Name: Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprenda a induzir transição endotelial-mesenquimal em células MS-1 usando TGF-β2 para biologia vascular. Este método permite analisar mudanças morfológicas e moleculares, incluindo modulação de microRNAs, em estudos de plasticidade celular.

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Agradecemos Zea Borok e Kohei Miyazono sugestões na preparação do manuscrito. H.I.S. e M.H. são compatíveis com o Uehara Memorial Foundation Research Fellowship, e H.I.S. é suportado pelo Osamu Hayaishi Memorial bolsa de estudo no exterior. Este trabalho foi financiado por um subsídio da Fundação de ciência Takeda (A.S.).

1. indução de EndMT
<ol><li>Manter as células de MS-1 em condições de cultura padrão e evitar a confluência. Uma fonte de células de MS-1 é descrita na Tabela de materiais. Para células de MS-1, uso médio mínimo essencial-α (α-MEM) com 10% de soro fetal bezerro (FCS), 50 U/mL penicilina e estreptomicina 50 de μg/mL.</li>
	<li>Células de lavar MS-1 em 10 cm do prato com 1 x salina tamponada fosfato (PBS) e adicionam 1,0 mL de tripsina na placa. Incubar durante 5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Separe as células usando 9 mL do meio de cultura. Recolha a suspensão de células em um tubo de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular de 300 – 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire o sobrenadante cuidadosamente e suspender o centrifugado em meios de cultura previamente aquecido.</li>
	<li>Contagem de células viáveis usando solução de azul de Trypan e um hemocytometer padrão ou um contador automático de células.</li>
	<li>Placa MS-1 células em placas de cultura padrão não revestidos em 0,5 x 103 células por cm2 por muito tempo o termo cultura. Por exemplo, células de3 placa de 5,0 x 10 por bem em um 6 cultura bem placa. Use os mesmos meios de cultura, incluindo a mesma concentração de FCS. Nas células do MS-1, TGF-β induz EndMT na cultura de longo prazo (pelo menos 48-72 h), com o uso do FCS.</li>
	<li>Estimula as células endoteliais com TGF-β2 (uma concentração final de 1 ng/mL) após 24 h.</li>
	<li>Células de cultura numa incubadora umidificado (5% de CO2, 37 ° C). Monitorar as células diariamente quando o foco sobre as alterações morfológicas.</li>
	<li>Substitua a mídia fresco pré-aquecido meios de cultura contendo TGF-β2 após 48 h de tratamento com TGF-β na cultura de longo prazo.</li>
	<li>Proceda as análises a jusante. Normalmente, reorganização de actina é observada após 24 h de tratamento, e downregulation de marcadores endoteliais e upregulation de marcadores mesenquimais são observados após 48-72 h de tratamento com TGF-β.</li>
</ol>2. Immunocytochemical análise
<ol><li>Manter as células de MS-1 em condições de cultura padrão.</li>
	<li>Células da placa MS-1 para 4 células bem slides de câmara de cultura em 1,0 x 103 células por poço (1,7 cm2). Slides estão revestidos com gelatina. Uso de 0,5 m a 1,0 mL de meios de cultura por bem.</li>
	<li>Estimula as células endoteliais com TGF-β2 (uma concentração final de 1 ng/mL) após 24 h. Ao analisar o envolvimento de rocha em EndMT, adicione um antes de 1h ROCK inibidor Y-27632 (10 μM) para tratamento de TGF-β. Ao avaliar o efeito da inibição da sinalização do TGF-β, inibidores de cinase do receptor TGF-β podem ser usados.</li>
	<li>Células de cultura numa incubadora umidificado (5% de CO2, 37 ° C). Reorganização de actina é observada nas células de MS-1 após 24 h de tratamento com TGF-β. Outras alterações tornar-se evidente após 48-72 h de tratamento. Para a cultura de 72 h, substitua a mídia mídia fresca contendo TGF-β após 48 h de tratamento com TGF-β.</li>
	<li>
F-Actina de coloração
	<ol>
<li>Após 24 h de tratamento de TGF-β, remova a mídia, corrigir células com paraformaldeído 4% em PBS 1x por 20 min em temperatura ambiente e enxágue células com PBS 1x.</li>
		<li>Incube com 0,2% Triton X-100 por 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Enxague as células três vezes com PBS 1x.</li>
		<li>Incube com isotiocianato de B faloidina-diversos de Amanita phalloides diluído 150-fold com tampão de bloqueio por 1h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Enxague as células três vezes com PBS 1x.</li>
		<li>Mancha os núcleos com corantes de ligação de ácido nucleico cianina durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Slides de enxaguamento e monte lamelas viradas para baixo em um slide usando o slide meios de montagem.</li>
