Name: Um direcionamento-GPC3 anticorpo Bispecific, GPC3-S-Fab, com potente citotoxicidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a produzir o anticorpo bispecífico GPC3-S-Fab em Escherichia coli para pesquisa em imunoterapia do câncer hepático. Este método permite purificação simplificada e demonstra citotoxicidade potente contra células de carcinoma hepatocelular.

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Este trabalho foi apoiado financeiramente pela R & D plano da província de Guangdong (China PR) (2016A050503028).

Todos os procedimentos, incluindo a coleta de sangue humano foram aprovados pelo Comitê de ética Sun Yat-Sen University.
1. GPC3-S-Fab Design Estratégia
<ol><li>Projeto GPC3-S-Fab, vinculando um Fab de anti-GPC3 (humanizado GC3313) com um anti-CD16 VHH14 (Figura 1).</li>
	<li>Sintetizar e clonar o CH1-VHH-CD16-VH e VL-CL em vetores pET26b e pET21a, como relatado anteriormente,12.</li>
</ol>2. transformação e cultura
<ol><li>Adicionar 100 ng de pET26b contendo VH-CH1-CD16 (figura 1A) e 100 ng de pET21a contendo VL-CL (figura 1A) em 100 µ l de competente BL21 (DE3) células. Misture bem e incubar no gelo por 30 min. Incubar em banho-maria para 45-90 s, transferência, 42 ° C e incubar no gelo por 3-5 min.</li>
	<li>Adicionar 500 µ l de meio de caldo de carne (LB) lisogenia num tubo contendo BL21 (DE3) cells e então incubar a 37 ° C, 150 rpm de 45-60 min. espalhar 100 µ l de BL21 (DE3) células na LB-ágar placas contendo 50 µ g/mL de canamicina e 100 µ g/mL de ampicilina e então incubar a 37 ° C, durante 12-16 h.<ol>
<li>Prepare lisogenia suporte de caldo (LB): 1% wt/vol triptona, extrato de levedura 0,5% vol/wt, wt/vol. 1% NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inocule as células de uma única colônia em 5 mL de meio de caldo super (SB), contendo 50 µ g/mL de canamicina e 100 µ g/mL de ampicilinae cultura a 37 ° C, 220 rpm, durante a noite. Em seguida, inocule 1 mL da cultura em 100 mL de meio de SB contendo 50 µ g/mL de canamicina e 100 µ g/mL de ampicilina e cultura a 37 ° C, 220 rpm para 4 h. Em seguida, transferi 10 mL da cultura para 1 L de meio de SB contendo 50 µ g/mL de canamicina e 100 µ g/mL de ampicilina e cultura a 37 ° C, 220 rpm.<ol>
<li>Prepare caldo super suporte: 3,2% wt/vol triptona, wt/vol. 2% de extrato de levedura, wt/vol. 0.5% NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando o OD600 atinge 0,6 - 0,8, adicionar isopropil-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) a uma concentração final de 0,2 mM. Cultura a 16 ° C, 180 rpm para 36-48 h para expressão periplasmático.</li>
</ol>3. GPC3-S-Fab periplasmático purificação
<ol><li>Preparação de fração periplasmático<ol>
<li>Coletar as células por centrifugação a 4.000 x g, 4 ° C por 30 min, descartar o meio e pesar as células.</li>
		<li>Ressuspender as células completamente em 4 mL de solução de sacarose gelada (20mm de Tris-HCl, pH 7,5; 25% (wt/vol) de sacarose e 1 mM de EDTA) por grama de células e incubar no gelo por 15 min.</li>
		<li>Centrifugar a 8.500 x g (centrífuga de mesa, rotor de ângulo fixo), 4 ° C por 20 min. Retire o sobrenadante (a fração da sacarose) e salve-o no gelo.</li>
		<li>Resuspenda as bolinhas em uma mistura de gelado 5 mM de MgCl2 e 1mm de PMSF (4 mL por grama de células). Adicionar 40 µ l da unidade populacional de lisozima (15 mg/mL) por grama e incubar no gelo por 30 min.</li>
		<li>Centrifugar a 8.500 x g (centrífuga de mesa, fixada do rotor ângulo), 4 ° C por 20 min. transferência do sobrenadante (a fração periplasmático) e salve-o no gelo.</li>
		<li>Combinar a fração da sacarose e fração periplasmático e centrifugar a 30.000 x g, 4 ° C por 30 min. Retire o sobrenadante e salvá-lo em um tubo cónico de 50 mL no gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificação da afinidade NI-NTA<ol>
<li>Resuspenda 1ml de agarose Ni-NTA misturando cuidadosamente para obter uma suspensão homogênea, retire 1 mL de Ni-NTA agarose para um tubo cónico de 15 mL e juntar 10 volumes (CV) de coluna equilibração tampão (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 1m de NaCl) para equilibrar.</li>
		<li>Centrifugar a 400 x g por 5 min e remover o sobrenadante cuidadosamente. Em seguida, adicione o agarose Ni-NTA para o tubo de 50 mL contendo a fração da sacarose e fração periplasmático. Rocha a 4 ° C por 2 h.</li>
		<li>Centrifugue a mistura a 400 x g, 4 ° C por 5 min. Retire com cuidado o sobrenadante para outro tubo gelado fresco como a fração não acoplado. Transferi o agarose Ni-NTA uma coluna de gravidade.</li>
		<li>Adicionar 10 CV de tampão de lavagem (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 1m de NaCl; 20 mM, 30 ou 40 mM do imidazol) para a coluna e coletar a elute como a fração de lavagem. Nota: Estas soluções devem ser adicionadas na ordem de concentrações crescentes de imidazol.</li>
		<li>Adicionar 3 CV de eluição (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 300 mM de NaCl; 100mm, 200mm, 300mm ou 400mm de imidazol) do buffer para a coluna e coletar a elute como fração de eluição, 1, 2, 3 e 4. Nota: Estas soluções devem ser adicionadas na ordem de concentrações crescentes de imidazol.</li>
		<li>Diálise as frações eluted em 2 L de PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM Na2HPO4, 2mm de KH2PO4, pH 7,4) usando a tubulação da diálise (12.4 kDa) a 4 ° C por 2 h. verificar a presença de GPC3-S-Fab em 12% SDS-PAGE e em seguida por Coloração azul de Coomassie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificação da afinidade de igG-CH1<ol>
<li>Transferir 1 mL de resina de afinidade de IgG-CH1 para um tubo cónico de 50 mL e lave os grânulos com PBS primeiro. Em seguida, adicione a solução dializada contendo GPC3-S-Fab após etapa 3.2.6. Rocha a 4 ° C por 2 h.</li>
		<li>Centrífuga a 400 x g por 5 min, 4 ° C. Cuidadosamente Retire o sobrenadante para outro tubo gelado fresco e transferir a resina para uma coluna de gravidade.</li>
		<li>Adicionar 10 CV de lavagem buffer (PBS) para a coluna e recolher a eluição como a fração de lavagem.</li>
		<li>Prepare os tubos de coleta, acrescentando 1 M de Tris pH 9.0 (0,1 mL de cada fração eluted por mL). Eluir com tampão de eluição 3 CV (0,1 M de glicina-HCl, pH 2.7) e recolher a fração eluted; repeti 3 vezes.</li>
		<li>Diálise, as frações eluted em 2 L de PBS usando a tubulação da diálise (12.4 kDa) a 4 ° C por 2 h. repetir duas vezes.</li>
		<li>Determinar a concentração de proteína por ultramicrospectrophotometer (coeficiente de extinção Molar: 91105. um 1280 = 0,69 mg/L).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SDS-PAGE e Western Bloting análise
<ol><li>Levar um 10 µ l da amostra em 5x do amortecedor do carregamento SDS e misture bem. Ferva a mistura de proteína a 100 ° C por 5 min.<ol>
<li>Prepare-se 5 x amortecedor do carregamento SDS: 250 mM de Tris-HCl, pH 6,8, wt/vol. 10% SDS, 0,5% wt/vol azul de bromofenol, 50% vol/vol glicerol, 5% vol/vol beta-Mercaptoetanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare um gel de SDS-PAGE com um gel de carregamento (5%) e o gel de separação (12%) como descrito anteriormente,26,,27,28.</li>
	<li>10 µ l da mistura cozida da proteína e proteína de carregar e executar o SDS-PAGE.</li>
	<li>Manchar o gel por agitação por 20 min com solução de azul brilhante de Coomassie e em seguida, executar a descoloração.</li>
	<li>Para a mancha ocidental, após ser transferido para uma membrana PVDF, bloquear a membrana com TBST (20mm de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,1% vol/vol Tween 20) + 5% wt/vol desnatar o leite por 1h à temperatura ambiente e agitando.</li>
