Name: Fina película composta de silício elastômeros para aplicações de pele e cultura de pilha: fabricação e caracterização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda a fabricar e caracterizar filmes finos poliméricos de PDMS para cultura celular e adesivos de pele. Este método simples permite produção em larga escala com alta precisão e avaliação de propriedades de adesão.

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Martin Danner é reconhecida por sua assistência na preparação de amostras e estabelecimento de procedimentos de cultura de células. Os autores gostaria de agradecer Biesterfeld Spezialchemie GmbH (Hamburgo, Alemanha), especialmente Robert Radsziwill para suporte contínuo e discussões. A pesquisa que conduz a estes resultados recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito acordo de subvenção do sétimo programa-quadro (FP/2007-2013) ERC n. da União Europeia, 340929.

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Os autores não têm nada para divulgar.

O projeto de estruturas compósitas permite que o simples ajuste de propriedades materiais, tais como o módulo de Young ou a espessura das amostras. O módulo de Young de PDMS pode ser efetivamente alterado em uma ampla gama por alterando a relação de mistura entre os dois componentes ou fabricação de misturas usando um elastômero de silicone diferentes30,31. Os métodos descritos não são limitados do PDMS usado no presente inquérito, mas especialmente o desempenho adesivo depende fortemente do tipo específico usado. Um passo crítico no âmbito do presente protocolo é o processo de fabricação dos filmes compostos (Figura 1). Foi demonstrado que a espessura dos filmes afeta significativamente o comportamento de adesão dos filmes em diferentes substratos, incluindo pele (Figura 5 e Figura 6). Além da espessura da película, tempo e temperatura durante o processo de cura afeta as propriedades do material32. Portanto, parâmetros como a espessura das camadas poliméricas precisam ser cuidadosamente adaptada e verificou.
Análise das propriedades adesivas dos filmes finos foi realizada com medições de adesão de força normal usando dois substratos de vidro com diferente rugosidade da superfície até Ra = 0.338 µm (Figura 3). Em geral, rugosidade impacta significativamente a adesão de superfícies, especialmente de materiais elásticos33,34. A rugosidade de vidro pode ser facilmente variada por moagem com lixa de tamanhos diferentes de aspereza, permitindo a fabricação de substratos exibindo mais elevados valores de rugosidade21. Além disso, outros materiais, por exemplo a resina epóxi pode ser usada para a produção de substratos15,35. Isso pode ser uma estratégia importante modificação do protocolo apresentado. Por exemplo, se exibindo diferentes energias de superfície livre de substratos são necessários ou específico topografias são necessárias. Aqui, puxe-fora o stress e o trabalho de separação dos filmes finos fabricados de PDMS e SSA foram analisados com uma configuração Custom-Built (dispositivo de medição de aderência macroscópica (MAD, Figura 4)). 36 o alinhamento óptico de substrato e do indenter é um passo crítico para a análise dos resultados da medição. Portanto, o ajuste do ângulo de inclinação precisa ser executada com o goniômetro, tão preciso quanto possível. Isto pode ser conseguido com uma precisão suficiente manualmente trazendo o substrato em contato com a superfície da película até um contato horizontal seja alcançado.
