Name: Trans-Plasma da membrana, transporte de elétrons por Myotubes de C2C12 de medição (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda a monitorar o transporte de elétrons transmembrana em miótubes C2C12 usando ensaios espectrofotométricos em tempo real. Este método avança pesquisas em biologia redox celular.

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Gostaríamos de agradecer seu apoio técnico Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino e Neej Patel. Este trabalho foi financiado pelo prêmio de serviço de saúde pública dos Estados Unidos R15DK102122 do Instituto Nacional de Diabetes e doenças do rim (NIDDK) e digestivo para Jonathan Fisher. O conteúdo do manuscrito é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIDDK ou o National Institutes of Health.

Nota: Consulte a Figura 1 para uma visão esquemática das principais etapas.
1. ensaio de redução WST-1
<ol><li>Crescem e se diferenciam células aderentes C2C12, usando de procedimentos de cultura de célula padrão7 em uma placa de 96 poços utilizando linhas A-F.<ol>
<li>Use um meio de diferenciação consistindo de modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 2% de soro de cavalo, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 mg/mL. Incube a 37 ° C com 5% CO2células.</li>
		<li>Ao monitorar o envolvimento de ascorbato em tPMET, suplemento meios de diferenciação com o ácido ascórbico 100 µM. Permitir que as células incubar em meios de diferenciação para ~ 24-48 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare as soluções WST-1 e PMS.<ol>
<li>Para fazer um estoque de 10 mM do WST-1, dissolver 0,033 g do WST-1 (fórmula peso (FW): 651.34 g/mol) em 5 mL de fosfato, tampão salino (PBS). Loja a 4 ° C.</li>
		<li>Para fazer um estoque de 5 mM do PMS, dissolver 0,0023 g de PMS (FW: 306.34 g/mol) em 1,5 mL de deionizada H2O (diH2O). Armazenar a-20 ° C e proteger da luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 0,0108 g de glicose para uma concentração final de 5 mM a 11,4 mL de PBS ou HEPES tampão salino (HBS; sal de sódio HEPES 20 mM, 140 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM de MgSO4, 1mm CaCl2). Adicione 480 µ l de 10mm WST-1 para uma concentração final de 400 µM e 48 µ l de 5mm PMS para uma concentração final de 20 µM.</li>
	<li>Ao monitorar o envolvimento de ascorbato em tPMET, divida a solução em duas alíquotas de 6 mL. Para uma alíquota, adicione 6 µ l de diH2O e para outra alíquota adicionar 6 µ l de 2 kU/mL para uma concentração final de 2 U/mL.</li>
	<li>Ao monitorar o envolvimento de superóxido em tPMET, divida a solução em duas alíquotas de 6 mL. Para uma alíquota, adicionar 55 µ l de tampão de4 de KPO 0,1 M e para a outra alíquota adicionar µ l 55 de 6,5 kU/mL SOD para uma concentração final de 60 U/mL.</li>
	<li>Lave as células com PBS. Aspirar a mídia e adicionar 150 µ l PBS. Em seguida, Aspire a PBS. Nota: O ensaio é feito com células chapeadas, anexadas. Assim, não há nenhum centrifugação ou o uso de tripsina no processo de lavagem.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de solução WST-1 (-) SOD ou (-) de colunas 1-6 e adicionar 100 µ l de solução WST-1 (+) SOD ou (+) de colunas 7-12 na placa de 96 poços. Usar linhas G e H, como controles de fundo (ou seja, para monitorar a mudança em absorvância no reagente sozinho em poços sem células).</li>
	<li>Medir os valores de absorvância utilizando o espectrofotômetro cada 10min por 1h em 438 nm.</li>
	<li>Após a leitura, aspirar a mídia e lave cada uma com 150 µ l de PBS. Em seguida, Aspire a PBS.</li>