	<li>Incubar a membrana com anticorpos primários (antisua ou anti-Flag) diluído 1:2,000 em TBST + 5% de leite desnatado por 1h.</li>
	<li>Lavar com TBST por 5 min à temperatura ambiente e repetir 3 vezes.</li>
	<li>Incube a membrana em 1:2,000 anticorpo secundário (anticorpo Fc HRP-lig anti-rato) diluído em TBST + 5% de leite desnatado por 1h.</li>
	<li>Lavar com TBST por 5 min à temperatura ambiente e repetir 3 vezes.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de substrato HPR pela película, desenvolver e captar imagens.</li>
</ol>5. gel filtração análise
<ol><li>Use a seguinte coluna: volume de coluna de 24 mL; Tampão de equilíbrio do pH PBS 7,4; Taxa de fluxo de 0,5 mL/min no quarto temperado; Volume de amostra de 200 µ l.</li>
	<li>Use o seguinte volume de proteína e concentração: 500 µ l de 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Centrifugar a 20.000 x g durante 30 minutos e leva 200 µ l da carregar.</li>
	<li>Para o volume de marcador de proteína e concentração, ter 100 µ l de citocromo C (2 mg/mL, 12.4 kDa), 140 µ l de carbônica (3 mg/mL, 29 kDa), 140 µ l de albumina (10 mg/mL, 66 kDa) e 200 µ l de desidrogenase do álcool (5 mg/mL, 150 kDa) em um tubo. Centrifugar a 20.000 x g durante 30 minutos e leva 200 µ l da carregar.</li>
	<li>Antes de cada corrida, lavar pelo menos 2 CV de água destilada a uma velocidade de 0,5 mL/min.</li>
	<li>Equilibrar a coluna pelo menos 2 CV do buffer de equilibração (PBS, pH 7,4) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min.</li>
	<li>Injete automaticamente a amostra em 0,5 mL/min para carregar a amostra.</li>
	<li>Eluir com buffer de equilibração em 0,5 mL/min e detectar a 215 e 280 nm.</li>
</ol>6. fluxo Cytometry Analysis
<ol><li>Cultura do HepG2 (GPC3 positivo), Hep3B (GPC3 positivo), Huh7 (GPC3 positivo) e células MHCC - 97H (GPC3 negativo) em pratos plásticos 100 x 20 mm, contendo meio DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 µ g/mL) e estreptomicina (50 µ g/mL) a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	<li>Células CHO (GPC3 negativo) cultura e células CHO/GPC3 abrigando completos humano GPC3 cDNA (GPC3 positivo) em pratos plásticos 100 x 20 mm, contendo meio RPMI 1640 com 10% FBS, penicilina (100 µ g/mL) e estreptomicina (50 µ g/mL) a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	<li>Cultura do NK92/CD16 abrigando humanos completos CD16 cDNA (CD16 positivo) em frasco de 25cm2 contendo meio RPMI 1640 com 10% FBS, penicilina (100 µ g/mL) e estreptomicina (50 µ g/mL) a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	<li>Quando as células são 70-90% de confluencia, descartar o meio e lavar as células com 2 mL de PBS. Adicione 1 mL de tripsina 0,25% e incubar a 37 ° C durante 2-3 minutos (ou até que as células começam a se separar da superfície). Adicione 1 mL do meio de crescimento completo para neutralizar a tripsina e ressuspender as células pipetando delicadamente acima e para baixo.</li>
	<li>Contar o número de células usando um hemocytometer de Neubauer e detectar a viabilidade celular por Trypan Blue.</li>
	<li>Colete 3 x 106 células para cada linha de celular. Adicione 1 mL de PBS + 0,2% de BSA para re-suspender as células. Centrífuga a 200 x g, 4 ° C por 5 min. repetir duas vezes.</li>
	<li>Adicionar 0,3 mL de PBS + 0,2% de BSA para re-suspender as células e transferir 100 µ l (aproximadamente 1 milhão) para cada tubo 5 mL de fundo redondo poliestireno. Nota: Por favor, certifique-se de todos os passos daqui para os tubos devem ser mantidos frios no gelo. Quando o anticorpo é vinculativa para o antigénio de superfície da célula, o complexo vai começar a interiorizar. Mantendo-o frio, o processo é abrandado significativamente.</li>
	<li>Adicionar 10 µ l de anticorpos primários (GPC3-S-Fab ou IgG1 humano, a concentração final de 5 µ g/mL) para cada tubo e incubar no gelo por 1h.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de PBS + 0,2% de BSA para lavagem e centrífuga a 200 x g, 4 ° C por 5 min. repetir três vezes.</li>
	<li>Ressuspender em 100 µ l de PBS + 0,2% BSA e então adicione 0,5 µ l de anticorpo secundário (anti-humano IgG(H+L)-488, final concentração 10 µ g/mL) e incubar no gelo por 1 h. Nota: esta etapa, por favor, mantenha as células da luz.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de PBS + 0,2% de BSA para lavagem e centrífuga a 200 x g, 4 ° C por 5 min. repetir três vezes.</li>
	<li>Analise as células pelo citômetro de fluxo, de acordo com o protocolo padrão de29. Adquira as células com um laser de 488 nm para a excitação.</li>
</ol>7. citotóxicos ensaios
<ol><li>Prepare as células do tumor.<ol>
<li>Cultura HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H e CHO células linhas como descrito nos passos 6.1-6.5.</li>
		<li>Diluir as células de 0,5 × 105/mL e 100 µ l células (5.000 por alvéolo) em placas de 96 poços da placa. Cultura de 6-8 h para permitir que as células anexar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare células mononucleares de sangue periférico (PBMC).<ol>
<li>Dilua o sangue fresco preparado, com um volume igual de PBS em um tubo cónico de 50 mL. Por exemplo, dilua 10 mL de sangue com 10 mL de PBS.</li>
		<li>Ter 15 mL do meio de separação de linfócitos em um tubo de cónico de 50 mL. Transferi o sangue diluído no meio de separação de linfócitos ao longo do lado do tubo lentamente. Nota: Mantenha o tubo vertical. Não quebre a superfície do meio de separação de linfócitos.</li>
		<li>Centrifugar a 400 x g durante 35 min à temperatura ambiente, com o freio, fora.</li>
		<li>Lentamente retire a camada superior de plasma e tirar a camada de sangue branco contendo PBMCs na interface médio de separação do plasma-linfócito.</li>
		<li>Diluir os PBMCs com duplo volume de PBS + 2% FBS. Centrifugar a 400 x g durante 5 min.</li>
		<li>Lavar as células duas vezes com PBS + 2% FBS. Centrifugar a 400 x g por 5 min. contar o número de células, conforme descrito na etapa 6.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare células NK.<ol>
<li>Preparar a suspensão de PBMC na concentração de 5 x 107 células/mL de PBS + 2% FBS e lugá-los em um tubo de fundo redondo de poliestireno 5 mL.</li>
		<li>Adicione células NK humana Cocktail de enriquecimento em 50 µ l/mL de células. Misture bem e incubar a temperatura ambiente por 10 min.</li>
		<li>Ressuspender as partículas magnéticas da célula NK kit de enriquecimento e misture bem para garantir que eles estão uniformemente suspensa pipetando cima e para baixo vigorosamente mais de 5 vezes. Transferi as partículas magnéticas ressuspensão em 100 µ l/mL para a suspensão de eritrócitos. Misture bem e incubar a temperatura ambiente por 5 min.</li>
		<li>Traga a suspensão de eritrócitos até um volume total de 2,5 mL adicionando PBS + 2% FBS. Misture as células no tubo pipetando delicadamente acima e abaixo de 2 - 3 vezes. Coloque o tubo (sem a tampa) para o ímã. Deixa os grânulos magnéticos fixarem-se por 2,5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Remova o Magneto. Em um movimento contínuo, inverta o tubo, decantar a suspensão enriquecido de células para um tubo novo.</li>
		<li>Conte o número de células, conforme descrito na etapa 6.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configure a reação citotóxica.<ol>
<li>Dilua as células NK × 10 55 células/ml utilizando o meio de cultura correspondente. Adicione 100 µ l de suspensão de células NK para as células do tumor banhadas em uma placa de 96 poços.</li>
		<li>Adicione 10 µ l de GPC3-S-Fab em diferentes concentrações, com a dose mais elevada em uma concentração final de 30 µ g/mL, 3 vezes diluição, 9 pontos (três repetições).</li>
