A11-positivo β-amiloide Oligomer preparação e avaliação utilizando Dot mancha análise
22 de maio de 2018
Este protocolo descreve como preparar oligómeros Aβ de um peptídeo sintético em vitro e para avaliar a quantidade relativa de oligómero Aβ por um ponto de análise a mancha.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo neurofarmacológico. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples, confiável e reprodutível para formar oligômero beta-amilóide. Mostramos que a demonstração desse método é crítica, pois as etapas para preparar o oligômero beta são difíceis de aprender.
Primeiro, ajuste a concentração da solução de monômero A-beta para 0,25 miligramas por mililitro adicionando 900 microlitros de água bidestilada ao tubo. Em seguida, continue evaporando a solução de monômero com gás nitrogênio de alta pureza até que o volume atinja cerca de 850 microlitros com uma concentração de cerca de 0,29 miligramas por mililitro. A presença de HR5P afeta a formação de Oligômero A-beta.
Portanto, evaporar o máximo possível é uma etapa crítica desse procedimento. Em seguida, use água bidestilada para diluir a solução estoque de curcumina para preparar uma solução de trabalho de 0,2 e dois micromolares. Mantenha uma proporção de um para um e misture a solução A-beta com curcumina para atingir a concentração final de curcumina em 0,1 e um micromolar.
Em seguida, deixe a solução em um agitador magnético. Fixe uma caixa divisória de plástico ao agitador magnético. Posicione duas barras de agitação magnéticas nos dois cantos da caixa e, em seguida, coloque os tubos com as amostras no centro da caixa.
Continue agitando a caixa em temperatura ambiente por 48 horas a 60 rotações por minuto e, em seguida, centrifugue o tubo a 18.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Após centrifugação, recolher o sobrenadante. Para análise de dot blotting, pegue uma membrana de nitrocelulose e corte-a em tiras de um centímetro de largura e, em seguida, coloque dois microlitros da amostra uniformemente nas tiras um e dois com cada intervalo de ponto em 0,5 centímetros.
Ao esguichar a amostra na membrana, é necessário espalhar uniformemente e as diferentes gotículas são controladas para que as diferentes amostras não fiquem ligadas. Em seguida, incube as tiras em temperatura ambiente por cinco minutos para que as gotículas sequem. Após cinco minutos, incubar as tiras com albumina de soro bovino a 5% por 30 minutos em temperatura ambiente.
Terminada a incubação, lave as tiras com tampão TBST por cinco minutos. Aspire o tampão após a lavagem e, em seguida, incube a tira um com anticorpo anti-oligômero A11 e a tira dois com solução de anticorpo anti-A-beta 6E10 por uma hora. Após uma hora, lave as tiras com TBST por cinco minutos a cada três vezes, depois aspire o tampão e incube as tiras com solução de anticorpos secundários por 40 minutos.
Após a incubação do anticorpo secundário, lave novamente as tiras com TBST por cinco minutos a cada três vezes. Em seguida, adicione cerca de 300 microlitros de fluido ECL misturado à superfície das tiras úmidas e, em seguida, exponha as tiras em um sistema automático de imagem por quimioluminescência. Estudos de MET mostram a ausência de quaisquer agregados visíveis na solução de monômero A-beta dissolvido em HFIP, no entanto, após 48 horas de incubação, o mesmo monômero forma oligômeros, que são principalmente agregados globulares com um diâmetro de 10 a 80 nanômetros.
Ao submeter o monômero A-beta e as amostras ricas em oligômeros à análise de dot blot, mostra a presença de oligômeros A-beta positivos para A11 em amostras ricas em oligômeros A-beta. Curiosamente, peptídeos A-beta positivos para A-beta 6E10 estão presentes tanto no monômero A-beta quanto nas amostras ricas em oligômeros. Em seguida, a análise semiquantitativa também é feita para expressar o monômero A-beta positivo para anticorpos específicos e amostras ricas em oligômeros como uma porcentagem de controle.
Os peptídeos A-beta positivos para A11 são significativamente maiores em amostras ricas em oligômeros A-beta em comparação com os monômeros. Pelo contrário, o peptídeo A-beta positivo para A-beta 6E10 está presente nas amostras ricas em monômero e oligômero. De fato, os oligômeros A-beta também são co-incubados com curcumina e inibidor de oligômero A-beta.
A curcumina leva a uma redução significativa na quantidade relativa de oligômero A-beta positivo para A11 com diminuição da coloração A11 nas amostras de oligômero A-beta co-incubadas com curcumina. No entanto, concentrações variáveis de curcumina não afetam o número de peptídeos A-beta no monômero positivo 6E10 e nas amostras ricas em oligômero quando comparadas às amostras positivas A11. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em várias horas se for executada corretamente.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem candidatos a medicamentos para doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar o oligômero A-beta e avaliar sua quantidade.