	<li>Calcule a variação de absorvância para cada poço subtraindo-se a absorbância inicial para um poco de absorvância em qualquer ponto do tempo para aquele poço. Corrigi essa alteração para a mudança de absorbância (se houver) observada em poços de fundo (ou seja, poços com solução de ensaio, mas sem células).</li>
	<li>Para análise, normalizar os dados de absorbância para a medição de controle de 60 min ou lavar os poços com PBS ou HBS e então executar um ensaio de proteína bicinchoninic ácido (BCA).</li>
	<li>Adicionar o padrão de albumina de soro bovino (BSA) 2 mg/mL (variam de 0,5-2 µ l para a curva padrão, dependendo do grau de confluência das células) aos poços vazios (linhas G e H), em seguida, adicionar o reagente BCA a todos os poços.</li>
	<li>Quantificar os dados via nmol de redução WST-1 por µ g de proteína. Use 37 mM-1 cm-1 22 como o coeficiente de extinção para WST-1 reduzido a 438 nm.</li>
</ol>2. ensaio de redução DPIP
<ol><li>Crescem e se diferenciam células aderentes de C2C12 com o mesmo procedimento como passo 1.1.</li>
	<li>Prepare a solução DPIP de 10mm estoque como segue. Dissolver 0,029 g de DPIP (FW: 290.08 g/mol) em 10 mL de diH2Confirm O. a concentração de DPIP medindo a absorbância em 600 nm com um espectrofotômetro. Use 1 mM-1 cm-1 23 como o coeficiente de extinção para DPIP reduzido em 600 nm. Loja a 4 ° C.</li>
	<li>Adicione 0,0108 g de glicose a 11,880 mL de PBS para uma concentração final de 5 mM. Adicione 120 µ l de 10mm DPIP para uma concentração final de 100 µM.</li>
	<li>Ao monitorar o envolvimento de ascorbato em tPMET, divida a solução em duas alíquotas de 6 mL. Para uma alíquota, adicione 6 µ l de diH2O e para outra alíquota adicionar 6 µ l de 2 kU/mL para uma concentração final de 2 U/mL.</li>
	<li>Ao monitorar o envolvimento de superóxido em tPMET, divida a solução em duas alíquotas de 6 mL. Para uma alíquota, adicionar 55 µ l de tampão de4 de KPO 0,1 M e para a outra alíquota adicionar µ l 55 de 6,5 kU/mL SOD para uma concentração final de 60 U/mL.</li>
	<li>Aspirar a mídia e lavar as células em 150 µ l de PBS. Aspire a PBS e adicionar 100 µ l de solução DPIP (-) SOD ou (-) de colunas 1-6 e adicionar 100 µ l de solução DPIP (+) SOD ou (+) de colunas 7-12 na placa de 96 poços. Usar linhas G e H vontade como controles de fundo (ou seja, para monitorar a mudança em absorvância no reagente sozinho em poços sem células).</li>
	<li>Medir a absorvância a 600 nm utilizando espectrofotômetro cada 10 min para 1 h. quantificar a mudança de absorvância em relação ao controle em semelhante etapas 1.9-1.13 60 min.</li>
</ol>3. a determinação se os aceitadores de electrões reduzida são substratos para AO ou SOD
<ol><li>A 5,436 mL de PBS ou HBS, adicione 240 µ l de 10mm WST-1 para uma concentração final de 400 µM e 24 µ l de 5mm PMS para uma concentração final de 20 µM.<ol>
<li>Para DPIP, adicione 60 µ l de 10mm DPIP, para uma concentração final de 100 µM, a 5,940 mL de PBS ou HBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 100 µ l de solução para cada um bem em uma placa de 96 poços de fundo plano na ausência de células e medir a absorvância em espectrofotómetro a 438 nm, para WST-1, ou 600 nm, para DPIP.</li>
	<li>Adicione 1 µ l de ascorbato de 10mm a metade dos poços para uma concentração final de 100 μM. Monitore a absorvância até estabiliza.</li>
	<li>Após estabilização, adicionar 1 µ l de 200 U/mL para uma concentração final de 2 U/mL para cada poço ou adicionar 1 µ l de kU/6ml SOD para uma concentração final de 60 U/mL para cada bem e monitorar a absorvância por 1h.</li>
</ol>

