Name: Eletroquímico deteção de deutério cinética efeito isotópico no transporte de elétrons extracelular em Shewanella oneidensis MR-1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a detectar o efeito isotópico cinético do deutério para estudar o transporte de prótons na transferência extracelular de elétrons em Shewanella oneidensis MR-1. Este método revela o impacto do transporte de prótons na cinética do EET.

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Este trabalho é apoiado financeiramente por um subsídio para investigação especialmente promovido da sociedade para a promoção da ciência (JSPS) número de concessão KAKENHI 24000010, 17H 04969, Japão e JP17J02602, nos escritório do Naval Research Global (N62909-17-1-2038). Y.T. é um pesquisador de JSPS e apoiado por JSPS através do programa para liderar graduação escolas (mérito).

1. formação de um biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 em um eletrodo de ITO (Figura 1)
Nota: Para evitar a contaminação do reator eletroquímico com outros micróbios, toda a mídia, Implementos e componentes do reator eletroquímico devem ser esterilizadas com antecedência. Quando usando células S. oneidensis MR-1 e construir os reatores eletroquímicos, devem efectuar-se todos os procedimentos em uma bancada limpa.
<ol><li>Cultivo de células de S. oneidensis MR-1 Nota: Um biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 foi formado em um ITO eletrodo as condições a seguir relatado anteriormente4.<ol>
<li>Para o cultivo de células de S. oneidensis MR-1, adicione uma colônia de S. oneidensis MR-1 cultivadas em uma placa de ágar compreendendo Luria-Bertani (LB) (20 g/L) e bacto ágar (15 g/L) em 15 mL de meio LB (20 g/L) a 30 ° C por 24 h em condições aeróbias, com agitação a 160 rpm.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 6.000 × g por 10 min e resuspenda o pellet de células resultante em 15 mL de meio definido (pH 7,8) (DM: NaHCO3 [2,5 g/L], O [0,08 g/L], CaCl2·2H2NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L] e 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ácido etanesulfónico [HEPES; 7,2 g/L]), completados com lactato de 10 mM e 0,5 g/L de extrato de levedura como fonte de carbono e oligoelementos para S. oneidensis MR-1 , respectivamente.</li>
		<li>Além disso, cultivar a suspensão de eritrócitos por via aeróbia a 30 ° C, por 12 h com agitação a 160 rpm e centrifugar novamente a 6.000 × g por 10 min. Lave o centrifugado resultante duas vezes com DM médio por centrifugação por 10min a 6.000 g × antes da eletroquímica experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construção de um reator eletroquímico do três-elétrodo (Figura 1)<ol>
<li>Colocar um substrato ITO como o eletrodo de trabalho na parte inferior do reator.</li>
		<li>Posteriormente, inserir um cilindro de vidro (diâmetro de 2 cm) e um cover de politetrafluoretileno (PTFE). Em seguida inserir Ag/AgCl (KCl saturado) e um fio de platina no reator como os eletrodos de referência e contador, respectivamente. Nota: Para evitar o vazamento de ar e solução, insira uma folha de borracha butílica entre cada componente.</li>
		<li>Adicione 4,0 mL de DM suplementado com lactato de 10 mM e extracto de levedura 0,5 g/L no reator eletroquímico.</li>
		<li>Depois de confirmar que não há nenhum vazamento do reator eletroquímico, fluxo do gás do nitrogênio no reator eletroquímico mais 20 min para manter condições anaeróbicas dentro do reator eletroquímico. Nota: Para evitar a contaminação com outros micróbios, o gás deve ser filtrado antes de ela flui para o reator eletroquímico.</li>
		<li>Conectar o reator eletroquímico para um potentiostat e aplicar 0,4 V (contra eletrodo padrão de hidrogênio, ela) para o eletrodo de ITO, mantendo a temperatura do reator eletroquímico a 30 ° C, usando um sistema de circulação de água externa. Nota: Para evitar o efeito de um campo elétrico externo, o reator eletroquímico deve ser colocado em uma gaiola de Faraday.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eletroquímico cultivo de S. oneidensis MR-1 células (Figura 1 e Figura 2)<ol>
<li>Ajustar a densidade da célula da suspensão obtida na etapa 1.1 para uma densidade óptica de 1,43 a 600 nm (OD600) com DM, complementada pela levedura de lactato e 0,5 g/L de 10mm extrair. Nota: Para obter o correto OD600, aplica a suspensão de células de OD600 ≤ 0.8 a um espectrómetro de UV-vis antes de ajustar o OD600 para 1,43.</li>
