Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia vascular e do câncer, como mecanismos de plasticidade endotelial em várias condições patológicas, incluindo câncer. A principal vantagem desta técnica é que a indução robusta de EndMT in vitro é realizada pelo tratamento com TGF-em células endoteliais MS-1. Primeiro cultive as células MS-1 em condições de cultura padrão e evite que a cultura seja confluente.

Em seguida, em um prato de 10 cm, lave as células MS-1 com 1x solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, adicione 1 mL de tripsina à placa e incube a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione 9 mL de meio de cultura às células tripsinizadas para descolamento.

Em seguida, colete a suspensão celular tripsinizada em um tubo de 15 mL. Centrifugar a suspensão da célula a 300 a 400 x G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, use um contador automático de células para contar o número de células viáveis.

Em seguida, coloque as células MS-1 em placas de cultura padrão não revestidas para cultura de longo prazo. Após 24 horas, estimule as células endoteliais com uma concentração final de 1 ng por mililitro de TGF-2. Em seguida, incube a placa de cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Após 48 horas de tratamento, substitua o meio por meio de cultura fresco e pré-aquecido contendo TGF-2 Para a análise a jusante, coloque as células MS-1 em uma lâmina de câmara de cultura de 8 poços pré-revestida com gelatina. Após 24 horas, adicionar 10 M de inibidor de ROCK à cultura de células. Após uma hora, estimule as células endoteliais com uma concentração final de 1 ng por mililitro de TGF-2.

Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius. Para uma cultura de 72 horas, substitua o meio antigo por meio novo contendo TGF-2 após 48 horas. Após um dia inteiro de tratamento com TGF, remova o meio.

Em seguida, fixe as células com paraformaldeído a 4% e solução salina tamponada com fosfato por 20 minutos em temperatura ambiente. Após o término do período de fixação, lave as células com solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, incube as células com 0,2% de Triton X-100 por cinco minutos em temperatura ambiente.

Após cinco minutos, enxágue novamente as células com solução salina tamponada com fosfato 1x três vezes. Após três lavagens, incubar as células com falotoxina fluorescente diluída contendo tampão de bloqueio durante uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação, lave as células com 1x solução salina tamponada com fosfato, três vezes.

Em seguida, corar os núcleos das células usando o corante de ligação ao ácido nucleico de cianina por cinco minutos à temperatura ambiente. Após cinco minutos, enxágue a lâmina e monte uma lamínula na lâmina usando a mídia de montagem da lâmina. Observe as células sob um microscópio confocal.

As células mostram reorganização das fibras de estresse espessas após o tratamento com TGF-2. Isso indica a potência do TGF-2 na indução de EndMT em células endoteliais. Após 72 horas de tratamento com TGF-2, descartar o meio e fixar as células com 0,5 a 1 ml de metanol frio a 50% e acetona a 50% por cinco minutos.

Em seguida, enxágue as células com 1x solução salina tamponada com fosfato, três vezes. Após a conclusão das três lavagens, incube as células com anticorpos primários no tampão de bloqueio durante a noite a 4 graus Celsius, no escuro. No dia seguinte, lave novamente as células com 1x solução salina tamponada com fosfato, três vezes.

Em seguida, incube as células com anticorpo secundário conjugado com corante verde para VE-caderina no tampão de bloqueio, por uma hora no escuro. Novamente lave as células com 1x solução salina tamponada com fosfato, três vezes. Em seguida, corar os núcleos das células usando o corante de ligação ao ácido nucleico de cianina por cinco minutos à temperatura ambiente.

Após cinco minutos, enxágue a lâmina e monte uma lamínula na lâmina usando o meio de montagem da lâmina. Em seguida, observe as células sob um microscópio confocal. As células mostram diminuição da expressão de VE-caderina e aumento da expressão de actina de músculo liso após o tratamento com TGF-2 por 48 a 72 horas.

Antes do ensaio de contração do gel de colágeno, cultive as células MS-1 na presença e ausência de TGF-2 por 72 horas. Em seguida, prepare o gel de colágeno tipo 1 no gelo. Em seguida, misture 800 l da solução de gel de colágeno com 200 mL do controle ou células endoteliais tratadas com TGF-2.

Em seguida, adicione 1 mL dessa mistura a cada poço de uma placa de cultura de 12 poços. Deixe o gel solidificar a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Após a solidificação do gel, adicione 1 mL de MEM Alpha, contendo 10% de soro fetal de bezerro, 50 unidades por mililitro de penicilina e 50 g por mililitro de estreptomicina, para flutuar o gel.

Em seguida, retire o gel da parede do poço e incube o gel flutuante a 37 graus Celsius por 48 horas. Após 48 horas de incubação, escaneie as imagens do gel do fundo da placa usando um scanner. Mudanças morfológicas distintas são visíveis, transformando as células da arquitetura em forma de paralelepípedo para o fuso mesenquimal devido à exposição ao tratamento com TGF-2 por 72 horas.

Curiosamente, o tratamento com TGF beta 2 por 48 a 72 horas mostra um aumento nos níveis de expressão de mRNA e proteína da actina de músculo liso nas células MS-1. O ensaio de contração do gel também mostra que, após o tratamento com TGF-2, o gel de colágeno tipo 1 se contrai significativamente. Curiosamente, a privação de TGF-2 diminui a actina do músculo liso ao nível basal e as células retomam a morfologia do paralelepípedo, indicando que o EndMT é um processo dinâmico.

De fato, a inibição do microRNA 31 pelo inibidor de microRNA LNA usando as células MS-1 atenua a indução de marcadores mesenquimais. No entanto, o inibidor não afeta a indução de genes alvo do TGF, como Fibronectina 1, PAI-1 e Smad 7. Seguir este procedimento como um método como expressão gênica, knockdown ou modulação de microarray pode ser realizado para responder a perguntas adicionais, como gene específico e função de microRNA no EndMT.