		<li>Observe com um microscópio confocal. Use um laser de 543 nm e um filtro de emissão de 560 – 615 nm para a deteção da fluorescência de faloidina. Usar um laser de 633 nm e um filtro de emissão mais de 650 nm para coloração nuclear. Tratamento com TGF-β, formação de fibras grossas estresse seria observada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
VE-caderina e α-SMA coloração
	<ol>
<li>Após 72 h de tratamento de TGF-β, remova a mídia, fixar as células com frio 50% de metanol e acetona 50% (0,5-1,0 mL por bem) por 5 min.</li>
		<li>Enxagúe as células três vezes com PBS 1x (0,5-1,0 mL por bem).</li>
		<li>Incube com anticorpos primários em tampão de bloqueio durante a noite a 4 ° C, no escuro de acordo com a concentração recomendada pelo fabricante. Use o anticorpo monoclonal de VE-caderina (BV13, diluição de 1: 100) e α-SMA Cy3-conjugado anticorpo monoclonal (1A4, diluição de 1: 200)20.</li>
		<li>Enxague as células três vezes com PBS 1x.</li>
		<li>Incube as células com um anticorpo secundário conjugada com corante verde para VE-caderina anticorpo em tampão de bloqueio por 1h à temperatura ambiente no escuro de acordo com a concentração recomendada pelo fabricante.</li>
		<li>Enxague as células três vezes com PBS 1x.</li>
		<li>Mancha os núcleos com corantes de ligação de ácido nucleico cianina durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Slides de enxaguamento e monte lamelas viradas para baixo em um slide usando o slide meios de montagem.</li>
		<li>Observe com um microscópio confocal. Use um laser de 543 nm e um filtro de emissão de 560 – 615 nm para a deteção de α-SMA (Cy3). Use um laser de 488 nm e um filtro de emissão de 505 – 550 nm para a deteção de VE-caderina. Normalmente, após tratamento com tratamento de TGF-β, diminuição de sinais VE caderina e aumento do α-SMA sinais seria observado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ensaio de contração de Gel de colágeno tridimensional
<ol><li>Realize cultura de células de MS-1, com ou sem o TGF-β para 72 h antes do ensaio de contração de gel de colágeno.</li>
	<li>Preparar o tipo eu gel de colágeno no gelo. Misturar a solução de colágeno frio, 10x concentrado MEM médio e tampão de diluição de colágeno contendo 0,05 N NaOH, 2,2% NaHCO3e 200 mM HEPES pH 7,4 em um 8:1:1 relação.</li>
	<li>Misture 200 mL de controle ou suspensões de células endoteliais TGF-β-tratada (1.0 x 106 células/200 μL) e 800 μl da solução de gel de colágeno. Para TGF-β amostras tratadas, adicionar TGF-β2 (1 ng/mL) para a suspensão de eritrócitos.</li>
	<li>Adicionar 1,0 mL da mistura a cada poço das placas de cultura 12-poços e deixar para solidificar na incubadora a 37 ° C por 30 a 60 min.</li>
	<li>Após a gelatinização, sobreposição de 1,0 mL de MEM-α contendo 10% FCS, 50 U/mL penicilina e estreptomicina 50 μg/mL para flutuar o gel. Para TGF-β amostras tratadas, adicionar TGF-β2 (1 ng/mL) para a mídia. Nota: Para amostras tratada de TGF-β, adicione TGF-β para o gel e a meios de cultura.</li>
	<li>Incube os géis flutuantes a 37 ° C por 48 h.</li>
	<li>Digitalizar as imagens de géis de fundo das placas usando um scanner. Alternativamente, grave as imagens de géis usando uma câmera digital em uma distância fixa acima os géis.</li>
	<li>Quantificar a área de superfície de gel com base no número de pixel usando o ImageJ. Seleccione o gel usando uma seleção à mão livre ou ferramentas de seleção relacionados ou usando o gel "imagem | Ajustar | Limiar de cor"da ferramenta e em seguida, determinar a área do uso de gel" Analyze | Comando de medida".</li>
</ol>4. inibição de miRNA atividades por miRNA trancada do ácido nucleico-baseado inibidores
<ol><li>Manter as células de MS-1 em condições de cultura padrão.</li>
	<li>Transfect miRNA inibidores trancado ácido nucleico (LNA), miRNA sintético duplex ou siRNAs (20 ou 50 nM) usando reagentes lipofection de acordo com as instruções do fabricante. Detalhes e fontes de LNA miRNA inibidores sintéticos miRNA duplex e siRNAs foram descritas em nossos anteriores relatórios26,27. Nas células do MS-1, procedimentos padrão de transfeccao baseados as instruções do fabricante funcionam bem para a introdução dos inibidores de miRNA LNA, miRNA sintético duplex ou siRNAs.</li>
	<li>Após 16 – 48 h, estimulam as células endoteliais com TGF-β2 (uma concentração final de 1 ng/mL).</li>
	<li>Prossiga para várias análises a jusante, incluindo análise da expressão (RT-PCR quantitativo e análises sequenciação do ARN (RNA-seq)) RNA, immunocytochemical análise e ensaio de repórter. Análises a jusante têm sido descritas em nossos anteriores relatórios20,26,27.</li>
</ol>