No protocolo atual o tempo de espera foi mantido constante em um segundo (Figura 5 e Figura 7). Especialmente para a investigação do desempenho de um filme elástico para uma superfície áspera substrato adesivo, uma extensão do tempo de preensão fornece informações adicionais. Por exemplo, um aumento no estresse puxe-fora com o aumento do tempo de espera tem sido relatado8. Além das medições realizadas no protocolo atual, outros métodos, por exemplo casca de testes podem ser executadas, permitindo uma investigação mais abrangente do desempenho de adesão37.
As propriedades adesivas de filmes compostos exibindo filme diferente espessuras do adesivo pele macia foram determinadas (Figura 7). Nossos resultados estão em consonância com os dados publicados, mostrando que uma diminuição de chumbo de espessura de filme para um aumento do stress pull-off como o confinamento, ou seja, a relação entre espessura diâmetro e filme de substrato, aumenta38,39 . Baseado nestes resultados e os dados descritos na Figura 7, podemos concluir que filmes compostos com uma espessura total de aproximadamente 100 µm (espessura da camada de SSA de aproximadamente 60 µm, aplicado a um filme PDMS com uma espessura de cerca de 40 µm) apresentam aderência favoráveis p roperties sobre superfícies ásperas.
Em seguida, foram realizados experimentos relacionados com a caracterização biológica em filmes compostos imaculadas e plasma tratados filmes compostos (Figura 8). Tratamento de plasma de elastômeros de silicone é uma técnica versátil, muitas vezes aplicada para aumentar as propriedades hidrófilas de superfícies e promover a ligação celular e celular espalhando40,,41. Silicones são bem conhecidos por sua baixa toxicidade e alta biostability, mas podem conter monómeros residuais ou catalisadores que possam influenciar os processos fisiológicos, levando também a citotoxicidade42,43. No conduzido experimentos observamos, inferior a 5% citotoxicidade usando liberação LDH como um indicador e um ensaio de exclusão Trypan azul. O protocolo apresentado, toda a população celular, incluindo agregados celulares desanexado forma que a superfície da terra foram analisada para análise de proliferação (Figura 9B). Uma modificação do protocolo poderia produzir resultados mais diferenciados. Para cada amostra, o sobrenadante contendo desanexados agregados celulares poderia ser transferido para um tubo de reação separada e não combinado com as células enzimaticamente removidas da superfície do polímero. Isso permitiria a avaliação exata das células ligado à superfície e eventualmente revelar uma determinação mais detalhada da influência dos polímeros sobre o processo de adesão celular. Além dos métodos de immunocytochemical aqui apresentados, as células podem ser colhidas para investigação com métodos immunoblot, permitindo uma avaliação quantitativa detalhada da expressão da proteína.
Em resumo, nós temos estabelecido condições de fabricação para a produção de filmes finos de composto elastoméricos para aplicações na pesquisa de cultura de células avançado. Além disso, estes filmes finos possuem alta adaptabilidade para aspereza, permitindo design sofisticado de adesivos de pele a pele.