		<li>Adicionar 0,3 mL de suspensão de células no reator eletroquímico através do orifício de injeção usando uma seringa: o OD600 no reator muda para 0,1. Nota: A adição de 0,3 mL de suspensão de células com OD600 = 1,43 em reator eletroquímico contendo 4,0 mL resultados médios em 4,3 mL de solução com uma OD600 = 0.1. Ao utilizar outros reactores com volumes diferentes, o cálculo da densidade celular é necessário.</li>
		<li>Continue a aplicação potencial em 0,4 V (contra ela) para o eletrodo de ITO para 25 h. Nota: Para a formação de um biofilme monocamada sobre um eletrodo de ITO, certifique-se que a corrente produzida apresenta um desvio inferior a 50% da Figura 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. substituição do líquido sobrenadante com meio fresco de DM com lactato de 10 mM (Figura 3)
<ol><li>Interromper o aplicativo potencial e desconecte o potentiostat e o sistema de circulação de água do reator eletroquímico.</li>
	<li>Substituição do líquido sobrenadante com meio fresco de DM com 10 mM de lactato<ol>
<li>Fluxo do gás do nitrogênio em um frasco contendo DM com 10 mM de lactato mais 20 min para remover o oxigênio do meio.</li>
		<li>Remova lentamente todo o sobrenadante dentro do reator eletroquímico, usando uma seringa, fluindo sob o gás nitrogênio (Figura 3a, b). Nota: Para evitar a interrupção do biofilme sobre o eléctrodo ITO pelo gás do nitrogênio, o gás deve fluir acima da superfície do líquido.</li>
		<li>Adicione 4,0 mL de DM fresco contendo lactato de 10 mM, usando uma seringa (Figura 3C). Nota: Para evitar a interrupção do biofilme sobre o eléctrodo de ITO, injete lentamente o médio ao longo da parede do reator eletroquímico. Para manter o biofilme molhado, o meio deve ser adicionado imediatamente após a remoção do sobrenadante. Injeção do médio até 1 min após a remoção do sobrenadante não afeta a produção atual do biofilme de S. oneidensis MR-1.</li>
		<li>Inclinar o reator eletroquímico para remover todo o sobrenadante fixado na parede do reator eletroquímico.</li>
		<li>Repita as etapas 2.2.2-2.2.4 três vezes no total.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Parar o fluxo de gás e conectar o reator eletroquímico para a potentiostat novamente, aplicando 0,4 V (contra ela) para o eletrodo de ITO no 303 K.</li>
</ol>3. adição de água de deutério para medir a KIE sobre o processo EET (Figura 4)
<ol><li>Confirme que a produção atual de um biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 é estável e não aumenta rapidamente. Se a corrente aumenta abruptamente, espere até que a corrente se estabiliza em um aumento de 5% mais de 10 min. Nota: A formação de um biofilme monocamada sobre um eletrodo de ITO, sem contaminação de outras cepas microbianas foi confirmada por sequências de rDNA e uma imagem de elétrons varredura microscópica do biofilme sobre um eletrodo de ITO, como relatado anteriormente4. Para confirmação da limitação taxa pelo processo de EET, monitore o efeito da adição de shuttling mediadores de elétrons como a 100 µM antraquinona-1-sulfonato (α-AQS). Consulte a seção de Resultados de representante e referência15 para maiores detalhes.</li>
	<li>Adicione 40 µ l de 50% (v/v) anóxica D2O no reator eletroquímico utilizando uma seringa de tal forma que a concentração é de 0,5% (v/v) D2O no reator. Nota: Para evitar danificar o biofilme por adição de2O D, injete o D2O drop-wise.</li>
	<li>Esperar a corrente estabilizar e posteriormente adicionar a D2O até 4,0% (v/v). Nota: Para obter o valor KIE (a taxa de produção atual na presença de D2O e H2O), verificar o efeito do mesmo volume de adição de H2O na produção atual.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Nosso ensaio eletroquímico de célula inteira tem várias vantagens técnicas em comparação com eletroquímica de proteína. Enquanto a purificação de proteínas requer várias etapas procedimentos demorados, nosso método de célula inteira leva um dia de formação de biofilmes auto-organizado após a cultura de células. Para obter uma interacção estável entre OM c- Cyts e o eletrodo, precisamos apenas de esterilização e limpeza da superfície do eletrodo; não exige modificação de eletrodos para organizar a orientação das ...

