Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo pancreático usando esses pancreatóides para entender como as células endócrinas se formam em um ambiente arquitetonicamente e celularmente complexo. A principal vantagem desta técnica é que os pancreatóides desenvolvem células endócrinas devido à inclusão do mesênquima circundante. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o pâncreas é muito pequeno em e10.5.

E a dissecção é crucial para a formação de pancreatóides para obter tecido não contaminante suficiente. Para preparar a dissecação, encha um balde de gelo e coloque um recipiente com solução salina tamponada com fosfato no gelo. Limpe duas pinças de ponta fina e tesouras de dissecção com etanol a 70%.

Perto da área de dissecação, coloque um recipiente com pelo menos três tubos capilares de borossilicato, um isqueiro e pontas de pipeta filtradas de 1000 microlitros. Em seguida, pipete pelo menos um mililitro de 1,25 miligrama por mililitro de dispase fria diluída em água esterilizada no segundo poço de uma placa de 12 poços no gelo. Pipet PBS no primeiro, terceiro e quarto poços da placa de 12 poços.

Além disso, pipete um mililitro de 0,05% de tripsina em um tubo de 1,5 mililitro no gelo. Após a eutanásia de camundongos prenhes temporizados e10.5 de acordo com as diretrizes da IACUC, borrife o abdômen com etanol 70% para limpar a região. Em seguida, faça uma incisão em forma de V na área genital do mouse usando uma tesoura e uma pinça e continue a incisão até o diafragma.

Extirpar cuidadosamente o útero fazendo uma incisão nas porções laterais superiores do útero, puxando o órgão para cima, afastando-se do camundongo e seguindo essa incisão até a região genital antes de repetir no lado oposto. Coloque o útero excisado em uma placa de Petri de 10 centímetros com o PBS frio. Sob um microscópio de dissecção de luz, coloque a placa de Petri e abra cuidadosamente o tecido uterino, colocando duas pinças entre cada embrião e retirando o tecido do saco vitelino.

Transfira os embriões segurando suavemente o saco vitelino com uma pinça e colocando-os em uma placa de Petri de 10 centímetros com PBS fresco e frio. Coloque a placa de Petri no gelo. Em seguida, coloque várias gotas de PBS na tampa da placa de Petri de 10 centímetros.

Use essas gotículas para transferir o embrião durante a dissecção, pois os tecidos extraembrionários são removidos para garantir a visibilidade. Transfira um embrião para uma gota de PBS e remova-o suavemente do saco vitelino usando uma pinça enquanto os embriões restantes permanecem no PBS no gelo. Remova a cabeça antes de mover o embrião para uma nova gota de PBS usando uma pinça para colher levemente o embrião sem danificar o tecido.

Em uma nova queda de PBS, remova os quatro botões dos membros usando uma pinça. Coloque a pinça na abertura onde o broto do membro estava presente e rasgue suavemente apenas o tecido mais externo anteriormente. Gire o embrião e repita na direção posterior, parando no botão do membro posterior.

Neste ponto, o trato gastrointestinal deve estar visível. A região posterior do trato gastrointestinal tem uma ligeira curvatura; Insira uma pinça atrás dessa curva na abertura entre o trato gastrointestinal e a região da coluna vertebral na parede do corpo. Descole o trato gastrointestinal, trabalhando lentamente para cima até atingir a região mais anterior, onde a região cardíaca se conecta.

Nas etapas seguintes, é fundamental evitar o tecido circundante na cultura, para não contaminar o pâncreas com tecido não pancreático. No entanto, se você não pegar todo o broto pancreático, o número e o tamanho dos pancreatóides serão prejudicados. Transfira o trato gastrointestinal para a gotícula fresca de PBS.

Continue a remover o tecido externo ao redor do trato gastrointestinal. Uma vez que esse tecido externo é removido, o broto pancreático pode ser visualizado posteriormente aos brotos hepáticos, entre o estômago e o intestino. Em seguida, pegue uma pinça e aperte suavemente o tecido sob o botão saliente no intestino e levante levemente o botão pancreático.