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<li>Paranya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+valve+endothelial+cells+undergo+transforming+growth+factor-beta-mediated+and+non-transforming+growth+factor-beta-mediated+transdifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro.</a> American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).</li>
<li>Maleszewska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+and+TGFbeta2+synergistically+induce+endothelial+to+mesenchymal+transition+in+an+NFkappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner.</a> Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-endothelial+transition+contributes+to+cardiac+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization.</a> Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+balance+of+aberrant+Rasal1+promoter+methylation+and+hydroxymethylation+regulates+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis.</a> Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Endothelial+Cells+with+Distinct+Patterns+of+TGFbeta-Driven+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Tem sido relatado que ativado tratamento Ras e TGF-β para 24h induzida EndMT nas células do MS-1, enquanto o TGF-β sozinho falhou induzir a EndMT deste curto período,21. Consistentemente, observamos que TGF-β substancialmente induzida EndMT após o tratamento mais tempo (48-72 h) em MS-1 células20. EndMT tem sido repetidamente observado após tratamento prolongado com TGF-β (2-6 dias) em várias células endoteliais como umbilical humano veia células endoteliais (HUVEC), humana...

Endotelial-mesenquimais transição (EndMT) é o processo pelo qual uma célula endotelial diferenciada passa por uma variedade de alterações moleculares, resultando em uma célula mesenquimais do fibroblasto como1. EndMT foi inicialmente descrita como uma transformação de células endoteliais durante o desenvolvimento do coração2,3. No desenvolvimento inicial do coração, o tubo de coração consiste em um interior endocárdio e miocárdio um exterior. Estas duas camadas são separadas por uma camada de matriz extracelular, chamada geleia cardíaca. As células embrionárias endocárdico, que adquirem marcadores de células endoteliais, trânsito em células mesenquimais, invadem a geleia cardíaca subjacente e promovem a formação dos coxins cardíacas, fornecendo a base para as válvulas atrioventricular e septo e as válvulas semilunar. Além disso, foi sugerido para ser fontes de pericitos e células de músculo liso vascular em outros sistemas vasculares embrionários, incluindo vasos coronários, aorta abdominal e artéria pulmonar4,5,6EndMT. Além disso, o EndMT está implicada na fisiológico angiogênico brotando7.
Acumular evidência tem sugerido que o EndMT também está envolvida em várias doenças cardiovasculares e outras doenças1,8. EndMT-associado a condições incluem calcificação vascular, aterosclerose, hipertensão arterial pulmonar, malformação cavernosa, fibrose do órgão, remodelação de enxerto de veia, disfunção do enxerto em transplante renal e câncer8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. um recente relatório descrito que vários marcadores moleculares de EndMT podem ser uma ferramenta para a previsão do diagnóstico e prognóstico da disfunção do enxerto renal em rim transplante17. Modulação de vias de sinalização celulares EndMT-relacionados foram mostrados para melhorar várias condições de doença, incluindo Fibrose cardíaca e enxerto de veia remodelação no animal modelos8,15. Portanto, compreender os mecanismos subjacente EndMT é importante desenvolver estratégias diagnósticas e terapêuticas, visando EndMT.
