Eletroquímico deteção de deutério cinética efeito isotópico no transporte de elétrons extracelular em Shewanella oneidensis MR-1

O objetivo geral deste protocolo é observar a contribuição do transporte de prótons para a taxa de transporte de elétrons extracelulares bacterianos pela detecção do efeito do isótopo cinético de deutério. Nosso método revela o impacto do transporte de prótons na cinética do transporte de elétrons extracelular ou EET de bactérias para um eletrodo via citocromos do tipo c da membrana externa. Nosso ensaio reflete o manejo de prótons nativos no EET porque usamos bactérias vivas em vez de enzimas purificadas.

No entanto, nosso desafio era remover os ruídos de outros processos celulares. O efeito do isótopo cinético de deutério denominado KIE é uma das melhores técnicas para examinar a contribuição do transporte de prótons no processo de transporte de elétrons associado. Para cultivar células Shewanella MR-1, transfira uma colônia das células cultivadas em uma placa de ágar para 15 mililitros de meio LB.

Cultive as células a 30 graus Celsius por 24 horas em condições aeróbicas com agitação a 160 rpm. Centrifugue a suspensão da célula a 6.000 vezes a gravidade por 10 minutos. Em seguida, ressuspenda o pellet celular resultante em 15 mililitros de Meio Definido, suplementado com lactato 10 milimolar como fonte de carbono e 0,5 gramas por litro de extrato de levedura como oligoelementos para as células.

Depois de cultivar ainda mais a suspensão celular aeróbica a 30 graus Celsius por 12 horas com agitação a 160 rpm, centrifugue novamente a 6.000 vezes a gravidade por 10 minutos. Lave o pellet de célula resultante duas vezes com meio DM por centrifugação por 10 minutos a 6.000 vezes a gravidade antes do experimento eletroquímico. Para construir um reator eletroquímico de três eletrodos, coloque um substrato ITO como eletrodo de trabalho na parte inferior do reator.

Em seguida, insira um cilindro de vidro e uma tampa de politetrafluoretileno e insira um fio de platina como contra-eletrodo. Em seguida, insira um eletrodo de cloreto de prata no reator como eletrodo de referência. Em seguida, adicione quatro mililitros de MS suplementados com lactato 10 milimolar e 0,5 gramas por litro de extrato de levedura no reator eletroquímico.

Depois de confirmar que não há vazamento do reator eletroquímico, flua o gás nitrogênio para o reator eletroquímico por mais de 20 minutos para manter as condições anaeróbicas dentro do reator eletroquímico. Conecte o reator eletroquímico a um potenciostato e aplique um positivo de 0,4 volts ao eletrodo ITO, mantendo a temperatura do reator eletroquímico em 30 graus Celsius usando um sistema externo de circulação de água. Para realizar o cultivo eletroquímico, primeiro ajuste a densidade celular da suspensão para uma densidade óptica de 1,43 a 600 nanômetros com DM suplementado por 10 milimolares de lactato e 0,5 gramas por litro de extrato de levedura.

Adicione 0,3 mililitros da suspensão celular ao reator eletroquímico através da porta de injeção usando uma seringa. O OD 600 no reator muda para 0,1. Continue a aplicação potencial em 0.4 volts positivos no eletrodo ITO por 25 horas.

Pare a aplicação potencial e desconecte o reator eletroquímico do potenciostato e do sistema de circulação de água. Flua o gás nitrogênio para uma garrafa contendo DM com lactato 10 milimolar durante 20 minutos para remover o oxigênio do meio. Agora, extremamente lenta e suavemente, remova todo o sobrenadante de dentro do reator eletroquímico usando uma seringa sob o fluxo de gás nitrogênio.

Em seguida, adicione quatro mililitros de MS fresco contendo 10 milimolares de lactato usando uma seringa. Incline o reator eletroquímico para remover todo o sobrenadante na parede do reator. Repita essas etapas três vezes no total.

Pare o fluxo de gás e conecte o reator eletroquímico ao potenciostato novamente, aplicando um positivo de 0,4 volts ao eletrodo ITO a 303 Kelvin. Confirme se a produção atual de um biofilme monocamada de Shewanella MR-1 é estável e não aumenta rapidamente. Se a corrente aumentar acentuadamente, espere até que a corrente se estabilize com um aumento de 5% em 10 minutos.

Extremamente lenta e suavemente, adicione 40 microlitros de D2O anóxico a 50 por cento do volume no reator eletroquímico usando uma seringa de modo que a concentração seja de 0,5 por cento do volume de D2O no reator. Para evitar danos ao biofilme pela adição de D20, injete o D2O gota a gota. Aguarde a corrente se estabilizar e, posteriormente, adicione o D2O até 4,4% do volume para obter o valor KIE, que é a relação entre a produção atual e a presença de D2O e H2O.

Verifique o efeito do mesmo volume de adição de H2O na produção atual. Aqui, a linha sólida é o resultado representativo para a mudança de corrente microbiana induzida pela adição de D2O. A adição de D2O diminuiu drasticamente a corrente microbiana em 10 segundos, enquanto o H20 quase não teve diminuição da corrente, como mostrado com a linha pontilhada.

Para confirmar que a diminuição da corrente observada por D2O é atribuível ao transporte de elétrons através dos citocromos da membrana externa, um mediador de elétrons difusor foi usado. Aqui, a adição de 100 alfa-AQS micromolares aumentou a produção atual em mais de cinco vezes e a produção atual não foi afetada pela adição de D2O. Esses resultados indicam que a cinética das reações metabólicas é rápida o suficiente para que o processo de transferência de elétrons extracelular seja limitante de taxa.

Um método alternativo para avaliar isso é a adição da molécula de flavina ao reator eletroquímico. Um aumento instantâneo da corrente anódica pela adição de flavina indica limitação de taxa pelo processo de transporte de elétrons através de citocromos de membrana externa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como examinar o efeito do isótopo cinético no processo de transporte de elétrons extracelular.

O ponto mais crítico para obter com sucesso o efeito de isótopo cinético é esclarecer e confirmar a condição em que o transporte de elétrons através dos citocromos da membrana externa limita a taxa de produção de corrente. Neste vídeo, apresentamos dois métodos para confirmar essa condição, observação da mudança de corrente por adição de flavina e por adição de mediador extra difusor, como alfa-AQS. Uma vez confirmada a limitação de taxa, este sistema pode ser usado não apenas para o experimento de deutério, mas também para a caracterização bioquímica de citocromos de membrana externa.

Além disso, este protocolo pode ser aplicável ao exame de outros micróbios eletroativos, desde que o processo de transporte de elétrons extracelular seja limitador de taxa. Nossa metodologia fornece uma técnica básica e geral para investigar o processo de transporte de elétrons extracelulares via citocromos da membrana externa in vivo.