Depois de beliscar a região onde o broto se conecta ao intestino, o broto é separado. Lave uma vez em uma nova bolha PBS antes de transferir o broto para o primeiro poço da placa de 12 poços e fria o PBS no gelo. Repita até que todos os botões sejam coletados dos embriões e colocados no primeiro poço da placa de 12 poços.

Em seguida, coloque o prato de 12 poços sob o microscópio de dissecção por luz. Conte o número de gemas pancreáticas dissecadas com sucesso para depois calcular a taxa de divisão. Coloque uma ponta de pipeta filtrada de 1000 microlitros na pipeta com o tubo capilar conectado.

Esterilize o tubo capilar com chama e crie uma dobra no tubo para facilitar o uso. Use o capilar para transferir os brotos para o segundo poço contendo solução de dispase fria por dois minutos antes de transferir para o terceiro poço contendo PBS limpo. Pipet os botões para cima e para baixo e transfira-os para o quarto poço contendo PBS limpo.

Por fim, usando o dispositivo capilar, transfira os brotos para o tubo de 1,5 mililitro com 0,05% de tripsina. Coloque o tubo no agitador pré-aquecido a 37 graus Celsius e agite a 1.500 RPM por quatro a cinco minutos. Após o vórtice por aproximadamente 10 segundos, coloque imediatamente o tubo na centrífuga e gire por cinco minutos a 200g.

Remova cuidadosamente tudo, exceto aproximadamente 50 microlitros de solução para não perturbar as células centrifugadas. Para cada gema coletada a 400 microlitros de meio de organogênese para as células centrifugadas, pulse o vórtice três vezes e coloque 100 microlitros por poço de uma placa de 96 poços de baixa fixação, dividindo as gemas na proporção de um para quatro. Verifique ao microscópio para visualizar células dissociadas flutuando livremente.

Em seguida, coloque a placa de cultura em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em uma cadeira de balanço em velocidade média. A dissecção cuidadosa de embriões de camundongos em e10.5 do corno uterino deve produzir embriões intactos em PBS para posterior dissecção. O trato gastrointestinal pode ser removido com eficiência do embrião, permitindo o discernimento do broto pancreático dorsal na junção do intestino e do estômago.

Em meios de organogênese, essas células livres de andaimes flutuantes se automontam e se organizam em pancreatóides tridimensionais que crescem e persistem por pelo menos 10 dias em cultura. A aplicação de um ativador da proteína quinase C em altas concentrações altera a morfologia dos pancreatoides em desenvolvimento, levando a células epiteliais fracamente associadas e aumento da ramificação. Além disso, o uso de animais transgênicos permite a visualização das células à medida que se diferenciam em tempo real.

Para avaliar a associação do tecido mesenquimal pancreático com células epiteliais pancreáticas, a imunomarcação pode ser realizada para marcadores de cada tecido. A imunocoloração de um marcador ductal com um marcador endócrino e núcleos revela a formação de múltiplas linhagens em pancreatoides. Um marcador de mesênquima co-corado com um marcador progenitor pancreático mostra que o mesênquima envolve o pancreatoide.

O desenvolvimento de células beta é revelado pela coloração do marcador epitelial e do marcador de células beta. Usando análise quantitativa de PCR, transcritos de progenitores e células diferenciadoras podem ser avaliados, como genes progenitores e marcadores diferenciados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente uma hora, incluindo o tempo de preparação, se for executada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a dissecção para obter tecido pancreático de 10,5 camundongos para gerar pancreatóides. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de remover cuidadosamente o trato gastrointestinal dos embriões, caso contrário, será muito difícil encontrar o broto pancreático. Após este procedimento, outros métodos como GSIS e ELISA podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quanta insulina ou peptídeo C é produzida após a estimulação da glicose.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para explorarmos as consequências morfológicas da ativação da PKC usando pequenas moléculas. Uma forma de implementar ainda mais este sistema para estudar o efeito do fator de expressão de transcrição e até mesmo para realizar importantes experimentos de epistasia.