EndMT é caracterizada por perda de junções célula-célula, aumento da capacidade migratória, downregulation de genes específicos endoteliais como VE caderina e upregulation de genes mesenquimais incluindo actina de músculo liso-α (α-SMA). Além disso, EndMT e transição epitelial-mesenquimal (EMT), um processo similar que converte células epiteliais de células mesenquimais, estão associados a produção alterada de vários componentes da matriz extracelular, que pode contribuir para o desenvolvimento de tecido fibrose8,19.
Recentemente, vários estudos em vitro de EndMT tem elucidado detalhes dos mecanismos moleculares de EndMT15,20. EndMT é induzido por vários caminhos de sinalização, incluindo (TGF) do fator de crescimento transformante-β, Wnt e entalhe1. Entre eles, o TGF-β tem um papel crucial na indução de EMT e EndMT. Em EndMT, uma exposição prolongada aos resultados de TGF-β em EndMT em várias células endoteliais, enquanto exposição curta parece ser insuficiente21. Descrevemos aqui um protocolo simples para indução de EndMT, no qual 1 de SVEN milha (MS-1) células endoteliais microvascular do pâncreas de rato sofrem EndMT em vitro após exposição prolongada ao TGF-β20. Neste modelo, várias análises a jusante podem ser realizadas para investigar características de marca do EndMT, incluindo as alterações morfológicas, downregulation de marcadores endoteliais, upregulation de genes inflamatórios, do citoesqueleto e mesenquimais marcadores rearranjos e contração do gel de colágeno.
MicroRNAs (miRNAs) são 22 ~ nt pequenos RNAs regulamentares que dirigem a repressão posttranscriptional de mRNA vários alvos22,23. Através do reconhecimento de semente mediada por sequência alvo, miRNAs suprimir centenas de genes-alvo e modulam diversas funções celulares, tais como motilidade, proliferação e diferenciação celular. Este também é o caso de regulamento de EMT e EndMT, e vários miRNAs têm sido relatados como reguladores de EMT e EndMT24,25. O modelo de EndMT apresentado nesta revisão pode ser facilmente combinado com procedimentos de modulação de miRNA para testar as funções de miRNAs em EndMT. A presente revisão resume nossos procedimentos experimentais para investigar EndMT TGF-β-induzida em células de MS-1 e inclui também a comparação das condições de indução de EndMT por TGF-β em outras células endoteliais.

<table><tbody><tr><td>MS-1 células</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-2279</td><td></td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32571036</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta2</td><td>R & D</td><td>302-B2-002</td><td></td></tr><tr><td>4 poços Lab-Tek II Chamber Slide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueando um</td><td>nacalai tesque</td><td>03953-95</td><td></td></tr><tr><td>faloidina-tetrametilrodamina B isotiocianato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3 iodeto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>VE anticorpo monoclonal de caderina (BV13)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-1441-82</td><td></td></tr><tr><td>alfa-SMA Anticorpo monoclonal Cy3 (1A4)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG (H + L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174934</td><td></td></tr><tr><td>Solução de colágeno</td><td>Nitta gelatina Inc.</td>Tampão de diluição de colágeno <td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nitta gelatina Inc.</td>Inibidor de miRNA de <td>LNA I-P</td><td></td>da Cellmatrix</tr><tr><td></td><td>EXIQON&nbsp;</td><td>miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Controle Negativo B e miRNA alvo)</td><td></td></tr><tr><td>miRNA sintético duplex</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>miScript miRNA Mimic</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778030</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 11668027</td><td></td></tr></tbody></table>

análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Plasticidade fenotípica de células endoteliais está subjacente o desenvolvimento do sistema cardiovascular, doenças cardiovasculares e várias condições associadas com fibrose do órgão. Nestas condições, as células endoteliais diferenciadas adquirem fenótipos mesenquimais semelhante. Este processo é chamado de transição endotelial-mesenquimais (EndMT) e é caracterizado por downregulation de marcadores endoteliais, upregulation de marcadores mesenquimais e alterações morfológicas. EndMT é induzida por várias vias de sinalização, incluindo (TGF) do fator de crescimento transformante-β, Wnt e entalhe e regulado por mecanismos moleculares semelhantes de transição epitelial-mesenquimal (EMT) importante para gastrulação, fibrose do tecido, e metástase do cancro. Compreender os mecanismos da EndMT é importante para desenvolver abordagens diagnósticas e terapêuticas, visando EndMT. Indução robusta do EndMT em vitro é útil para caracterizar assinaturas de expressão de gene comum, identificar mecanismos moleculares druggable e tela para moduladores de EndMT. Aqui, descrevemos um método em vitro para indução de EndMT. Células endoteliais microvascular do pâncreas de rato MS-1 submetido a EndMT após a exposição prolongada ao TGF-β e mostram upregulation de marcadores mesenquimais e mudanças morfológicas, bem como a indução de múltiplos inflamatórias quimiocinas e citocinas. Métodos de análise de microRNA (miRNA) modulação também estão incluídos. Esses métodos fornecem uma plataforma para investigar os mecanismos subjacentes a EndMT e a contribuição dos miRNAs para EndMT.

TGF-β é um potente indutor de EndMT em várias células endoteliais. Após o tratamento de 24 h com TGF-β nas células do MS-1, coloração para F-Actina mostra reorganização de actina stress fibras (figura 1A)20. Pré-tratamento com um inibidor ROCK Y-27632 inibe a indução de actina reorganização20. MS-1 células endoteliais alterar de uma morfologia de paralelepípedos, como a clássica para uma morfologia fusiforme mes...

Um protocolo para indução em vitro de transição endotelial-mesenquimais (EndMT), que é útil para investigar as vias de sinalização celulares envolvido em EndMT, é descrito. Neste modelo experimental, EndMT é induzida pelo tratamento com TGF-β em células endoteliais de MS-1.

Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia vascular e do câncer, como mecanismos de plasticidade endotelial em várias condições patológicas, incluindo câncer. A principal vantagem desta técnica é que a indução robusta de EndMT in vitro é realizada pelo tratamento com TGF-em células endoteliais MS-1. Primeiro cultive as células MS-1 em condições de cultura padrão e evite que a cultura seja confluente.Em seguida, em um prato de 10 cm, lave as células MS-1 com 1x solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, adicione 1 mL de tripsina à placa e incube a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione 9 mL de meio de cultura às células tripsinizadas para descolamento.Em seguida, colete a suspensão celular tripsinizada em um tubo de 15 mL. Centrifugar a suspensão da célula a 300 a 400 x G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, use um contador automático de células para contar o número de células viáveis.Em seguida, coloque as células MS-1 em placas de cultura padrão não revestidas para cultura de longo prazo. Após 24 horas, estimule as células endoteliais com uma concentração final de 1 ng por mililitro de TGF-2. Em

molecular-analysis-endothelial-mesenchymal-transition-induced

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método simples é descrito para a indução de células epiteliais para mesenquimal (EMT) em uma variedade de tipos de células. Métodos de análise de células em EMT estados por imunocitoquímica estão incluídos.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

A regulação alternativa do splicing demonstrou contribuir para a transição epitelial-mesenquimal (EMT), um programa celular essencial em vários processos fisiológicos e patológicos. Aqui descrevemos um método utilizando um modelo EMT induzível para a detecção de splicing alternativo durante EMT.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Aqui, descrevemos o desenvolvimento e a aplicação de um ensaio de contração em gel para avaliar a função contrátil em células mesenquimais que sofreram transição epitelial-mesenquimal.