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<li>Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+species+derived+from+the+family+of+NOX+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases.</a> Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Apresentamos dois métodos para a utilização de aceitadores de electrões extracelular, WST-1 e DPIP, em ensaios espectrofotométricos para monitorar tPMET em C2C12 myotubes. Com o crescimento de linhagens celulares em procedimentos padrão de cultura e um leitor de placa de espectrofotômetro, é possível monitorar tPMET com estes aceitadores de electrões em um ensaio de microplacas simples. WST-1 redução é reprodutível de para-bem dentro de um ensaio, mas não há variabilidade do dia a dia. O dia-a-coeficiente de variação (CV...

A visão de que a membrana plasmática tem uma capacidade inerente redox1levou a capacidade das membranas de plasma purificadas de reduzir aceitadores de electrões. Visto anteriormente em fungos, plantas e animais, o tPMET é um processo comum a vários organismos2,3,4,5. Especificamente, este processo tem sido demonstrado em Saccharomyces cerevisiae, cenoura células, hemácias, linfócitos, osteossarcoma, melanoma, macrófagos, músculo esquelético e neutrófilos2,3, 4 , 5 , 6 , 7. em um processo que transporta elétrons através da membrana de plasma para reduzir oxidantes extracelulares, tPMET está envolvido em muitas funções celulares, incluindo: célula crescimento5,8, de viabilidade celular9, ferro metabolismo10, sinalização11,12,13e proteção de1514,12,do espécies reactivas de oxigénio celular. Devido ao envolvimento do tPMET em muitas funções celulares, um desequilíbrio de tPMET tem sido hypothesized para contribuir para o desenvolvimento de algumas condições graves de saúde, incluindo câncer16, doença cardiovascular,17e metabólica Síndrome de18.
Existem várias maneiras de monitorar a transferência de electrões através da membrana de plasma, mas a técnica mais utilizada é avaliar a redução de aceitadores de electrões extracelular através de ensaios colorimétricos. Aceitadores de electrões extracelular comumente usados são sais de tetrazólio, DPIP, BECN e ferricytochrome c19,20. O sal de tetrazólio mais comumente usado é um conhecido sal da segunda geração como WST-119. Este composto é mais fácil de utilizar em ensaios colorimétricos comparados com sais de tetrazólio primeira geração devido a dois grupos sulfonato, que aumentam sua solubilidade de água21. WST-1, em conjunto com o methosulfate de 1-metoxi-Fenazina aceitador elétrons intermediários (mPMS), é reduzido em eventos de transferência de elétron dois. Esta redução altera a forma oxidada fraca-colorido do WST-1 para um mais intenso, amarelo formazan20,22. WST-1 possui um coeficiente de extinção molar elevada de 37 x 103 M-1cm-1, levando a um ensaio de alta sensibilidade21,22. DPIP é também utilizado como um aceitador do elétron extracelular para monitorar tPMET. Tem sido demonstrado que DPIP pode ser diminuído extracelularmente tPMET sem o auxílio de aceitadores de electrões intermediário23,24. Devido à falta de aceitadores de electrões intermediário, DPIP pode diretamente a pick-up os elétrons da membrana plasmática, ao contrário do WST-124. Semelhante a DPIP, BECN foi mostrado para ser diminuído extracelularmente para ferrocianeto de tPMET sem o auxílio de aceitadores de electrões intermediário19,24. Ao contrário do WST-1 e DPIP, BECN tem um coeficiente de extinção molar baixa, levando a uma baixa de sensibilidade de ensaio9. Outra aceitador de electrões extracelular comumente usados para monitorar tPMET é c ferricytochrome semelhante a WST-1, ferricytochrome c redução aumenta com o uso do aceptor de elétrons intermediários, mPMS22. Ao contrário do WST-1, o método de ferricytochrome c é menos sensível devido a um fundo elevado e um coeficiente de extinção molar baixa22.
Aqui nós apresentamos um método de análise em tempo real de tPMET através de ensaios espectrofotométricos. O método utilizado os aceitadores de electrões extracelular WST-1 e DPIP, que tenham um coeficiente de extinção molar alta enquanto ser menos caro em comparação com o outro comumente usado aceitadores de electrões extracelular como ferricytochrome c. Utilizamos o methosulfate Fenazina (PMS) em vez de mPMS têm uma composição química semelhante e PMS é muito menos dispendioso. mPMS fotoquimicamente estável que é uma característica importante para um kit comercial que tem uma vida útil longa. No entanto, fazemos PMS fresco para cada ensaio, por estabilidade não deve ser um problema. Também apresentamos um método para avaliar possíveis interações enzimáticas (ver Figura 1) entre o aceitador de electrões extracelular e enzimas que podem ser utilizadas para caracterizar ainda mais o processo de tPMET. Especificamente, as enzimas AO e SOD podem ser usado determinam qual parte do tPMET é devido ao transporte de ascorbato ou liberação de superóxido extracelular, dois métodos comuns para elétrons ser transportado através da membrana plasmática.