Surgiram recentemente Técnicas eletroquímicas para caracterizar diretamente uma proteína redox em uma célula bacteriana intacta desde a descoberta de cepas microbianas redução de metal, como S. oneidensis MR-1 ou Geobacter sulfurreducens PCA, que tem complexos de citocromo c-tipo de membrana externa (c-Cyts OM) expostos à célula exterior1,2,3,4,5. O OM c- Cyts mediar o transporte de elétrons da cadeia respiratória para substratos sólidos localizado extracelularmente. Este transporte é referido como transporte de elétrons extracelular (EET)1,6 e é um processo crítico para biotecnologias emergentes, tais como células de combustível microbianas6. Portanto, para entender a cinética EET subjacente e mecanismos e a sua ligação à fisiologia microbiana, OM c -Cyts foram investigados usando toda a célula eletroquímica4,7, combinado com microscopia 8 , 9, espectroscopia de10,11e biologia molecular2,4. Em contraste, métodos para investigar o impacto do transporte de cátion EET-associados, por exemplo, os prótons, na cinética EET em células vivas foram mal estabelecidos, apesar do transporte de protões através das membranas bacterianas, tendo um papel crítico sinalização, homeostase e energia produção12,13,14. No presente estudo, descrevemos uma técnica para examinar o impacto do transporte de prótons na cinética EET em S. oneidensis MR-1 célula usando medições eletroquímicas célula inteira, que requer a identificação da etapa limitante de produção atual de microbiana15.
Uma maneira direta para avaliar a contribuição do transporte de prótons sobre a EET associado é o efeito de cinética isótopo deutério (KIE). A KIE é observável como a mudança na cinética de transferência de elétrons sobre a substituição de prótons com íons de deutério, que representa o impacto do transporte de prótons na transferência de elétrons cinética16. A teoria de KIE em si bem estabeleceu usando medições eletroquímicas com enzimas purificada17. No entanto, desde que a produção atual em S. oneidensis MR-1 resulta do múltiplo, processos diversos e flutuação18, um não pode simplesmente identificar EET como o processo limitante. Para observar o KIE em processos de transporte de prótons juntamente com EET, precisamos confirmar que a atual produção microbiana é limitada pelo transporte de elétrons através de OM c- Cyts para o eletrodo. Para este efeito, substituímos a solução sobrenadante por meio fresco, que contém uma alta concentração de lactato como doador de elétron no pH ideal e as condições de temperatura antes da medição KIE; Esta substituição serviu dois papéis: (1) reforçada a taxa dos processos metabólicos montante em comparação com a EET e (2) omitido as células de natação no sobrenadante libertado o biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 sobre o trabalho do eléctrodo ( eletrodo de estanho dopado com óxido (ITO) índio). O protocolo detalhado apresentado destina-se a ajudar novos praticantes manter e confirmar que o processo EET é o passo determinante de taxa.