Desenvolvimento de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para avaliar contrátil Função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal Sofreu

Este manuscrito descreve um ensaio de formação de tubo para quantificar os efeitos de um determinado composto ou condição na angiogênese usando a formação de tubo de células endoteliais em um ambiente controlado.

Endotelial estratégica Assay formação de células do tubo: Comparando Matriz Extracelular e Fator de Crescimento Reduzido Matriz Extracelular

Apresentamos aqui um método de cultura de células para a indução de transições mesenquimais-epiteliais (MET) em células de sarcoma com base na expressão ectópica combinado de microARN-200 e os membros da família grainyhead-like 2 (GRHL2). Este método é adequado para a melhor compreensão do impacto biológico de plasticidade fenotípica sobre a agressividade e tratamentos do cancro.

A indução de transições mesenquimais-epiteliais em células de sarcoma

miRNA terapêutica tem potencial significativo na regulamentação da progressão do câncer. Demonstrado aqui abordagens analíticas são usadas para a identificação da atividade de um tratamento de combinatória miRNA em travar o ciclo celular e a angiogênese.

Análise de combinatória miRNA tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese

Descrevemos um fluxo de trabalho sistemático para investigar a sinalização TGF-β e o EMT induzido pelo TGF β, estudando a proteína e a expressão genética envolvidas nessa via de sinalização. Os métodos incluem mancha ocidental, ensaio de repórter de luciferase, qPCR e coloração de imunofluorescência.

Estudando a sinalização TGF-β e a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β em câncer de mama e células normais

Descrevemos métodos para investigar o EndMT induzido pelo TGF-β2 em células endoteliais observando alterações de morfologia celular e examinando as alterações de marcadores relacionadas ao EndMT usando a coloração da imunofluorescência. A edição de genes CRISPR/Cas9 foi descrita e usada para esgotar o caracol de codificação genética para investigar seu papel no EndMT induzido pelo TGF-β2.

Endotelial mediado por TGF-β para transição mesenquimal (EndMT) e a avaliação funcional dos efeitos endMT usando edição de genes CRISPR/Cas9

Aqui, estabelecemos um protocolo para visualizar e analisar simultaneamente múltiplos complexos de SMAD utilizando o ensaio de ligadura de proximidade (PLA) em células endoteliais expostas a condições patológicas e fisiológicas de estresse da tesoura de fluidos.

Visualização e Quantificação de TGFβ/BMP/SMAD Sinalizando em diferentes condições de estresse da tesoura de fluidos usando o ensaio de proximidade-ligação-assay

Este trabalho apresenta um modelo animal de fibrose induzida pela transição endotelial-mesenquimal, como visto em defeitos cardíacos congênitos, como estenose aórtica crítica ou síndrome do coração esquerdo hipoplásico, que permite a avaliação histológica detalhada do tecido, a identificação de vias de sinalização regulatórias e o teste de opções de tratamento.

Modelo de Transplante Cardíaco Heterotópico Neonatal em Rato para Estudo da Transição Endotelial-Mesenquimal

O presente protocolo permite a recuperação de estruturas semelhantes a tubos formadas no ensaio clássico de formação de tubos de angiogênese in vitro , onde células, como células trofoblásticas, se organizam em estruturas semelhantes a capilares sobre uma camada de matriz de membrana basal extracelular. As estruturas recuperadas são usadas para isolamento de RNA e proteínas para várias análises bioquímicas.

Recuperação de células trofoblásticas do ensaio de formação de tubos de angiogênese para análise de expressão de marcadores de diferenciação

Aprenda a induzir transição endotelial-mesenquimal em células MS-1 usando TGF-β2 para biologia vascular. Este método permite analisar mudanças morfológicas e moleculares, incluindo modulação de microRNAs, em estudos de plasticidade celular.

Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

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