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Visão Geral
Este protocolo descreve o preparo de oligômeros de Aβ a partir de um peptídeo sintético in vitro e a avaliação de suas quantidades relativas utilizando análise por dot blot. Este método é simples, confiável e reprodutível, tornando-se essencial para pesquisas em neurofarmacologia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neurofarmacologia
- Bioquímica
Contexto
- Os oligômeros de Aβ estão implicados em doenças neurodegenerativas.
- Compreender sua formação é essencial para o desenvolvimento de terapias.
- Os métodos atuais para preparar esses oligômeros podem ser complexos.
- Este protocolo tem como objetivo simplificar o processo para pesquisadores.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para preparar oligômeros de Aβ.
- Facilitar a avaliação das concentrações de oligômeros.
- Ampliar a reprodutibilidade em experimentos neurofarmacológicos.
Métodos Utilizados
- Ajustar a concentração do monômero de A-beta para 0,25 mg/mL.
- Evaporar a solução com gás nitrogênio de alta pureza.
- Monitorar os efeitos do HR5P na formação de oligômeros.
- Utilizar análise por dot blot para avaliação.
Resultados Principais
- O método produz com sucesso oligômeros de Aβ.
- A análise por dot blot quantifica efetivamente as quantidades de oligômeros.
- A presença de HR5P influencia significativamente a formação de oligômeros.
- O protocolo demonstra alta confiabilidade e reprodutibilidade.
Conclusões
- Este protocolo simplifica a preparação de oligômeros de Aβ.
- Ele fornece uma ferramenta valiosa para a pesquisa neurofarmacológica.
- Estudos futuros podem se basear neste método confiável.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A preparação e quantificação confiáveis de oligômeros de β-amiloides positivos para A11 são fundamentais para a validação precoce de alvos em neurodegeneração e para triagem de inibidores na pesquisa da doença de Alzheimer. Este protocolo permite a geração reprodutível e a avaliação semiqualitativa de espécies oligoméricas tóxicas, oferecendo confiança preditiva nos testes de hipóteses terapêuticas. O método aborda diretamente um ponto crítico para desvio mecanicista e triagem de portfólios em P&D neurofarmacológica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da formação de oligômeros de β-amilóide como fator mecanicista na patologia da doença de Alzheimer.
- Apóia a validação funcional de espécies neurotóxicas utilizando a especificidade do anticorpo A11.
- Facilita a redução de riscos em hipóteses terapêuticas direcionadas à inibição de oligômeros.
- Oferece um fluxo de trabalho reprodutível para análise comparativa de inibidores candidatos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prepara amostras ricas em oligômeros validadas para campanhas de triagem de inibidores subsequentes.
- Fornece resultados semi-quantitativos em ensaios por dot blot para leituras padronizadas de ensaios.
- Permite a detecção reprodutível de oligômeros positivos para A11 na avaliação de compostos.
- Apoia a escalabilidade e a reutilização da plataforma em fluxos de triagem de neurodegeneração.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a caracterização de oligômeros in vitro com espécies neurotóxicas relevantes para a doença.
- Fornece continuidade da validação em estágio de descoberta até a avaliação pré-clínica de inibidores.
- Permite o avanço ajustado ao risco de moléculas candidatas com base em evidências mecanicistas.
- Apoia o desenvolvimento de biomarcadores translacionais para intervenções direcionadas a oligômeros.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se na interface entre a descoberta inicial e a identificação de compostos líderes, permitindo testes de hipóteses robustos e o desenvolvimento de ensaios para portfólios de doenças neurodegenerativas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a validação mecanicista da toxicidade de oligômeros de β-amilóide e os efeitos de inibidores.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e semi-quantitativas em ensaios por dot blot para fluxos de trabalho de triagem de compostos.
- Análises: Permite a quantificação comparativa de espécies positivas para A11 e 6E10 para tomada de decisões baseada em dados.
- Pesquisa Translacional: Conecta a avaliação de oligômeros in vitro a modelos de neurotoxicidade relevantes para a doença.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo reprodutível e escalonável para iniciativas contínuas de pesquisa em neurodegeneração.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas para a doença de Alzheimer.
- Valor Operacional: Oferece preparação e quantificação padronizadas, reprodutíveis e escaláveis de oligômeros.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao permitir triagem robusta de inibidores.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos terapêuticos para neurodegeneração.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de peptídeos e em técnicas de imunodetecção.
- Necessita de acesso a instrumentação para dot blot e sistemas de imagem de quimiluminescência.
- Exige padronização entre equipes para preparo e análise de amostras reprodutíveis.
- Adaptável a diversos candidatos a inibidores e sistemas de peptídeos oligoméricos.
- Dependente da especificidade do anticorpo e das limitações da análise semi-quantitativa.