<table><tbody><tr><td>Cilindro de vidro</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Feito sob medida, usado como reator eletroquímico</td></tr><tr><td>Tampa e base de PTFE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Feito sob medida, usado como cobertura e fundação do reator eletroquímico</td></tr><tr><td>Borracha butílica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Feito sob medida, inserido entre cada componente do reator eletroquímico</td></tr><tr><td>Septa</td><td>GL Science</td><td>3007-16101</td><td>Usado como uma porta de injeção do reator eletroquímico</td></tr><tr><td>Eletrodo de óxido dopado com estanho de índio (ITO)</td><td>GEOMATEC</td><td>No.0001</td><td>Usado como um eletrodo de trabalho, eletrodo saturado de 5&Omega;/sq</td></tr><tr><td>Ag/AgCl KCl</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HX-R5</td><td>Usado como um eletrodo de referência, &Phi; Fio de platina de 0,30 mm</td></tr><tr><td></td><td>A Nilaco Cooporation</td><td>PT-351325</td><td>Usado como contra-eletrodo</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) Broth, Miller</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>244620</td><td>Meio para pré-cultivo de S. oneidensis MR-1</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antraquinona-1-sulfonato (&alpha;-AQS)</td><td>TCI</td><td>A1428</td><td></td></tr><tr><td>Mononucleotídeo de flavina (FMN)</td> <td>Wako</td><td>184-00831</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO 3 </td> <td>Wako</td><td>191-01305</td><td>Usado para meio definido (DM)</td></tr> <tr><td>CaCl2 &middot; 2H 2 O</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>Usado para DM</td></tr><tr><td>NH 4 Cl</td><td>Wako</td><td>011-03015</td><td>Usado para DM</td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td>Usado para DM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>Usado para DM</td></tr><tr><td>2- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] ácido etanossulfônico (HEPES)</td> <td>DOJINDO</td><td>346-08235</td><td>Usado para</td></tr><tr><td>DM Solução de Lactato de Sódio</td><td>Wako</td><td>195-02305</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Levedura Bacto</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deutério (D, 99,9%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-4-PK</td><td>Aditivo para experimentos de efeito de isótopos cinéticos</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.</td><td>LTI-601SD</td><td>usado para o abanador TAITEC</td></tr><tr><td></td><td></td><td>NR-3</td> do pré-cultivo usado para a máquina TOMY SEIKO CO. LTD. do <td>autoclave do pré-cultivo</td></tr><tr><td></td><td></td><td>LSX-500</td><td>Usado para esterilização do reator eletroquímico e do meio</td></tr><tr><td>Bancada limpa</td><td>SANYO</td><td>MCV-91BNF</td><td>Usado para evitar a contaminação do reator eletroquímico e do meio com outros micróbios</td></tr><tr><td>Separador de centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>Velocidade de rotação de até 6000&times; g é necessário</td></tr><tr><td>Gerador de gás nitrogênio</td><td>Puequ CO. LTD.</td><td>PNTN-2</td><td>O cilindro de gás nitrogênio também pode ser usado em vez do gerador de gás</td></tr><tr><td>Espectrômetro UV-vis</td><td>SHIMADZU</td><td>UV-1800</td><td>Usado para otimização da densidade celular</td></tr><tr><td>Potenciostato</td><td>BioLogic</td><td>VMP3</td><td>Usado para formação de biofilme e experimentos de efeito de isótopos cinéticos</td></tr><tr><td>Circulador de água térmica</td><td>COMO UM</td><td>TR-1A</td><td>Usado para manutenção da temperatura do reator eletroquímico</td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HS-201S</td><td>Usado para experimentos eletroquímicos</td></tr></tbody></table>