		<li>Incube a 37 ° C, 5% de CO2 por 72 h.</li>
		<li>Após 72 h de incubação, remover o meio, adicionar 100 µ l de meio DMEM contendo 10 µ l de reagente CCK8 a cada poço em placas de 96 poços e então incubar a 37 ° C.</li>
		<li>Leia a placa a 450 nm a 1, 2, 3 e 4 h após a adição do reagente de CCK8.</li>
		<li>Analise os dados. Calcular a taxa de sobrevivência como (OD450 GPC3-S-Fab + efetoras + tumor - OD450 médio) / (OD450 tumor - OD450 médio) × 100% e (OD450 GPC3-S-Fab + tumor - OD450 médio) / ( tumor de OD450 - OD450 médio) × 100%. As células efetoras são células NK.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li>
<li>Rathi, C., Meibohm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+pharmacology+of+bispecific+antibody+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs.</a> The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).</li>
<li>Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-antigen-binding+bispecific+antibodies+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment.</a> Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).</li>
<li>Demarest, S. J., Glaser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapeutics%2C+antibody+engineering%2C+and+the+merits+of+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Drug+Discovery+and+Development%22%5BJournal%5D)">Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).</li>
<li>Mabry, R., Snavely, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+bispecific+antibodies%3A+The+selection+of+stable+single-chain+fragments+to+overcome+engineering+obstacles%5BTitle%5D)+AND+%22IDrugs%22%5BJournal%5D)">Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles.</a> IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).</li>
<li>Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+interactions+in+the+Fab+fragment%3A+a+comparative+evaluation+of+the+single-chain+Fv+and+Fab+format+engineered+with+variable+domains+of+different+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability.</a> Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).</li>
<li>Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody-based+cancer+therapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Nanobody-based cancer therapy of solid tumors.</a> Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).</li>
<li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments%3A+the+superfluous+luxury+of+paired+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li>
<li>Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Domain+Antibodies+As+Versatile+Affinity+Reagents+for+Analytical+and+Diagnostic+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications.</a> Frontiers in Immunology. 8, 977(2017).</li>
<li>Fernandes, C. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camelid+Single-Domain+Antibodies+As+an+Alternative+to+Overcome+Challenges+Related+to+the+Prevention%2C+Detection%2C+and+Control+of+Neglected+Tropical+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases.</a> Frontiers in Immunology. 8, 653(2017).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bispecific+antibody%2C+S-Fab%2C+induces+potent+cancer+cell+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing.</a> Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-domain+antibody-linked+Fab+bispecific+antibody+Her2-S-Fab+has+potent+cytotoxicity+against+Her2-expressing+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells.</a> AMB Express. 6 (1), 32(2016).</li>
<li>Nakano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-glypican+3+antibodies+cause+ADCC+against+human+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).</li>
<li>Behar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+anti-FcgammaRIII+%28CD16%29+llama+single-domain+antibodies+that+activate+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%2C+Design%2C+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells.</a> Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).</li>
<li>Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22886257">Expression of single-domain antibodies in bacterial systems.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).</li>
<li>Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16408159">Prokaryotic expression of antibodies.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).</li>
<li>Spiess, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies+with+natural+architecture+produced+by+co-culture+of+bacteria+expressing+two+distinct+half-antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies.</a> Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).</li>
<li>Filmus, J., Selleck, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypicans%3A+proteoglycans+with+a+surprise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Glypicans: proteoglycans with a surprise.</a> Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).</li>
<li>Baumhoer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypican+3+expression+in+human+nonneoplastic%2C+preneoplastic%2C+and+neoplastic+tissues%3A+a+tissue+microarray+analysis+of+4%2C387+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).</li>
<li>Llovet, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+signature+to+discriminate+dysplastic+nodules+from+early+hepatocellular+carcinoma+in+HCV+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis.</a> Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).</li>
<li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+glypican-3+expression+differentiates+the+majority+of+hepatocellular+carcinomas+from+benign+hepatic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders.</a> Gut. 48 (4), 558-564 (2001).</li>
<li>Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+a+developmentally+regulated+transcript+MXR7+in+hepatocellular+carcinoma%3A+biological+significance+and+temporospatial+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution.</a> Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).</li>
<li>Flaherty, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclinical+evaluation+of+GMA161--an+antihuman+CD16+%28FcgammaRIII%29+monoclonal+antibody+for+treatment+of+autoimmune+disorders+in+CD16+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice.</a> Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).</li>
<li>Sharma, R., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+phenotypic+and+functional+features+of+NK+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Research%22%5BJournal%5D)">Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans.</a> Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).</li>
<li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+CD16a%2C+the+surface+receptor+of+Kupffer+cells%2C+on+the+growth+of+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li>
<li>Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pouring+and+running+a+protein+gel+by+reusing+commercial+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li>
<li>Feng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutically+targeting+glypican-3+via+a+conformation-specific+single-domain+antibody+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Neste estudo, apresentamos uma estratégia para construir um novo formato de bsAbs, GPC3-S-Fab, que pode recrutar células NK como alvo as células de tumor positivo GPC3. O S-Fab baseia-se a Fab natural formato adicionando um anti-CD16 VHH11,12. Comparado com a região de Fc contendo bsAbs, GPC3-S-Fab pode ser facilmente produzida no periplasm de bactérias em grande escala.
Usando a estratégia de expressão e purificação descrita no protoc...

