Captação microdissection da malha Trabecular altamente pura de olhos de rato de laser para análise de expressão do Gene

O objetivo geral deste procedimento de microdissecção a laser é desenvolver um método robusto e reprodutível para o isolamento de uma malha trabecular altamente enriquecida de olhos de camundongos usando microscopia de captura a laser para subsequente isolamento de RNA e análise de expressão a jusante. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da oftalmologia, como quais são os genes importantes e as vias de sinalização que, quando mal regulados, podem levar a doenças oculares. A principal vantagem dessa técnica é que o RNA de alta qualidade da malha trabecular de olhos de camundongos pode ser isolado de forma reprodutível para análise de expressão gênica.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a microdissecção a laser é uma técnica poderosa que envolve várias etapas de solução de problemas em todo o protocolo. Comece este procedimento com a coleta ideal de tecido para microdissecção a laser, conforme descrito no protocolo de texto. Pulverize a solução de descontaminação RNase na escova, pinça, frascos de acoplamento e mandril de montagem.

Depois de limpar bem, enxágue o aparelho com água sem nuclease e seque. Limpe o criostato com 100% de etanol para evitar contaminação cruzada. Aperte uma pequena quantidade de O.C.T. no mandril de montagem, remova o bloco de tecido do molde e coloque cuidadosamente o bloco no mandril de montagem.

Assim que o bloco de tecido no mandril de montagem estiver congelado, insira no suporte da amostra do criostato. Em seguida, ajuste o criostato para cortar seções de oito mícrons e corte cuidadosamente o bloco OCT para alcançar a amostra de tecido. Assim que o tecido for observado, pare de seccionar.

Apare os blocos congelados por todos os lados usando uma lâmina de barbear limpa e deixe de três a quatro milímetros de O.C.T. ao redor do tecido para permitir o manuseio com o pincel. Corte através do olho, trabalhando rapidamente. Manchar a cada terceira seção inundando a lâmina com uma rápida coloração de H&E em uma etapa por 60 segundos.

Enxágue a seção com água da torneira e seque ao ar. Depois de limpar a seção com um agente de limpeza, monte a seção em uma lâmina de vidro carregada com uma lamínula, revise sob o microscópio. Continue seccionando até que a MT fique evidente nas seções manchadas.

Assim que a TM começar a aparecer, corte duas seções e monte-as em uma lâmina de vidro carregada para coloração de H & E de rotina para formar um mapa para corte com microdissecção de captura a laser. Após a primeira lâmina de mapa de H&E, corte e alinhe seis seções seriais de oito mícrons de espessura no criostato e monte-as simultaneamente na lâmina de membrana PET. Adira o tecido deslizando brevemente um polegar enluvado ao longo da parte de trás da membrana.

Após a montagem, coloque a lâmina de membrana PET imediatamente em uma caixa de lâminas em gelo seco. Continue a seccionar o olho. Após cada duas lâminas de membrana PET com seis seções cada, colete duas seções em uma lâmina de vidro carregada para criar outra lâmina de mapa para coloração H & E.

Continue seccionando aproximadamente 100 seções seriais de oito mícrons de espessura até que a TM não seja mais visível. Confirme a falta de TM manchando rapidamente uma seção em uma lâmina de vidro carregada. Depois de realizar a coloração da lâmina do mapa H&E conforme descrito no protocolo de texto, revise as lâminas H&E visualmente usando um microscópio.

Identifique os slides do mapa com TM claramente visíveis e acessíveis para corte. Use as lâminas de membrana PET entre essas lâminas de mapa para LCM. Remova a caixa deslizante contendo seções de tecido congeladas do freezer de -80 graus Celsius e coloque-a em gelo seco.

Processe os slides um de cada vez. Fixe as seções colocando a lâmina imediatamente em inibidores de RNase contendo etanol a 75% frio por 30 segundos. Mergulhe suavemente a lâmina em água livre de nuclease por 10 a 15 segundos para dissolver o OCT sem interferir nas seções de tecido.

Pipete cuidadosamente 300 microlitros de solução de acetato de violeta 1,5% de cresil diretamente nas seções e incube por 45 segundos em temperatura ambiente. Em seguida, lave as seções uma vez, colocando-as em um banho de etanol a 75% por 30 segundos. Pipete 200 microlitros de solução de Eosina Y nas seções e incube por três a cinco segundos.

Desidrate o tecido colocando as lâminas posteriormente em etanol a 75%, etanol a 95% e, finalmente, um banho de etanol a 100% por 30 segundos cada. Seque a extremidade da lâmina com um lenço de papel entre cada passo para remover o excesso de líquido. Deixe o slide secar completamente sob o capô por cinco minutos.

Depois de seco, execute o LCM imediatamente depois. Evite o uso de xileno na última etapa de limpeza. O tratamento com xileno fará com que a seção de tecido seja montada inadequadamente na lâmina da membrana.

O xileno também reduzirá a eficiência da captura de tecido pelo LCM. Coloque a lâmina de membrana PET com o lado do tecido corado voltado para baixo diretamente na parte superior de uma nova lâmina de vidro que foi carregada no microscópio stage. Certifique-se de que a membrana e a lâmina de vidro estejam bem emparelhadas no microscópio stage.

