Isolamento de gânglios das raízes dorsais e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores

Culturas primárias do (DRG) os gânglios das raízes dorsais são frequentemente usadas para estudar as funções fisiológicas ou eventos relacionados à patologia em neurônios sensoriais. Aqui, vamos mostrar o uso de culturas DRG lombares para detectar a liberação de neurotransmissores, depois neuropeptídio FF receptor tipo 2 estimulação com um agonista seletivo.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da pesquisa sensorial, como nocicepção periférica. A principal vantagem desse técnico é que investigar o mecanismo celular dos neurônios sensoriais com o modelo que mais simula a condição fisiológica. Pegue o gânglio dorsal lombar do tronco de um rato de duas a três semanas.

Comece fazendo dois cortes ao longo dos lados da coluna vertebral e um corte lateral para marcar a extensão rostral da coluna lombar. Em seguida, use fórceps de corte ósseo para remover os músculos dorsais da coluna. Em seguida, remova a porção dorsal das vértebras e exponha a medula espinhal.

Em seguida, use uma tesoura de dissecção e fórceps para remover a medula espinhal. Identifique o DRG lombar contando vértebras da última costela. Este diagrama mostra as posições das vértebras.

Use micro tesoura para coletar o DRG lombar bilateral de L1 a L6. Remova quaisquer fibras neuronais ligadas para melhorar a pureza da cultura. Transfira cada DRG lombar para um prato de cultura de 35 milímetros contendo dois mililitros de meio sem soro frio. Transfira o prato de 35 milímetros contendo DRG em um capô laminar e lave o DRG com meio livre de soro três vezes por pipeta.

Use pinças estéreis para mover os DRGs para um novo prato de cultura de 35 milímetros contendo dois mililitros de colagem estéril tipo 1A. Coloque o tecido na solução de colagemnase na incubadora de cultura tecidual Celsius de 37 graus por 30 minutos para iniciar a dissociação das células. Após a incubação, remova a solução de colagem e lave o DRG três vezes em dois mililitros da solução de sal balanceada da Hank.

Em seguida, adicione dois mililitros de edta de 0,05% de tripca pré-equipado ao prato, e digerir o DRG na incubadora por 30 minutos como antes. Após a digestão, use uma pipeta de vidro para transferir os dois mililitros da solução contendo DRG para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. O DRG pode grudar na pipeta de vidro, de modo que este passo deve ser realizado com cuidado.

A perda real pode ser evitada mantendo a solução contendo DRG na extremidade mais afunilada da pipeta de vidro, e transferindo a solução para o tubo centrífuga lentamente, mas sem pausa. Em seguida, centrifugar a solução a 290 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o supernasce e adicione mais dois mililitros de meio livre de soro para resuspensar o DRG.

Repita a lavagem duas vezes, usando dois mililitros de meio de cultura pré-armado para resuspensar o tecido após a centrifugação final. Use a pipeta polida de chama estéril previamente preparada para triturar manualmente o DRG aproximadamente 60 vezes. Em seguida, remova uma placa revestida de poli-L-lysine de 24 poços contendo um mililitro de cultura por poço da incubadora de CO2.

Aspire o meio de cultura incubada do prato. Semeou as células DRG de um rato em quatro dos poços. Isso dá uma densidade de semeadura de aproximadamente 500.000 células por poço.

No dia seguinte, substitua o meio de cultura por meio suplementado por 10 micromolar AraC, e 100 nanogramas por mililitro NGF. No terceiro dia após o revestimento da célula, mude o médio para 0,5 mililitros de meio sem soro pré-armado e incubar por uma hora. Durante a incubação, adicione 50 mililitros de siRNA em um microlitr de água livre de RNase a 12,5 microliters de meio livre de soro por transfecção.

Em seguida, pipeta 2,5 microliters de reagente transfecção em 10 microliters de meio livre de soro para cada transfecção. Misture ambas as soluções por pipeta e incuba esta solução de transfecção mista por 10 minutos à temperatura ambiente. Após 10 minutos, adicione a solução de transfecção nos poços da placa de 24 poços contendo DRG e misture tremendo suavemente.

Após uma incubação de seis horas, adicione 0,5 mililitros de meio de cultura com 20% FBS, 10 AraC micromolares e 100 nanogramas por mililitro NGF em cada poço de células. Por fim, incubar o DRG em uma incubadora de CO2 de 37 graus Celsius por mais 66 horas. No sexto dia após o revestimento, e 72 horas após a transfecção do siRNA, mude o meio de cultura para 200 microliters de meio livre de soro.

Após uma incubação de 30 minutos, adicione um microliter do produto químico de estimulação e misture suavemente por pipetação. O agonista NPFFR2, dNPA e o veículo correspondente são usados aqui. Depois de incubar pelo período necessário, colete o meio de cultura do prato de cultura, e centrífuga a 5000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para remover quaisquer impurezas suspensas.

Recolher o supernacido da centrifugação e diluir com soro fisiológico tamponado com fosfato, conforme necessário. Teste os níveis de neurotransmissores com kits de imunoensaio de enzimas disponíveis comercialmente. No primeiro dia, o corpo celular de um único neurônio indicado pela seta foi anexado na parte inferior de um prato.

Uma célula gliais indicada por uma ponta de flecha também está presente. As células gliais duplicaram e estenderam processos para cercar o corpo celular do neurônio sensorial no segundo dia, processo que foi ainda mais proeminente no terceiro dia. Em outra cultura, a proteína CGRP foi manchada para revelar a forma dos neurônios.

A coloração da proteína CGRP aparece no citoplasma e axônios dos neurônios sensoriais. As morfologias nucleares de neurônios e células gliais são distintas quando manchadas com DAPI. Os neurônios têm um núcleo maior e mais arredondado do que as células gliais.

Em comparação, os núcleos do glial são mais ovais em forma. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas e meia se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar e cultivar o gânglio raiz dorsal, e usá-lo como uma ferramenta para investigar funções fisiológicas subjacentes.

Não se esqueça que trabalhar com células primárias pode ser muito mais difícil do que trabalhar com linhas celulares regulares, e ser gentil é sempre a melhor maneira de realizar esses procedimentos.