Os anticorpos monoclonais são agora amplamente utilizados para tratamento de câncer1. Devido à flexibilidade dos anticorpos, vários formatos baseados em anticorpos têm sido ativamente explorados. Comparado com anticorpos monoclonais, bsAbs ter dois módulos de ligação diferente do antígeno, permitindo-lhes a reconhecer dois alvos diferentes simultaneamente e de forma eficiente acionar o recrutamento de células imunes efetoras para alvejar e matar células de tumor2.
Formatos de recombinantes bsAb atual podem ser geralmente atribuídos a duas classes: Fc-contendo bsAbs e bsAbs sem uma região de Fc. Comparado com formatos Fc-contendo principalmente produzidos em células de mamíferos, bsAbs sem uma região Fc tem as vantagens de tamanhos menores, mais facilmente são produzidos em sistemas de expressão de microorganismo e podem penetrar em tecidos de tumor mais eficientemente 3.
bsAbs sem uma região de Fc são formados comumente vinculando metades de vinculação individual, como fragmentos de variável de cadeia única (scFvs) ou Fabs3. Sem os domínios de estabilização, bsAbs com base em fragmentos scFv frequentemente ter comprometido a estabilidade térmica, baixa solubilidade ou um aumento potencial de agregação de4,5. Em contraste, bsAbs baseada na Fab são mais estáveis devido a heterodimerization do CH1 e CL no nativo moiety Fab4,6.
Domínio variável da cadeia pesada-somente anticorpos (VHHs, também conhecidos como anticorpos único domínio) são o ativo fragmento de antígeno-ligando da cadeia pesada natural anticorpos7. VHHs tem as características de alta afinidade, especificidade de convencional IgGs8, baixa imunogenicidade e rendimentos elevados em expressão bacteriana9. Comparado com fragmentos de Fv, VHHs ter maior estabilidade térmica10. Comparado com Fab metades, VHHs têm tamanhos menores devido à falta de CH1 e CL. Assim, S-Fab, o formato de bsAb obtido, vinculando o Fab com um anticorpo de domínio único, VHH, foi concebido e estudado por seus efeitos anti-tumorais11,12.
Neste estudo, foi descrita a construção de GPC3-S-Fab, vinculando o Fab de hGC3313 com um anti-CD16a VHH14 . O GPC3-S-Fab pode ser eficientemente produzido por periplasmático expressão em Escherichia coli (e. coli). Estudos funcionais de GPC3-S-Fab sugeriram que GPC3-S-Fab é uma estratégia promissora para a terapia do câncer de fígado. Assim, as vantagens do GPC3-S-Fab em técnicas alternativas com referências aplicáveis aos estudos anteriores incluem fácil produção e purificação e bsAbs mais estável.
Sistemas de expressão de mamíferos e expressão procarióticas têm sido utilizadas para expressar vários formatos de BsAbs. Em contraste com sistemas de expressão dos mamíferos, e. coli-sistemas de expressão de proteínas com base tem muitos benefícios, incluindo rendimentos elevados, baixo custos e labor-saving, a facilidade de manipulações genéticas e transformação de alta eficiência15. Para bsAbs expressão em e. coli, existem duas estratégias básicas: expressão no citoplasma e expressão no periplasm entre o citoplasma e membranas externas de célula15. Em comparação com o ambiente redutor do citoplasma, o periplasm é um oxidante mais ambiente, que promove o dobramento correto e co expressão de proteínas16. Dobramento correto desempenha um papel fundamental na geração de solubilidade, estabilidade e função de bsAbs. Portanto, um sinal sequência pelB foi adicionado para o N-terminal do Fab-S para dirigir a secreção para o periplasm de Escherichia coli17. Para garantir a correta de dobramento, solubilidade, estabilidade térmica e estabilidade conformacional, reduzindo a complexidade e o tamanho de um anticorpo é frequentemente empregado16. O formato S-Fab consiste de um fabuloso e um VHH, que se expressa muito bem em sistemas bacterianos prováveis devido à estrutura simples e pequeno tamanho.
GPC3 foi escolhido neste formato de anticorpo bispecific GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) é um membro da família de proteoglicano de sulfato (HS) heparina que é ancorado à superfície da célula através de de glicosilfostidilinosiol (GPI)18. GPC3 é Blumental em 70% dos casos de carcinoma (HCC) hepatocelular, que representam a maioria dos cânceres de fígado19,20,21,22. Porque GPC3 raramente é expressa em tecidos normais, GPC3 tem sido proposto como um alvo potencial para HCC. Múltiplos do mouse mAbs foram produzidos contra GPC3. No entanto, apenas GC33 exibiu limitada atividade anti-tumoral 22, e que não apresentam eficácia clínica em pacientes. Neste estudo, GPC3-S-Fab foi mostrado para ser capaz de recrutar células NK para matar de células de tumor GPC314.
Para recrutar células NK, anti-CD16 VHH foi usado. CD16a é um receptor de IgG de baixa afinidade, expressado principalmente em células assassinas naturais (NK), macrófagos, monócitos e alguns subtipos de células T. Está envolvido na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) por NK células23. Células NK humanas podem ser classificadas em dois tipos, CD56 - CD16 + e CD56 + CD16-. Em contraste com as células NK CD56 + CD16−, CD56-células CD16 + NK podem liberar os níveis mais elevados de perforina e granzime B e, portanto, apresentar uma forte citotoxicidade24. Células de Kupffer (KCs), expressando a CD16a, são os macrófagos residentes no fígado. Células de Kupffer desempenham um papel importante na supressão de câncer de fígado,25. Assim, bsAbs segmentação CD16a pode ser uma estratégia mais promissora do que enfrentar as células T contra câncer de fígado.