<table><tbody><tr><td>Coleção de Cultura C2C12</td><td>American Type Collection&nbsp;</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Plex complexo de soro animal</td><td>Gemini Bio-Products&nbsp;</td><td>100-602</td><td></td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>516106</td><td></td></tr><tr><td>soro de cavalo</td><td>Gibco Technologies</td><td>16050-130</td><td></td></tr> Solução <tr><td>salina tamponada com fosfato de Dulbecco</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de 15 cm</td><td>TPP</td><td>93150</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de 96 poços</td><td>TPP</td><td>92096</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-Iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-dissulfofenil)-2H-tetrazólio Sal de Sódio (WST-1)</td><td>Accela ChemBio&nbsp; Inc</td><td>SY016315</td><td></td></tr><tr><td>metossulfato de fenazina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>L-ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>ascorbato oxidase&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0157</td><td></td></tr><tr><td>superóxido dismutase&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>2,6-dicloroindofenol sal de sódio&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals</td><td>215011825</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES sal de sódio</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de potássio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potássio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP363</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Powerwave X-I espectrofotômetro</td><td>Biotek Instrumentos</td><td>descontinuados&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Spectronic Genesys 5</td><td>Thermo Scientific</td><td>336001</td><td></td></tr><tr><td>PureGrade microplaca de 96 poços, fundo F, transparente, não tratada, não estéril</td><td>MidSci</td><td>781602</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de ferro (II) tetrahidratado</td><td>Sigma</td><td>220299</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de ferro (II) heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>215422</td><td></td></tr><tr><td>hipoxantina</td><td>Sigma</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>xantina oxidase</td><td>Sigma</td><td>X4500</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/</td></tr> <tr><td>KC4</td><td>Biotek Instrumentos</td><td>descontinuados&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

trans-plasma da membrana, transporte de elétrons por myotubes de c2c12 de medição

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Transporte de elétrons da membrana trans-plasma (tPMET) desempenha um papel na proteção das células do stress redutivo intracelular, bem como a proteção contra danos por oxidantes extracelulares. Este processo de transporte de elétrons do redutores intracelulares para o extracelulares oxidantes não é bem definido. Aqui apresentamos os ensaios espectrofotométricos por C2C12 myotubes para monitorar tPMET utilizando os aceitadores de electrões extracelular: sal de tetrazólio solúvel em água-1 (WST-1) e 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP ou DCIP). Através da redução destes aceitadores de electrões, somos capazes de monitorar este processo em uma análise em tempo real. Com a adição de enzimas como ascorbato oxidase (AO) e superóxido dismutase (SOD) para os ensaios, podemos determinar qual parte do tPMET é devido à produção de exportação ou superóxido de ascorbato, respectivamente. Enquanto WST-1 foi mostrado para produzir resultados estáveis com baixo fundo, DPIP era capaz de ser re-oxidado após a adição do AO e SOD, que foi demonstrado com análise espectrofotométrica. Este método demonstra um ensaio espectrofotométrico em tempo real, multi bem, rápido, com vantagens sobre outros métodos usados para monitorar tPMET, tais como o ferricianeto (BECN) e redução de c ferricytochrome.