Neste protocolo, são apresentados métodos detalhados para fabricação de filmes finos elastômero. A técnica de lâmina de doutor amplamente disponível tem sido usada para a produção de filmes finos compostos. A técnica de fabricação foi realizada em folhas de polyethylenterephtalate (PET), permitindo a produção subsequente desses filmes em grande escala. A ênfase do presente protocolo é a avaliação da reprodutibilidade, precisa de fabricação as diferentes camadas de filmes de compostos e determinação das propriedades biológicas e aderência do patch do composto final. O poly-(dimethylsiloxane) de elastômero de silicone (PDMS) é usado extensivamente em tecnologia biomédica, incluindo a produção de adesivos de pele, aplicações de microfluídica e pesquisa adicional campos1,2,3 ,4. Recentemente, outra subclasse de PDMS, chamados adesivos de pele macia (SSAs) foram introduzidas, em especial para a pele delicada de ligação e de ligação.
SSAs do silicone são elastômeros de vinil acrescido, diferindo de polímeros análogos pela ausência de sílica5de reforço. Semelhante a do outros PDMS, SSA módulo de Young pode ser adaptado em uma ampla gama por modulação cross-linker concentração ou cura tempo6,7,8. Essa alteração no módulo de Young de elastómeros de silicone afeta as propriedades adesivas do material significativamente e tem também consequências profundas em células procarióticas e eucarióticas cultivadas na superfície9,10 , 11. a nível biológico celular, foi demonstrado, que células eucarióticas respondem ao nível de transdução de sinal para uma modulação da elasticidade a matriz ou a espessura da superfície9,10,12 ,13,14. Portanto, existe um amplo interesse em aplicações de cultura de células de polímeros com propriedades mecânicas ajustáveis. Importante, a energia de superfície intrinsecamente baixa de elastómeros de silicone com base não oferece condições ideais para cultura celular de células eucarióticas. Tratamento de plasma de oxigênio é uma técnica amplamente utilizada para aumentar o PDMS baixa energia de superfície temporariamente, levando a um aumento de sua resistência pull-off, diminuição da superfície adsorção das moléculas, enquanto paralelamente promover a penhora, espalhando e proliferação de células eucarióticas15,16,17,18.
Além das propriedades de materiais, a topografia da superfície afeta significativamente a adesão celular e a adesiva interação entre dois materiais19,20,21,22. Rugosidade da superfície tem vários efeitos sobre a formação de contato entre duas superfícies: redução da área de contato, alta armazenado energia elástica em torno de asperezas, bem como influência a propagação de rachadura pode alterar a força adesiva23, 24. Adesão de películas autocolantes a pele humana é um campo emergente de aplicativo, por exemplo, curativos, fixação de eletrodos de ECG ou outros dispositivos electrónicos wearable25,26,27, 28. Para medir o desempenho adesivo de autoadesivos em relação à topografia da superfície, substratos de vidro com diferentes graus de aspereza podem ser usados em medições de aderência normal8,21. Aqui, foram selecionados dois substratos de vidro para investigar as propriedades adesivas de filmes de polímero. Filmes de primeiras, compostos com uma camada de revestimento protetor de PDMS na proporção de mistura de partes de peso de 10 para 1 cobertas por PDMS com relação de mistura diferente foram caracterizados. Em um segundo passo uma camada adesiva de SSA foi preparada com quantidades de peso igual de ambos os componentes e com diferentes espessura de película em cima de um filme PDMS apoio.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol, 97%</td> <td>Stockmeier Chemie</td><td>1000452610000</td><td>Isopropanol</td></tr><tr><td>Almofada de mão diamnod abrasiva</td><td>Bohle</td><td>MO 5007522</td><td>Grão: 220</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Capricorn Scientific</td><td>ACC-1B</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Fraktion V</td><td>Roth</td><td>0163.2</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A12379</td><td>altamente tóxico</td></tr><tr><td>Aquamount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td>meio de montagem solúvel em água</td></tr><tr><td>CytoTox-ONE Ensaio de Integridade de Membrana Homogênea</td><td>Promega</td><td>G7890</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sem Ca2+, Mg2+</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovino serum gold</td><td>GE Health Care Life Science</td><td>A15-151</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Goniômetro OCA35</td><td>Dataphysics</td><td></td><td>para a determinação do ângulo de contato estático com a água</td></tr><tr><td>Corante Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1155-100MG</td><td>bisBenzimida H 33342 tricloridrato, altamente tóxico</td></tr><tr><td>Microscópio Axiovert 25</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscópio usado para documentação de cultura de células</td></tr><tr><td>Microscópio Eclipse LV100ND</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscópio usado para determinação da espessura</td></tr><tr><td>do filme Paraformaldeído, solução aquosa 16%</td> <td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>RT 15710</td><td>microscopia eletrônica grau</td></tr><tr><td>penicilina e solução de estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Phenom XL Microscópio Eletrônico de Varredura (SEM)</td> <td>Phenom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli- (álcool vinílico) 4-88, MW 31000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381-1KG</td><td>Mowiol 4-88</td></tr><tr><td>Poli-dimetil siloxanos, Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>(400)000108351397</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>RPMI 1640 meio basal</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>adesivo para pele macia (SSA)</td><td>Dow Corning</td><td>(400)000108251792</td><td>MG 7-9800 Adesivo para pele macia (SSA)</td></tr><tr><td>misturador de velocidade DAC 600.2 VAC-P</td><td>Hauschild</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stylus profilomter</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Modelo: SURFCOM 1500SD3</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M200 pro</td><td>Leitor de placas de fluorescência</td><td>Tecan</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Calbiochem</td><td>648466</td><td></td></tr><tr><td>solução Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>solução de</td></tr><tr><td>tripsina/EDTA</td> altamente tóxica <td>PAN-Biotech</td><td>P10-023500</td><td>0,05% de tripsina, 0,02% de EDTA em PBS</td></tr><tr><td>Cola UV</td><td>Bohle</td><td>BO MV76002</td><td>viscosidade média</td></tr></tbody></table>