<table><tbody><tr><td>Incubadora de agitação</td><td>Thermo Fisher</td><td>MAXQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitação</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2402</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Cence</td><td>GL-10MD</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman relha</td><td>Avanti j-26S XPI</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro ultravioleta</td><td>Thermo Fisher</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de eletroforese em gel de poliacrilamida analítica</td><td>Mini-PROTEAN&reg; Tetra</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho Trans-blot</td><td>Criterion</td><td>Bio-rad</td> Sistema de imagem Bio-rad <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>chemidoc tm XRS+</td><td></td></tr><tr><td>Fast Protein Cromatograma líquido</td><td>GE Healthcare</td><td>AKTA avant</td><td></td></tr><tr><td>GF coluna</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44 Superdex 200 Aumento 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>Beckman coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Envision leitor de placas</td><td>TECAN</td><td>Infinite F50</td><td></td></tr><tr><td>Anti His-tag</td><td>eBioscience</td><td>14-6657-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag-tag</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano (H & L) -488</td><td>A11013</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG HRP-ligado anticorpo</td><td>Sinalização celular</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Agarose</td><td>Tribioscience</td><td>TBS9202-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG-CH1 resina de afinidade</td><td>Thermo Fisher</td><td>194320005</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Kit de enriquecimento de células NK</td><td>Células-tronco</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Stemcell</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>CCK8 kit</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500CP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500CP</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino (FBS)</td> <td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15050-057</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Marcador padrão</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MWGF200</td><td>Filtração em gel</td></tr><tr><td>Produtos químicos Isopropil-b-D-tio-galactopiranosídeo (IPTG)</td><td>VWR VWRC0487-100G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de diálise</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0655-100FT</td><td></td></tr><tr><td>Knanamycine</td><td>VWR</td><td>VWRC0408-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>VWR</td><td>VWRC0339-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma</td><td>Aldrich T6791-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>aladdin</td><td>A110752-500g</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>aladdin</td><td>P112134-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900020</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sangon</td><td>Biotech A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio, anidro monobásico (KH2PO4)</td><td>VWR</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio, dibásico, anidro (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>VWR</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>VWR</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6876-25G</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Azul brilhante R250</td><td>VWR</td><td>VWRC0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500922-25G</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>VWR</td><td>VWRC0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900122</td><td></td></tr><tr><td>prato de plástico de 100 mm x 20 mm</td><td>Frasco de</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>cluster de cultura de células de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610498-0005</td><td></td></tr><tr><td>CHO</td><td>a Coleção de Cultura de Tipo da Academia Chinesa de Ciências</td><td>GNHa 3</td><td></td></tr><tr><td>MHCC-97H</td><td>a Coleção de Cultura de Tipo da Academia Chinesa de Ciências</td><td>SCSP-528</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>a Coleção de Cultura de Tipo da Academia Chinesa de Ciências</td><td>TCHu 72</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>a Coleção de Cultura de Tipo da Academia Chinesa de Ciências</td><td>TCHu182</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B</td><td>a Coleção de Cultura Tipo da Academia Chinesa de Ciências</td><td>TCHu106</td><td></td></tr><tr><td>NK92</td><td>ATCC</td><td>CRL2408</td><td></td></tr></tbody></table>

