesagem</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>B6001W</td><td>Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.</td></tr></tbody></table>

explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

A relação íntima entre a planta hospedeira e microorganismos associados é crucial para determinar a adequação de planta e pode promover maior tolerância a estresses abióticos e doenças. Como a planta microbiome pode ser altamente complexos e de baixo custo, métodos de alta produtividade como baseados em amplicon sequenciamento do gene 16S rRNA frequentemente são preferidos para caracterizar sua composição microbiana e diversidade. No entanto, a seleção de metodologia apropriada na condução de tais experiências é fundamental para reduzir preconceitos, o que podem dificultar a análise e comparações entre estudos e amostras. Este protocolo descreve detalhadamente uma metodologia padronizada para a coleta e a extração de DNA de rizosfera, solo e amostras de raiz. Além disso, podemos destacar um pipeline de sequenciamento de amplicons do rRNA 16S bem estabelecida que permite a exploração da composição das comunidades bacterianas nestas amostras e pode ser facilmente adaptados para outros genes marcadores. Esse pipeline foi validado para uma variedade de espécies de plantas, incluindo o sorgo, milho, trigo, morango e agave e pode ajudar a superar os problemas associados com a contaminação de organelas vegetais.

Executar o protocolo recomendado deve resultar em um conjunto de dados de leituras de emparelhado-final indexados que podem ser combinados para cada amostra e atribuído a qualquer um bacteriano unidades taxonômicas operacionais (OTU) ou sequência exata variante (ESV, também conhecido como amplicon variante de sequência (ASV) e sub-operational unidade taxonômica (sOTU)), dependendo de análise a jusante. A fim de obter dados de sequência de alta qualidade, deve ter-se cuidado em cada etapa ...

Aqui, descrevemos um protocolo para obter dados de sequência de amplicons da rizosfera, solo e raiz endosphere microbiomes. Esta informação pode ser usada para investigar a composição e diversidade de comunidades microbianas associadas a planta e é apropriada para o uso com uma ampla gama de espécies de plantas.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

O objetivo geral deste experimento é caracterizar três compartimentos do microbioma radicular, solo, rizosfera e endosfera radicular, usando o perfil da comunidade do gene do RNA ribossômico 16S. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em ecologia microbiana, como os fatores bióticos e abióticos que são os principais impulsionadores da estrutura do microbioma. A principal vantagem dessa técnica é que ela padroniza cada etapa, desde a separação da raiz e da rizosfera até a extração do DNA e a preparação de uma biblioteca de sequenciamento.Demonstrando este procedimento estará Tuesday Simmons, um estudante de pós-graduação no Laboratório Coleman-Derr. Para iniciar o protocolo, colete amostras de solo a granel com um coletor de núcleo de solo esterilizado com etanol para obter solo livre de raízes de plantas. Colete um núcleo de aproximadamente 23 a 30 centímetros da base da planta.Em seguida, transfira o solo para um saco plástico, homogeneize o solo sacudindo suavemente o saco, transfira uma alíquota de 600 miligramas da amostra de solo para um tubo de dois mililitros e coloque imediatamente o tubo de dois mililitros em gelo seco até a extração do DNA. Para coletar a ra

exploring-root-microbiome-extracting-bacterial-community-data-from

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

O objetivo do protocolo aqui apresentado é estudar a resposta de transcriptomic de endosphere-isolado de Bacillus mycoides exsudados de raiz de batata. Este método facilita a identificação de genes de bactérias importantes envolvidos em interações planta-micróbio e em princípio aplicável a outros fungos endofíticos e plantas, com pequenos ajustes.

Interação planta-micróbio: Resposta transcricional de Bacillus Mycoides exsudados de raiz de batata

Escavação de raízes de plantas do campo, bem como processamento de amostras em endosphere, rizosfera e solo são descritas em detalhes, incluindo os métodos de análise de dados e extração de DNA. Este papel é projetado para permitir que outros laboratórios de usar essas técnicas para o estudo do solo, endosphere e microbiomes da rizosfera.

Isolamento e análise de comunidades microbianas na rizosfera, solo e raízes em experiências de grama perene

Visualizar e medir raiz crescimento em situ são extremamente desafiador. Apresentamos um método rhizobox personalizável para controlar o desenvolvimento radicular e proliferação ao longo do tempo em resposta ao enriquecimento de nutrientes. Este método é usado para analisar diferenças genotípicas milho na plasticidade da raiz em resposta a uma fonte de nitrogênio orgânico.

Um protocolo otimizado de Rhizobox para visualizar o crescimento da raiz e receptividade aos nutrientes localizadas

Aqui nós descrevemos um ensaio hidropônico do crescimento de planta para quantificar a presença da espécie e para visualizar a distribuição espacial das bactérias durante a colonização inicial de raizes de planta e após sua transferência em ambientes diferentes do crescimento.

Monitoramento de colonização bacteriana e manutenção em raízes de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em um sistema hidropônico flutuante

A análise de rede foi aplicada para avaliar a associação de diversas comunidades microbianas ecológicas, como solo, água e rizosfera. Apresentado aqui é um protocolo sobre como usar o algoritmo WGCNA para analisar diferentes redes de co-ocorrência que podem ocorrer nas comunidades microbianas devido a diferentes ambientes ecológicos.

Divergência de Microbiota Raiz em Diferentes Habitats baseados em Redes de Correlação Ponderada

Os microcosmos de composto trazem a diversidade microbiana encontrada na natureza para o laboratório para facilitar a pesquisa do microbioma em Caenorhabditis elegans. Aqui são fornecidos protocolos para a criação de experimentos de microcosmos, com os experimentos demonstrando a capacidade de modular a diversidade microbiana ambiental para explorar as relações entre a diversidade microbiana ambiental e a composição do microbioma intestinal do verme.

Microcosmos de composto como ambientes microbianamente diversos e naturais para pesquisa de microbioma em Caenorhabditis elegans

Apresentamos um protocolo para um sistema experimental semihidropônico à base de vidro que suporta o crescimento de uma variedade de plantas filogeneticamente distintas com ou sem micróbios. O sistema é compatível com diferentes meios de crescimento e permite a amostragem não destrutiva de exsudato radicular para análise a jusante.

Um Sistema de Jarra de Vidro Versátil para Perfil de Exsudato de Raiz Semihidropônico

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho confiável e eficiente, desde a coleta de amostras até a análise de dados, para traçar o perfil dos microbiomas bacterianos endofíticos e epífitos presentes na casca de Populus trichocarpa.

Um fluxo de trabalho para a avaliação quantitativa dos microbiomas bacterianos endofíticos e epífitos da casca de Populus trichocarpa

Um procedimento rápido e padronizado para estabelecer comunidades sinérgicas de biofilmes multiespécies de vários solos da rizosfera é apresentado aqui. É um protocolo único projetado para sondar e simular a complexa microbiota do solo da rizosfera.

Uma abordagem para a construção de comunidades de biofilme multiespécies a partir do solo da rizosfera

Aqui, apresentamos um protocolo para nocautear um gene de interesse envolvido na conjugação de plasmídeos e, posteriormente, analisar o impacto de sua ausência usando ensaios de acasalamento. A função do gene é explorada para uma região específica de sua sequência usando deleção ou mutações pontuais.

Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

Aprenda a caracterizar o microbioma da raiz em diferentes compartimentos usando perfilamento da comunidade bacteriana do gene 16S rRNA. Este método padronizado permite analisar fatores bióticos e abióticos que influenciam a estrutura microbiana em plantas.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

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