As estatísticas foram realizadas com ANOVA com medidas repetidas utilizando RStudio software estatístico25. Tamanhos de amostra são indicados nas lendas figura.
Para monitorar tPMET, C2C12 myotubes foram utilizados juntamente com aceitadores de electrões extracelular, WST-1 e DPIP. AO foi usado para determinar qual parte do WST-1 e redução de DPIP foi devido ao efluxo de ascorbato e SOD foi usada para det...

O objetivo do presente protocolo é espectrofotometricamente monitorar o transporte de elétrons da membrana trans-plasma utilizando aceitadores de electrões extracelular e analisar interações enzimáticas que podem ocorrer com estes aceitadores de electrões extracelular.

Trans-Plasma da membrana, transporte de elétrons por Myotubes de C2C12 de medição

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

O objetivo geral deste procedimento é monitorar o processo de transporte de elétrons da membrana transplasmática em tempo real por meio de ensaios espectrofotométricos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia radox sobre o mecanismo de transporte de elétrons da membrana transplasmática e como o ambiente redox de uma célula é mantido. A principal vantagem desta técnica é que o ensaio é um ensaio espectrofotométrico rápido, multipoços e em tempo real.Para começar, assente as células de adesão C2C-12 em duas vezes 10 elevado à 4ª células por centímetro quadrado nas fileiras A a F de uma placa de 96 poços e, em seguida, cubra as células com meio de crescimento. Incube as células em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas em cultura, aspirar os meios de crescimento, lavar com 150 microlitros de PBS, substituir por meio de diferenciação e incubar as células por mais 24 a 48 horas.Em seguida, prepare um estoque de soluções WST-1 e PMS. Faça uma solução estoque de 10 milimolares de WST-1 dissolvendo 033 gramas de WST-1 em cinco mililitros de PBS. Em seguida, vórtice a solução.Em seguida, prepare a solução estoque de PMS dissolvendo 0023 gramas de PMS em 1,5 mililitros de água ionizada. Vortex a solução. Para preparar a solução de trabalho, adicione glicose ao PBS para fazer 11,4 mililitros de uma solução de glicose de cinco milimolares.A esta solução, adicione 480 microlitros da solução-mãe WST-1 para uma concentração final de 400 micromolares WST-1 e 48 microlitros da solução-mãe PMS para uma concentração final de 20 micromolares PMS. Vortex as soluções para misturar. Em seguida, divida a solução em duas alíquotas de seis mililitros.Dependendo do ensaio, adicione os componentes relevantes descritos aqui. Com as soluções agora preparadas, aspirar os meios de diferenciação das células e lavá-los uma vez com 150 microlitros de PBS. Remova o PBS e adicione 100 microlitros da alíquota um nas colunas de um a seis.E adicione 100 microlitros da alíquota dois às colunas sete a 12 da placa de 96 poços. Coloque a placa de 96 poços em um leitor de placas e meça os valores de absorbância a cada 10 minutos por uma hora a 438 nanômetros. Após a leitura final, aspirar o meio e lavar cada poço com 150 microlitros de PBS.Em seguida, aspire o PBS. Para análise, calcule a mudança na absorbância para cada poço subtraindo a absorbância inicial do poço da absorbância em qualquer ponto de tempo posterior para o mesmo poço. Corrija essa alteração com base na mudança na absorbância observada nos poços de fundo.Uma vez corrigidos os antecedentes, normalizar os dados de absorbância para as medições de controlo de 60 minutos. Alternativamente, normalize pelo teor de proteína em cada poço usando um ensaio de proteína BCA padrão. Finalmente, quantifique os dados para obter a quantidade de redução de WST-1 por micrograma de proteína.Para iniciar o ensaio de redução DPIP, cultive e diferencie as células de adesão C2C-12, conforme mostrado para o ensaio de redução WST-1. Em seguida, prepare uma solução estoque contendo 10 milimolares DPIP dissolvendo 029 gramas de DPIP em 10 mililitros de água ionizada. Em seguida, vórtice a solução.Confirmar a concentração medindo a absorvância da solução a 600 nanómetros