um direcionamento-gpc3 anticorpo bispecific, gpc3-s-fab, com potente citotoxicidade

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Este protocolo descreve a construção e estudos funcionais de um anticorpo bispecific (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs pode reconhecer dois diferentes epitopos através de suas duas armas diferentes. bsAbs têm sido estudados ativamente por sua capacidade de recrutar diretamente as células imunes para matar células tumorais. Atualmente, a maioria dos bsAbs é produzida na forma de proteínas recombinantes, quer como bsAbs Fc-contendo derivados de bsAb menores sem região Fc. Neste estudo, GPC3-S-Fab, um anticorpo de bispecific com base de anticorpo fragmento (Fab), foi projetado, vinculando o Fab do anticorpo anti-GPC3 GC33 com anticorpos anti-CD16 único domínio. O GPC3-S-Fab pode ser expressa em Escherichia coli e purificado por duas cromatografias de afinidade. O purificado GPC3-S-Fab especificamente pode vincular a e matar células de câncer de fígado positivo GPC3 através do recrutamento de células de assassinas naturais, sugerindo uma potencial aplicação de GPC3-S-Fab na terapia do câncer de fígado.

Purificação de GPC3-S-Fab
GPC3-S-Fab foi purificado de e. coli por uma purificação da afinidade em duas etapas, primeiro com Ni-NTA-agarose, seguido de purificação de IgG-CH1 afinidade. Após a purificação da afinidade em duas fases, GPC3-S-Fab foi purificado a homogeneidade com as duas correntes perto de 1:1 (Figura 2A). A presença de polipeptídeos tanto VHH CD16-CH1-VH e V...

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um anticorpo bispecific GPC3-S-Fab em Escherichia coli. O GPC3-S-Fab purificado tem potente citotoxicidade contra células de câncer de fígado positivo GPC3.

