Name: Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprenda a gerar pancreatoides 3D de progenitores pancreáticos de mouse e10.5 expressando insulina sem andaime. Este método utiliza mesênquima para estudar a formação de células endócrinas em ambiente complexo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos Jolanta Chmielowiec útil discussão sobre o protocolo e o manuscrito. Agradecemos também Benjamin Arenkiel para acesso ao microscópio confocal. Este trabalho foi financiado pelo NIH (P30-DK079638 para M.B.) e T32HL092332-13-M.A.S e M.B., Fundação médica McNair (para M.B.) e o núcleo confocal no BCM intelectual e inabilidades desenvolventes Research Center (NIH U54 HD083092 da Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional da criança saúde e desenvolvimento humano).

Todos os experimentos animais descritos neste método foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Baylor College of Medicine.
1. preparação do Mouse embrionárias dia 10.5 progenitores pancreático
Nota: Este protocolo não precisa ser seguido em condições estéreis até o passo 2, no entanto, é ideal para esterilizar instrumentos de dissecação e pulverizar com prévio de 70% de etanol para usar.
<ol><li>Para configurar para dissecação, encha um balde de gelo e coloque um recipiente de salina tamponada fosfato (PBS) no gelo. Limpe duas pinças de ponta fina e tesoura de dissecação com etanol a 70%. Situado perto da área de dissecação, um recipiente pelo menos três borosilicato capilar tubos, uma pipeta de boca, um isqueiro e filtrada 1.000 pontas de pipetas µ l.<ol>
<li>Prepare pelo menos 1 mL de dispase frio 1,25 mg/mL, diluído em água esterilizada e coloque no segundo poço de 12 prato bem no gelo. Colocou a primeira, terceira e quarta PBS poços dos 12 placa bem. Coloque 1 mL de 0,05% de tripsina em um 1,5 mL tubo no gelo. Pré-aquecer uma incubadora de agitação para 37 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eutanásia em e10.5 ratos grávidas cronometrado em conformidade com as diretrizes IACUC. Pulverize o abdômen com etanol a 70% para limpar a região antes de fazer uma incisão em forma de V no área genital do mouse usando a tesoura e pinça e continuá-lo até o diafragma. Nota: A aparência de um tampão vaginal neste protocolo indica dia 0,5. Um ganho de peso de mais de 2G usando 5 - ratos de 6 semanas de idade, atua como medida secundária de impregnação de sucesso.<ol>
<li>Excisar cuidadosamente o útero, fazendo uma incisão na porção lateral superior do útero, puxando o órgão para cima longe do mouse e após esta incisão até a região genital antes de repetir do lado oposto. Coloque-o em uma placa de Petri com a PBS fria de 10 cm. Nota: É possível obter organoids de células e11.5 dissociado, no entanto, ao contrário do pancreatoids de e10.5, estes organoids ainda não são caracterizados e, portanto, não podem manter a capacidade de se diferenciarem em todas as três principais linhagens do pâncreas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sob um microscópio de luz dissecação, coloque o prato de Petri e abra cuidadosamente o tecido uterino colocando duas pinças entre cada embrião e descascando o tecido do saco vitelino. Transferência de embriões segurando o saco vitelino suavemente com fórceps e coloque em um prato de Petri com fresco, de 10 cm frio PBS. Coloque o prato de Petri no gelo. Nota: É importante remover heedfully embriões, de preferência mantidos dentro do saco vitelino, como remoção vigorosa pode puxar o cordão umbilical, rasgando o tecido do embrião e comprometer a integridade estrutural.</li>
	<li>Coloque várias gotas de PBS sobre uma tampa de caixa de Petri de 10 cm. Use essas gotículas para transferir o embrião durante a dissecção, como tecidos extraembryonic são removidos para garantir visibilidade. Transferir um embrião para uma gota de PBS e delicadamente Retire o saco vitelino usando fórceps, enquanto os restantes embriões permanecem em PBS no gelo (Figura 1A). Remova a cabeça antes de mover o embrião para uma nova queda de PBS usando fórceps para colher levemente o embrião, para não danificar o tecido (Figura 1B). Nota: O tecido pode precisar ser transferido mais frequentemente para gotículas de PBS frescas do indicado aqui, dependendo da opacidade do líquido.<ol>
<li>Em uma gota de PBS nova, remova os botões do membro anterior usando fórceps (Figura 1B). Coloque a pinça na abertura onde o broto do membro estava presente e delicadamente desfazer apenas o tecido mais externo anteriormente (Figura 1B). Rode o embrião e repita na direção posterior, parando no broto do membro posterior. Neste ponto, o trato gastrointestinal deve ser visível (Figura 1B).</li>