eletroquímico deteção de deutério cinética efeito isotópico no transporte de elétrons extracelular em shewanella oneidensis mr-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direto de deteção eletroquímica de c-tipo complexos citocromo embutidos na membrana externa bacteriana (membrana externa c-tipo complexos citocromo; OM c- Cyts) tem recentemente emergiu como um método analítico de células inteiras romance para caracterizar o bacteriano transporte de elétrons da cadeia respiratória para o exterior da célula, referido como o transporte de elétrons extracelular (EET). Enquanto o caminho e a cinética do fluxo de elétrons durante a reação de EET têm sido investigados, um método eletroquímico de células inteiras para examinar o impacto do transporte de cátion associado com EET não ainda foi estabelecido. No presente estudo, um exemplo de uma técnica bioquímica para examinar o efeito de cinética isótopo deutério (KIE) sobre EET através de OM c- Cyts usando um micróbio de modelo, Shewanella oneidensis MR-1, é descrita. A KIE sobre o processo EET pode ser obtido se a EET através de OM c- Cyts atua como o passo limitante na produção atual microbiana. Para o efeito, antes da adição de D2O, o sobrenadante foi substituído com mídia fresca contendo uma quantidade suficiente do doador de elétron para suportar a taxa de upstream reações metabólicas e para remover as células planctônicas de um uniforme monocamada biofilme sobre o eletrodo de trabalho. Métodos alternativos para confirmar o limitante passo na produção atual microbiana como EET através de OM c- Cyts também são descritos. Nossa técnica de um ensaio eletroquímico células inteiras para investigar a cinética de transporte de prótons pode ser aplicada a outras cepas microbianas eletroativos.

Após 25 h de potencial aplicação em 0,4 V (contra ela), formou-se um biofilme monocamada sobre o eletrodo de trabalho de vidro de ITO, que anteriormente foi confirmado por uma microscopia eletrônica ou uma microscopia confocal4. O curso de tempo representativa da atual produção do S. oneidensis MR-1 durante a formação de um biofilme monocamada é mostrado na Figura 2. Embora a corrente altera em cada medição, a corrente produzi...

Aqui nós apresentamos um protocolo de toda a célula eletroquímicos experimentos para estudar a contribuição do transporte de protões para a taxa de transporte de elétrons extracelular através do membrana externa citocromos complexos em Shewanella oneidensis MR-1.

Eletroquímico deteção de deutério cinética efeito isotópico no transporte de elétrons extracelular em Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