Um direcionamento-GPC3 anticorpo Bispecific, GPC3-S-Fab, com potente citotoxicidade

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de anticorpos biespecíficos, como produzir um anticorpo biespecífico em bactérias e determinar a função do anticorpo purificado. A principal vantagem desta técnica é que o GPC3-S-Fab pode ser facilmente produzido e purificado a partir de E.coli. Para preparar a fracção periplasmática, centrifugar primeiro a suspensão celular a 4 000 g durante 30 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, expulse o meio e pese as células. Após a centrifugação, dissolver o sedimento celular em quatro mililitros de solução gelada de sacarose para cada grama de células. Incubar a suspensão celular em gelo durante 15 minutos.Após 15 minutos, centrifugar a suspensão celular a 8 500 g durante 20 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, pipetar o sobrenadante que contém a fracção de sacarose e guardá-lo no gelo. Ressuspenda o pellet celular em uma mistura gelada de cloreto de magnésio de cinco milimolares e PMSF de um milimolar.Em seguida, adicione 40 microlitros de 15 miligramas por mililitro do estoque de lisossomo à suspensão celular. Depois de adicionar o caldo de lisossomo, deixe a suspensão celular no gelo por 30 minutos. Após o período de incubação, combinar a sacarose e as fracções periplasmáticas.Em seguida, centrifugar a fracção sacarose-periplasmática a 30 000 g durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Após o término da centrifugação, transferir o sobrenadante em um tubo cônico de 50 mililitros sobre gelo. Em seguida, misture e ressuspenda um mililitro de agarose de níquel-NTA com o sobrenadante para obter uma suspensão homogênea e, em seguida, um mililitro de agarose de níquel-NTA para um novo tubo cônico de 15 mililitros.À agarose, adicione 10 volumes de coluna do buffer de equilíbrio. Em seguida, centrifugue a agarose a 400 g durante cinco minutos. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante e adicione a agarose níquel-NTA à fração sacarose-periplasmática.Em seguida, balance o tubo contendo sacarose-fração periplasmática a quatro graus Celsius por duas horas. Novamente, centrifugue a mistura. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante para um tubo fresco gelado, pois esta é a fração não ligada.Após a transferência do sobrenadante, adicionar a agarose níquel-NTA na coluna de gravidade. Em seguida, adicione três volumes de coluna de buffer de eluição à coluna. Em seguida, colete o eluído como frações de eluição um, dois, três e quatro, respectivamente.Diluir e semear 5.000 células em 100 microlitros em cada poço de uma placa de 96 poços. Incube a placa a 37 graus Celsius por seis a oito horas para fixação. Para preparar os PBMCs, primeiro dilua o sangue recém-preparado com um volume igual de solução salina tamponada com fosfato em um tubo cônico de 50 mililitros.Pipetar 15 mililitros de meio de separação de linfócitos em um tubo cônico fresco de 50 mililitros. Em seguida, transfira cuidadosamente o sangue diluído ao longo das paredes do tubo para o meio de separação de linfócitos. Centrifugar as pilhas a 400 g durante 35 minutos à temperatura ambiente sem travões.Após a centrifugação, retire cuidadosamente a camada superior de plasma. Em seguida, pipetar a camada branca de glóbulos contendo os PBMCs. Diluir esses PBMCs obtidos com o dobro do volume de solução salina tamponada com fosfato com soro bovino fetal a 2%.Em seguida, centrifugue a suspensão PBMC. Lave o pellet celular com solução salina tamponada com fosfato contendo soro bovino fetal 2% e centrifugue novamente. Após a centrifugação, conte o número da célula.Para preparar as células natural killer, reconstitua as PBMCs em solução salina tamponada com fosfato com solução salina bovina fetal a 2%. Em seguida, transfira a mistura em um tubo de fundo redondo de poliestireno. Adicione 50 microlitros por mililitro de coquetel de enriquecimento de células assassinas naturais à mistura de PBMC.Misture o conteúdo e deixe o tubo por 10 minutos. Em seguida, ressuspenda e misture as partículas magnéticas presentes no coquetel de enriquecimento pipetando várias vezes, de modo que as partículas fiquem uniformemente suspensas. Em seguida, adicione 100 microlitros por mililitro de partículas magnéticas à suspensão celular.Misture as partículas magnéticas da suspensão celular e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Após cinco minutos, adicione 2,5 mililitros de solução salina tamponada com fosfato com 2% de soro bovino fetal à suspensão celular. Pipete suavemente duas a três vezes para misturar as células no tubo.Coloque o tubo no ímã e deixe as esferas magnéticas assentarem por 2,5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, em um golpe de ação, inverta o tubo e despeje a suspensão de células enriquecidas em um novo tubo. Novamente, conte o número de células.Quando a contagem terminar, dilua as células natural killer no meio de cultura. Em seguida, adicione 100 microlitros da suspensão celular às células tumorais plaqueadas em uma placa de 96 poços. Para configurar os ensaios de citotoxicidade, adicione 10 microlitros de concentrações variadas de anticorpo GPC3-S-Fab à placa de 96 poços.Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por 72 horas. Após o tempo de incubação designado, aspirar o meio. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio DMEM contendo 10 microlitros de reagente CCK em cada poço da placa de 96 poços.Novamente, incube a placa a 37 graus Celsius. Após a incubação, leia a placa a 450 nanômetros a cada hora consecutiva até quatro horas após a adição do reagente CCK8. O anticorpo GPC3-S-Fab é purificado usando uma purificação de afinidade em duas etapas.Aqui, os dois painéis mostram que o anticorpo é purificado usando a agarose níquel-NTA e as colunas de purificação de afinidade IgG-CH1, respectivamente. Em seguida, a afinidade de ligação do anticorpo GPC3-S-Fab é avaliada usando linhagens de células cancerígenas positivas e negativas para GPC3. O GPC3-S-Fab se liga a todas as células positivas para GPC3, como Hep3B, Huh7, Hep2G e CHO / GPC3.Curiosamente, nenhuma ou mínima ligação é observada quando células negativas para GPC3, como MHCC-97H e CHO, são usadas. A citotoxicidade do GPC3-S-Fab também é estudada na presença das células tumorais incubadas com células assassinas naturais frescas. O anticorpo GPC3-S-Fab provoca forte citotoxicidade contra as células HepG2, Hep3B e Huh7 sete de maneira dose-dependente na presença das células assassinas naturais.No entanto, tal citotoxicidade não é observada na ausência das células natural killer nas células MHCC-97H. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em seis horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as etapas no gelo.Após este procedimento, outros métodos como a modelagem de xenoenxerto podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o efeito do tumor in vivo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do anticorpo biespecífico explorarem os efeitos antitumorais in vitro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir um anticorpo biespecífico funcional direcionado às células tumorais, especialmente o isolamento das células NK.