utilizando um espectrofotómetro. Para fazer a solução de trabalho, adicione 120 microlitros da solução estoque DPIP de 10 milimolares a 11,88 mililitros de uma solução de cinco milimolares de glicose e PBS para uma concentração final de trabalho DPIP de 100 micromolar. Em seguida, vórtice a solução.Em seguida, divida a solução em duas alíquotas de seis mililitros. Dependendo do ensaio, adicione os componentes relevantes descritos aqui. Com as soluções agora preparadas, aspirar os meios de diferenciação das células e lavá-los uma vez com 150 microlitros de PBS.Remova o PBS e adicione 100 microlitros da alíquota um nas colunas de um a seis e 100 microlitros da alíquota dois nas colunas sete a 12 da placa de 96 poços. Coloque a placa de 96 poços em um leitor de placas e meça os valores de absorbância a cada 10 minutos por uma hora a 600 nanômetros e analise os valores resultantes conforme descrito na análise do ensaio de redução WST-1. Para começar, prepare duas soluções.Primeiro, prepare seis mililitros de 400 micromolares WST-1 e 20 micromolares PMS em PBS. Em seguida, prepare seis mililitros de uma solução micromolar de 100 DPIP e PBS. Prepare a primeira placa de 96 poços adicionando 100 microlitros de uma solução WST-1 / PMS às linhas A a D em uma placa de fundo plano na ausência de células e meça a absorbância em um espectrofotômetro a 438 nanômetros.Em seguida, prepare uma segunda placa de 96 poços adicionando 100 microlitros da solução DPIP às linhas A a D em uma placa de fundo plano na ausência de células e meça a absorbância no espectrofotômetro a 600 nanômetros. Em seguida, adicione um microlitro de ascorbato de 10 milimolares à metade dos poços para uma concentração final de 100 micromolares. Monitore a absorbância na placa até que ela se estabilize.Depois disso, repita com DPIP. Após a estabilização, determine se os aceptores de elétrons produzidos são substratos. Para a ascorbato oxidase para superóxido dismuta, adicionando ascorbato oxidase ou superóxido dismutado a cada poço e monitorando a mudança de absorbância por uma hora.Para monitorar o transporte de elétrons da membrana transplasmática, a ascorbato oxidase foi usada para bloquear os efeitos da redução mediada por ascorbato e a superóxido dismutase foi usada para bloquear a redução mediada por superóxido para determinar qual parte da redução WST-1 era devida a cada componente. Com a adição de ascorbato oxidase, a redução de WST-1 foi suprimida em cerca de 30%, indicando que cerca de 30% do transporte de elétrons da membrana transplasmática foi devido à exportação de ascorbato. Com a adição de superóxido dismutase, a redução de WST-1 foi suprimida em cerca de 70%, indicando que cerca de 70% do transporte de elétrons da membrana transplasmática foi devido à liberação de superóxido extracelular.Para determinar se a DPIP reduzida é um substrato para ascorbato oxidase ou superóxido dismutase, os níveis de DPIP foram reduzidos com ácido ascórbico. Após 20 minutos, a ascorbato oxidase foi adicionada e a absorbância foi monitorada. A recuperação mostra que a DPIP reduzida é um substrato para a ascorbato oxidase.Quando a superóxido dismutase foi adicionada, a DPIP também foi reoxidada, embora a uma taxa mais lenta; portanto, o DPIP reduzido é um substrato para essas enzimas e não um aceptor de elétrons extracelular apropriado para ser utilizado com essas enzimas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em duas horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fazer todos os reagentes frescos todos os dias.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia redox explorarem o transporte de elétrons da membrana transplasmática em uma variedade de tipos de células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir o transporte de elétrons da membrana transplasmática utilizando aceptores de elétrons extracelulares, bem como determinar se o aceptor de elétrons pode ser um substrato para enzimas utilizadas no ensaio.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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