O objetivo geral deste protocolo é observar a contribuição do transporte de prótons para a taxa de transporte de elétrons extracelulares bacterianos pela detecção do efeito do isótopo cinético de deutério. Nosso método revela o impacto do transporte de prótons na cinética do transporte de elétrons extracelular ou EET de bactérias para um eletrodo via citocromos do tipo c da membrana externa. Nosso ensaio reflete o manejo de prótons nativos no EET porque usamos bactérias vivas em vez de enzimas purificadas.No entanto, nosso desafio era remover os ruídos de outros processos celulares. O efeito do isótopo cinético de deutério denominado KIE é uma das melhores técnicas para examinar a contribuição do transporte de prótons no processo de transporte de elétrons associado. Para cultivar células Shewanella MR-1, transfira uma colônia das células cultivadas em uma placa de ágar para 15 mililitros de meio LB.Cultive as células a 30 graus Celsius por 24 horas em condições aeróbicas com agitação a 160 rpm. Centrifugue a suspensão da célula a 6.000 vezes a gravidade por 10 minutos. Em seguida, ressuspenda o pellet celular resultante em 15 mililitros de Meio Definido, suplementado com lactato 10 milimolar como fonte de carbono e 0,5 gramas por litro de extrato de levedura como oligoelementos para as células.Depois de cultivar ainda mais a suspensão celular aeróbica a 30 graus Celsius por 12 horas com agitação a 160 rpm, centrifugue novamente a 6.000 vezes a gravidade por 10 minutos. Lave o pellet de célula resultante duas vezes com meio DM por centrifugação por 10 minutos a 6.000 vezes a gravidade antes do experimento eletroquímico. Para construir um reator eletroquímico de três eletrodos, coloque um substrato ITO como eletrodo de trabalho na parte inferior do reator.Em seguida, insira um cilindro de vidro e uma tampa de politetrafluoretileno e insira um fio de platina como contra-eletrodo. Em seguida, insira um eletrodo de cloreto de prata no reator como eletrodo de referência. Em seguida, adicione quatro mililitros de MS suplementados com lactato 10 milimolar e 0,5 gramas por litro de extrato de levedura no reator eletroquímico.Depois de confirmar que não há vazamento do reator eletroquímico, flua o gás nitrogênio para o reator eletroquímico por mais de 20 minutos para manter as condições anaeróbicas dentro do reator eletroquímico. Conecte o reator eletroquímico a um potenciostato e aplique um positivo de 0,4 volts ao eletrodo ITO, mantendo a temperatura do reator eletroquímico em 30 graus Celsius usando um sistema externo de circulação de água. Para realizar o cultivo eletroquímico, primeiro ajuste a densidade celular da suspensão para uma densidade óptica de 1,43 a 600 nanômetros com DM suplementado por 10 milimolares de lactato e 0,5 gramas por litro de extrato de levedura.Adicione 0,3 mililitros da suspensão celular ao reator eletroquímico através da porta de injeção usando uma seringa. O OD 600 no reator muda para 0,1. Continue a aplicação potencial em 0.4 volts positivos no eletrodo ITO por 25 horas.Pare a aplicação potencial e desconecte o reator eletroquímico do potenciostato e do sistema de circulação de água. Flua o gás nitrogênio para uma garrafa contendo DM com lactato 10 milimolar durante 20 minutos para remover o oxigênio do meio. Agora, extremamente lenta e suavemente, remova todo o sobrenadante de dentro do reator eletroquímico usando uma seringa sob o fluxo de gás nitrogênio.Em seguida, adicione quatro mililitros de MS fresco contendo 10 milimolares de lactato usando uma seringa. Incline o reator eletroquímico para remover todo o sobrenadante na parede do reator. Repita essas etapas três vezes no total.Pare o fluxo de gás e conecte o reator eletroquímico ao potenciostato novamente, aplicando um positivo de 0,4 volts ao eletrodo ITO a 303 Kelvin. Confirme se a produção atual de um biofilme monocamada de Shewanella MR-1 é estável e não aumenta rapidamente. Se a corrente aumentar acentuadamente, espere até que a corrente se estabilize com um aumento de 5% em 10 minutos.Extremamente lenta e suavemente, adicione 40 microlitros de D2O anóxico a 50 por cento do volume no reator eletroquímico usando uma seringa de modo que a concentração seja de 0,5 por cento do volume de D2O no reator. Para evitar danos ao biofilme pela adição de D20, injete o D2O gota a gota. Aguarde a corrente se estabilizar e, posteriormente, adicione o D2O até 4,4% do volume para obter o valor KIE, que é a relação entre a produção atual e a presença de D2O e H2O.Verifique o efeito do mesmo volume de adição de H2O na produção atual. Aqui, a linha sólida é o resultado representativo para a mudança de corrente microbiana induzida pela adição de D2O. A adição de D2O diminuiu drasticamente a corrente microbiana em 10 segundos, enquanto o H20 quase não teve diminuição da corrente, como mostrado com a linha pontilhada.Para confirmar que a diminuição da corrente observada por D2O é atribuível ao transporte de elétrons através dos citocromos da membrana externa, um mediador de elétrons difusor foi usado. Aqui, a adição de 100 alfa-AQS micromolares aumentou a produção atual em mais de cinco vezes e a produção atual não foi afetada pela adição de D2O. Esses resultados indicam que a cinética das reações metabólicas é rápida o suficiente para que o processo de transferência de elétrons extracelular seja limitante de taxa.Um método alternativo para avaliar isso é a adição da molécula de flavina ao reator eletroquímico. Um aumento instantâneo da corrente anódica pela adição de flavina indica limitação de taxa pelo processo de transporte de elétrons através de citocromos de membrana externa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como examinar o efeito do isótopo cinético no processo de transporte de elétrons extracelular.O ponto mais crítico para obter com sucesso o efeito de isótopo cinético é esclarecer e confirmar a condição em que o transporte de elétrons através dos citocromos da membrana externa limita a taxa de produção de corrente. Neste vídeo, apresentamos dois métodos para confirmar essa condição, observação da mudança de corrente por adição de flavina e por adição de mediador extra difusor, como alfa-AQS. Uma vez confirmada a limitação de taxa, este sistema pode ser usado não apenas para o experimento de deutério, mas também para a caracterização bioquímica de citocromos de membrana externa.Além disso, este protocolo pode ser aplicável ao exame de outros micróbios eletroativos, desde que o processo de transporte de elétrons extracelular seja limitador de taxa. Nossa metodologia fornece uma técnica básica e geral para investigar o processo de transporte de elétrons extracelulares via citocromos da membrana externa in vivo.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Descreve-se um método de ensaio de sensor electroquímico para a detecção bacteriana rápida e identificação. O ensaio envolve uma matriz de sensores funcionalizada com as sondas de DNA para o RNA de captura de oligonucleótidos (rRNA) sequências específicas das espécies ribossomal. Sandwich de rRNA alvo de hibridação com a sonda de captura e uma sonda detectora de peroxidase de rábano ligada ao oligonucleótido de DNA produz uma corrente mensurável amperométrica.