a-gpc3-targeting-bispecific-antibody-gpc3-s-fab-with-potent

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Eliminar células específicas sem danificar outras células é extremamente difícil, especialmente em tecidos estabelecidos, mas há uma necessidade urgente de um método de eliminação celular no campo da engenharia de tecidos. Aqui, apresentamos um método para eliminação celular específica de uma cultura de células 3D mista usando fotoimunoterapia no infravermelho próximo (NIR-PIT).

Eliminação celular seletiva de Cultura 3D Mixed usando uma técnica de infravermelho próximo Photoimmunotherapy

Descrevemos um sistema quantitativo de ensaio de citolíse in vitro em tempo real para avaliar a potência das células T do receptor de antígeno quimérico que visam células tumorais líquidas e sólidas. Este protocolo pode ser estendido para avaliar outras células efetores imunes, bem como tratamentos combinados.

Um ensaio de potência em tempo real para células T do receptor de antígeno quimérico visando células cancerosas sólidas e hematológicas

Este trabalho descreve a síntese e caracterização de um Homo-PROTAC bifuncional, com base em pomalidomida, como uma nova abordagem para induzir a ubiquitinação e a degradação do E3 ubiquitina ligase Cereblon (CRBN), alvo de análogos da talidomida.

Inativação química da E3 ubiquitina ligase Cereblon por Homo-PROTACs à base de Pomalidomida

O desenvolvimento de um conjugado dual-functional do peptide antigénico e do mimetics FC-III (DCAF) é novo para a eliminação de anticorpos prejudiciais. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a síntese da molécula DCAF1, que pode seletivamente obstruir o anticorpo 4G2 para eliminar o efeito dependente do realce do anticorpo durante a infecção do vírus de dengue.

Bloqueio de anticorpos direcionados por um conjugado duplo-funcional de peptídeo antigênico e mimetismo FC-III (DCAF)

Aqui apresentamos um protocolo para estudar a localização in vivo de anticorpos em modelos de xenoenxerto de tumores de camundongos.

Analisando tumor e distribuição de tecidos de anticorpo terapêutico específico de antígeno alvo

Aqui, descrevemos um método para transdução de células T humanas com luciferase para facilitar o rastreamento in vivo do tráfego de células T induzido por anticorpos biespecíficos para tumores em estudos para avaliar a eficácia antitumoral e o mecanismo de anticorpos biespecíficos que envolvem células T.

Rastreando o Tráfico de Células T Induzido por Anticorpos Biespecíficos Usando Células T Humanas Transduzidas por Luciferase

Este protocolo apresenta uma técnica automatizada de alto rendimento baseada em imagem para identificar compostos que modulam a morte de células de câncer de mama mediadas por células natural killer na presença de um anticorpo terapêutico anti-HER-2.

Ensaio de Triagem de Alto Conteúdo para Identificação de Compostos Modificadores de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos

Aqui, apresentamos um método para identificar compostos que modulam o mecanismo ADCC, um importante mecanismo de morte de células cancerígenas de anticorpos antitumorais. O efeito citotóxico das células NK é medido em esferoides de células de câncer de mama na presença de trastuzumabe. A análise de imagens identifica células assassinas e alvo vivas e mortas em esferoides.

Quantificação da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos em Modelo Esferoide Tumoral: Aplicação para Descoberta de Fármacos

Aqui, apresentamos um método para diferenciar e expandir células assassinas naturais que expressam o receptor de antígeno quimérico derivado de iPSC humano (CAR) com morte aprimorada contra várias malignidades. Este protocolo demonstra a diferenciação e expansão de células CAR-NK derivadas de iPSC otimizadas para natural killer (NK) e a medição da atividade antitumoral contra várias linhagens de células tumorais.

Avanços em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que expressam o receptor natural killer do antígeno quimérico derivado de células-tronco

Aqui, descrevemos um método para criar gotículas de emulsão dupla encapsulando uma célula T e uma célula-alvo cancerígena para examinar a morte celular no nível de uma única célula. Este método permite a quantificação dupla de moléculas citotóxicas e apoptose de células-alvo em uma grande população de células T.

Ensaio de citotoxicidade baseado em gotículas para avaliar células T receptoras de antígeno quimérico no nível de célula única

Aprenda a produzir o anticorpo bispecífico GPC3-S-Fab em Escherichia coli para pesquisa em imunoterapia do câncer hepático. Este método permite purificação simplificada e demonstra citotoxicidade potente contra células de carcinoma hepatocelular.

Um direcionamento-GPC3 anticorpo Bispecific, GPC3-S-Fab, com potente citotoxicidade

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