fina película composta de silício elastômeros para aplicações de pele e cultura de pilha: fabricação e caracterização

Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

Neste protocolo, apresentamos métodos para fabricar filmes composto de elastômero fino para aplicações de cultura celular avançado e para o desenvolvimento de adesivos de pele. Dois-(dimethyl siloxanes) diferentes poli (PDMS e adesivo de pele macia (SSA)), têm sido utilizados numa investigação de profundidade de efeitos biológicos e características adesivas. Os filmes compostos consistem de uma camada de revestimento protetor flexível e um revestimento adesivo superior. Ambas as camadas foram fabricadas pela técnica de aplicação de lâmina de doutor. No presente inquérito, o comportamento adesivo dos filmes compostos foi investigado como uma função da espessura da camada ou uma variação do módulo de Young de camada superior. O módulo de Young de PDMS foi alterado, variando a base para a relação de mistura crosslinker. Além disso, a espessura dos filmes de SSA tem variada de aproximadamente 16 µm para aproximadamente 320 µm. Scanning microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia óptica foram usados para as medições de espessura. As propriedades adesivas de filmes de elastômero dependem fortemente a espessura da película, o módulo de Young dos polímeros e características de superfície. Portanto, foi investigada aderência normal desses filmes em substratos de vidro exibindo superfícies lisas e ásperas. Puxe-fora o stress e o trabalho de separação dependem da relação de mistura de elastômeros de silicone.
Além disso, a espessura de pele macia adesivo colocado no topo de uma camada de apoio solidário tem sido variada para produzir patches para aplicações de pele. Citotoxicidade, a proliferação e a adesão celular de fibroblastos de murino L929 em filmes PDMS (relação 10:1 de mistura) e SSA (mistura proporção 50: 50) foram realizados. Nós temos mostrado aqui, pela primeira vez, a comparação lado a lado de filmes finos de compósitos fabricados de ambos os polímeros e apresentar a investigação das suas propriedades biológicas - e adesivo.

É apresentado um protocolo para o processo de fabricação de estruturas de compósitos poliméricos de película fina possuindo Young diferente módulos ou espessuras. Filmes são produzidos para estudos de cultura celular avançado ou como adesivos de pele.

Fina película composta de silício elastômeros para aplicações de pele e cultura de pilha: fabricação e caracterização

In this protocol, we present methods to fabricate thin elastomer composite films for advanced cell culture applications and for the development of skin ...