Inicie o LCM definindo primeiro os limites do slide. Escolha a menor ampliação de 4X no painel Objetivo e, em seguida, defina a área de trabalho da lâmina de membrana movendo a platina XY do microscópio até que o canto superior esquerdo, onde o metal e a membrana se encontram, seja visível na transmissão de vídeo ao vivo. Neste ponto, pressione o botão Limite 1 e um retângulo vermelho aparecerá no roteiro.

Em seguida, mova o estágio XY para o canto oposto e pressione o botão Limit 2. Pressione o botão Digitalizar para criar uma imagem de roteiro da membrana e dos tecidos entre os limites definidos. Clique duas vezes perto da TM de uma das seções do olho dentro do roteiro.

A MT pode estar localizada perto do ápice do ângulo iridocorneano. Assim que a MT for identificada, aumente a ampliação para 10X e foque manualmente na TM. Repita com objetivas 20X e 40X. Quando a MT estiver em foco com a objetiva 40X, navegue até uma área em branco, selecione a ferramenta de desenho à mão livre e desenhe uma linha longa em uma área em branco do tecido.

Defina os parâmetros do laser para que a velocidade de corte seja de 34%o foco seja de 58%e a potência seja de 70%e, em seguida, pressione o botão Cortar. Faça ajustes finos a laser nos parâmetros de velocidade, foco e potência até que uma linha de corte clara e fina seja observada. Para um corte preciso, certifique-se de que a ação de corte siga a linha desenhada.

Em seguida, coloque a tampa do tubo de isolamento no suporte da tampa e abra o tubo. Prenda o suporte da tampa ao elevador da tampa e certifique-se de que o tubo esteja invertido. Certifique-se também de que o material da tampa adesiva se projete além da ponta da tampa para garantir que o tecido desejado seja capturado adequadamente.

É fundamental garantir visualmente que a malha trabecular seja recolhida e fixada à tampa de isolamento. Selecione o modo de Dissecção manual no painel do software. Revise cuidadosamente se a MT está diretamente abaixo do tubo de isolamento.

Defina o Equilíbrio de Brancos e ajuste o Brilho para obter a melhor qualidade de imagem. Para começar a cortar, ajuste manualmente o foco e desenhe uma linha usando a ferramenta à mão livre. Certifique-se de que a tampa coletora permaneça na posição para cima, ainda não tocando na membrana.

Desenhe círculos parciais perto de onde a TM encontra a esclera e pressione Cortar. Assim que os primeiros cortes forem feitos, posicione a tampa na posição para baixo e reajuste o foco, depois desenhe duas linhas no espaço aberto ou livre para conectar os dois círculos parciais, completando o círculo ao redor do TM. Em seguida, pressione Cortar e colete o tecido da seção. Certifique-se de que a MT foi captada pela tampa de microdissecção.

Posicione a tampa de volta na posição para cima e repita nas seções restantes. Ajuste ligeiramente a posição da tampa para que todas as amostras isoladas caibam na tampa e não se sobreponham. Para a próxima membrana PET, insira um novo tubo de isolamento e repita esta seção.

Para realizar a lise do tecido da MT microdissecada, pipete cuidadosamente 10 microlitros de tampão de lise na tampa do tubo de coleta, garantindo que o tampão de lise cubra completamente a MT microdissecada. Feche suavemente a tampa adesiva e incube o tubo de coleta de cabeça para baixo em temperatura ambiente por 10 minutos. Após incubação, centrifugue a 800 g durante dois minutos e coloque o lisado sobre gelo seco. Armazene os lisados a -80 graus Celsius para posterior purificação e análise.

A rápida degradação do RNA pode afetar a análise de RNA a jusante. A qualidade do RNA deve ser medida e quantificada usando uma plataforma baseada em microfluídica. Resultados representativos da análise da expressão gênica do RNA total de alta qualidade purificado da malha trabecular são mostrados aqui.

O gel digital para o RNA total restante do tecido ocular após a microdissecção a laser mostra um alto número de integridade do RNA, que é necessário para a análise subsequente do RNA a jusante. Uma vez que o RNA de qualidade é extraído do tecido, análises a jusante, como microarray, RNA-Seq e qPCR, podem ser realizadas. Aqui, a análise quantitativa de PCR digital foi usada para analisar a expressão dos genes associados à malha trabecular, miocilina e ACTA2 do RNA coletado por LCM.

É ilustrado pelo mapa de calor gerado a partir de dados obtidos da análise de micro-array que esta técnica pode ser usada para entender as mudanças na expressão gênica na malha trabecular de camundongos do tipo selvagem e camundongos knockout com fenótipo de PIO elevado. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de um dia por animal biológico, se feita corretamente. A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas de microdissecção a laser são difíceis de aprender devido à dificuldade de visualização das células de interesse e à ausência de padrões para essas amostras únicas.

Confiar no operador qualificado é fundamental. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o RNA em pequenas quantidades de tecido pode ser rapidamente degradado. Precauções como descontaminar o equipamento da RNase, minimizar a exposição ao ar e manter o tecido frio devem ser tomadas.

Embora esse método possa fornecer informações sobre os efeitos do aumento da pressão intraocular na expressão gênica específica da malha trabecular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a avaliação de mudanças na expressão gênica na retina causadas pelo aumento da pressão intraocular. Após este procedimento, outros métodos como RNA-Seq ou micro-array podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais vias de sinalização são alteradas na malha trabecular de camundongos com pressão intraocular elevada. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores estudarem com mais eficácia as mudanças na expressão gênica na malha trabecular em modelos de camundongos.