Bacteriana Detecção e Identificação Utilizando sensores eletroquímicos

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Medindo o efeito do isótopo cinético no transporte de elétrons microbianos usando óxido de deutério

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Caracterizando o transporte de elétrons através de biofilmes vivos

flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.

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Este protocolo apresenta ensaio rápido de suscetibilidade antimicrobiana (AST) em até 2,5 h por imagem de espalhamento Raman estimulado por célula única do metabolismo de D2O. Este método aplica-se a bactérias no ambiente urinário ou no sangue total, o que é transformador para AST fenotípica de célula única rápida na clínica.

Teste Rápido de Suscetibilidade a Antimicrobianos por Imagem de Dispersão Raman Estimulada da Incorporação de Deutério em uma Única Bactéria

Como técnica analítica, a eletroquímica de nanoimpacto, uma abordagem cada vez mais importante para a contagem e caracterização de partículas eletro-inativas em escala nanométrica, sofre de baixa precisão devido às distribuições de corrente heterogêneas que surgem do uso de ultramicroeletrodos. Delinea-se aqui uma abordagem generalizada, denominada "interrupção eletrocatalítica", que aumenta a precisão em tais medições.

Dimensionamento eletroquímico preciso de partículas eletro-inativas individuais

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Caracterização da transferência de elétrons extracelular mediada em bactérias do ácido lático com um sistema bioeletroquímico de três eletrodos e duas câmaras

Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de transistores eletroquímicos orgânicos (OECTs) para traduzir a atividade de transferência de elétrons extracelulares (EET) em Shewanella oneidensis em sinais elétricos. O sistema OECT híbrido oferece maior robustez, sensibilidade e potencial para testes rápidos e de alto rendimento, tornando-o uma ferramenta eficaz para medições de EET.

Traduzindo atividades de transferência de elétrons extracelulares com transistores eletroquímicos orgânicos

Aprenda a detectar o efeito isotópico cinético do deutério para estudar o transporte de prótons na transferência extracelular de elétrons em Shewanella oneidensis MR-1. Este método revela o impacto do transporte de prótons na cinética do EET.

Eletroquímico deteção de deutério cinética efeito isotópico no transporte de elétrons extracelular em Shewanella oneidensis MR-1 (Vídeo) | JoVE Journal

Eletroquímico deteção de deutério cinética efeito isotópico no transporte de elétrons extracelular em Shewanella oneidensis MR-1

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