O objetivo geral deste procedimento é fabricar e caracterizar estruturas compostas poliméricas de filme fino para estudos avançados de cultura de células ou como adesivos de pele. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como os compósitos elastoméricos podem ser usados para obter uma ação de aderência ideal, mesmo em superfícies irregulares. As principais vantagens dessas técnicas são que elas são simples e universalmente aplicáveis.Isso permite a fabricação em larga escala com uma precisão muito alta. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, porque as medições de adesão requerem treinamento e prática intensivos para atingir a precisão necessária. Demonstrando os procedimentos de cultura de células e aplicação de plasma estará Angela Rutz, técnica de nosso laboratório.Para preparar o PDMS, misture e desgaseifique 1,1 gramas da mistura de pré-polímero em um misturador de velocidade a 2350 RPM sob vácuo por três minutos. Para preparar a camada de suporte PDMS, use uma máquina de aplicação de lâmina raspadora controlada automaticamente. Coloque a lâmina raspadora em cima de um pedaço de folha de PET 100% limpo com isopropanol e use os parafusos de microposicionamento para ajustar a espessura da camada de suporte.Coloque o PDMS em uma seringa de 10 mililitros de uso único. Encha o reservatório da lâmina raspadora com o polímero e inicie o movimento da lâmina com uma velocidade de aproximadamente 2 milímetros por segundo. Quando o pedaço de filme PET tiver sido revestido, transfira o filme para um forno a 95 graus Celsius por uma hora.Para preparar a camada superior do filme composto, use uma lâmina para remover tiras finas dos lados longos da camada de suporte. Para permitir que a lâmina raspadora seja deslizada sobre a folha de PET, aplique a segunda camada de PDMS conforme descrito anteriormente. Em seguida, coloque o papel alumínio no forno.Para preparar as amostras para medições de adesão, use uma lâmina de barbear para cortar os filmes da folha de PET em pedaços de área de quatro centímetros quadrados e use cola UV para prender os pedaços em uma lâmina de vidro. Ilumine as peças com luz UV por três minutos e monte a primeira amostra polimérica no porta-amostras. Use o goniômetro para ajustar o ângulo de inclinação, até que o substrato esteja em contato com o filme polimérico em um alinhamento completamente paralelo de ambas as superfícies, conforme visualizado pelas imagens da câmera.O alinhamento óptico do substrato com a amostra é altamente crítico para interpretar os resultados da medição. Portanto, o ajuste do ângulo de inclinação precisa ser realizado com a maior precisão possível usando o inclinômetro. Mova o substrato alinhado para a superfície do filme polimérico até que uma tensão de pré-carga de 13 mais ou menos cinco quilopascais seja alcançada e inicie o pacote de software programado personalizado escrito no LabView.Em seguida, defina os parâmetros de medição necessários para medir as propriedades de adesão de três amostras fabricadas independentes em seis locais diferentes em cada superfície do filme. Para preparar os filmes para microscopia óptica, use uma lâmina de barbear para cortar a amostra polimérica em pedaços de 0,25 centímetro quadrado e prenda os pedaços na borda de uma lâmina de vidro. Em seguida, coloque a lâmina na orientação vertical sob um microscópio vertical e meça a espessura da seção transversal do filme.Para preparar um experimento de cultura de células, primeiro use um bisturi para cortar pedaços de aproximadamente cinco por cinco milímetros da camada de suporte do PET e use uma pinça para transferir os pedaços para lamínulas de vidro individuais de 12 milímetros. Transfira as lamínulas para dentro da câmara de reação de um dispositivo de plasma e feche a tampa do dispositivo. Evacuar a câmara até atingir uma pressão de 1,6 vezes 10 elevado a menos um milibar e tratar as películas com plasma durante três minutos.Em seguida, ventile a câmara de reação e transfira as amostras para poços individuais de uma placa de 24 poços. Em seguida, lave uma cultura de células L929 70 a 80% confluentes com DPBS livre de cálcio e magnésio por 30 segundos em um gabinete de fluxo laminar. Seguido por uma incubação de cinco minutos com dois mililitros de uma solução proteolítica e colagenolítica apropriada a 37 graus Celsius e 5% de CO2.Quando as células se desprenderem, adicione oito mililitros de meio suplementado com soro e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, após a contagem, semeie 60.000 células por mililitro de meio por poço da placa de 24 poços contendo as amostras poliméricas e coloque a placa na incubadora de cultura de células por três dias antes da captura e fixação da imagem de contraste de fase. Dependendo da espessura do filme superior, observa-se uma diminuição na tensão de tração com o aumento da espessura do filme, independentemente da textura da superfície do substrato.O trabalho de separação, no entanto, é geralmente um pouco menor para superfícies de substrato ásperas em comparação com as lisas. Quando o mecanismo de descolamento é registrado, pouca cavitação é observada nos filmes mais finos, enquanto o aparecimento de rachaduras semelhantes a dedos é observável nos filmes mais espessos. Experimentos de cultura de células revelam que as células semeadas em polímeros imaculados exibem um comportamento de fixação e espalhamento celular deficiente, enquanto a monocamada confluente é observada para células cultivadas em superfícies tratadas com plasma.Em geral, os níveis de lactato desidrogagial são comparáveis para células cultivadas em ambos os materiais poliméricos, com menos de 5% de citotoxicidade. Uma vez dominada, a produção dos compósitos de filme polimérico pode ser concluída em aproximadamente três horas. Embora a análise subsequente com um teste de aderência normal exija treinamento, é uma ferramenta muito poderosa para investigar as propriedades adesivas dos filmes.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar filmes compósitos poliméricos finos e analisá-los com testes de adesão específicos e ferramentas biológicas celulares. Não se esqueça de que trabalhar com produtos químicos e materiais biológicos pode ser extremamente perigoso. Portanto, tome as devidas precauções, como seguir os procedimentos de segurança obrigatórios, usar equipamentos de proteção de segurança individual e manusear esses materiais em um gabinete de segurança.

thin-film-composite-silicon-elastomers-for-cell-culture-skin

Research

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Developmental Biology

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