		<li>A região posterior do tracto gastrointestinal tem uma ligeira curva (Figura 1F). Inserir o fórceps para trás esta curva na abertura entre o trato gastrointestinal e região da coluna vertebral da parede da corpo. Desanexe o trato gastrointestinal, trabalhando lentamente para cima até atingir a região mais anterior onde a região cardíaca conecta (Figura 1B-E). OPCIONAL: Remova o coração primordial e os gomos de fígado da região ventral do tracto gastrointestinal, deixando apenas o tubo contínuo do intestino. Nas primeiras vezes este protocolo é executado pode ser mais fácil deixar o coração e o fígado como Marcos ventrais até a morfologia do trato gastrointestinal e o broto pancreático dorsal estão mais familiarizados (Figura 1C e D ).</li>
		<li>Transferi o trato gastrointestinal para a gota fresca de PBS.</li>
		<li>Pegue a pinça e aperte suavemente o tecido sob o botão saliente e intestino e levantar ligeiramente o tecido exterior fora (Figura 1D-F). Nota: O broto pancreático dorsal está localizado entre o estômago e intestino (Figura 1C-G). O broto pancreático abaixo deve parecer uma estrutura redonda, manchinha (Figura 1G).</li>
		<li>Coloque a pinça onde o broto se conecta ao intestino e aperto para cima para soltar o botão (Figura 1G). Lave uma vez em uma bolha de PBS nova antes de transferir o broto no primeiro poço da placa de 12 bem no frio PBS no gelo. Repita até que todos os botões são coletados de embriões e colocados no primeiro poço da placa de 12 bem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque o prato bem 12 sob o microscópio de luz dissecação. Conte o número de brotos pancreáticos dissecados com sucesso para depois calcular a taxa de divisão.<ol>
<li>Lugar uma ponta de pipeta de µ l 1.000 filtrado dentro da pipeta de boca com um tubo capilar conectado. Chama esterilizar o tubo capilar e criar uma curva no tubo para a facilidade de uso. Use o capilar para transferir os botões para a segunda solução dispase frio bem contendo por 2 min antes de transferir para o terceiro poço com o PBS limpa (Figura 1G). Nota: Ao transferir os botões do dispase a PBS, evite tocar o tecido para a ponta do tubo capilar. Se o tecido fica preso na ponta do tubo, Pipetar para cima e para baixo ou apertar na solução PBS limpa até afrouxado.</li>
		<li>Pipetar os botões cima e para baixo e transferir para o quarto bem com PBS limpo. Finalmente, usando a transferência de dispositivo capilar os botões para o tubo de 1,5 mL com 0,05% tripsina. Colocar o tubo no 37 oC pré-aquecido shaker e agitar a 1.500 rpm por 4 min.</li>
		<li>Vórtice por aproximadamente 10 s imediatamente coloque o tubo em uma centrífuga e rotação durante 5 min à 200 g. remover tudo mas cerca de 50 µ l de solução com cautela para não perturbar as células centrifugadas (Figura 1G).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cultivo dissociadas progenitores para formar Pancreatoids
Nota: O seguinte deve ser executada em um ambiente estéril em uma capa padrão de cultura de tecidos, usando os procedimentos padrão de estéril.
<ol><li>Para cada broto coletado, adicione 400 µ l organogênese mídia16,17 (tabela 1) para as células centrifugadas. Vórtice de pulso três vezes e o placa 100 µ l por alvéolo de uma fixação baixo 96 placa bem, dividindo os botões em uma proporção de 1:4 (Figura 1G).</li>
	<li>Verifique sob o microscópio Visualizar dissociado células livremente flutuante (Figura 1-H). Coloque o prato de cultura numa incubadora 37 oC com 5% CO2 em uma cadeira de balanço na velocidade média.</li>
	<li>Monitore o progresso da pancreatoids diariamente. Substitua com 100 µ l de fresca mídia cada 3 dias, pipetagem cuidadosamente sob controle microscópico de capuz para remover deixando pancreatoid no poço. Alternativamente, fresco 100 µ l de mídia podem ser adicionados a um novo poço e pancreatoid transferidos usando o tubo capilar de borosilicato anexado a pipeta de boca e 1000 µ l filtrado a ponta da pipeta.</li>
</ol>3. Pancreatoids de processamento de imagem de imunofluorescência
<ol><li>Para processar pancreatoids para imagens de imunofluorescência, primeiro prepare 4% paraformaldeído/PBS, solução de pH7.4 (PFA). Colocar 50 µ l de PFA em poços de um 96 bem placa de 4%.<ol>
<li>Usando os tubos capilares de borosilicato e pipeta de boca com a ponta da pipeta filtrada 1.000 µ l, transferir pancreatoids de meio de cultura, levando a mídia tão pouco quanto possível dentro do poço fresco com 4% PFA. Definir o basculante em temperatura ambiente por 15 min.</li>
		<li>Transferência de pancreatoids de 4% rock de PFA em um poço com 100 µ l de PBS fresco, à temperatura de 5-10 min. Repeat para um total de três lavagens de PBS frescas. Nota: O protocolo pode ser pausado, com pancreatoids armazenados em 100 µ l de PBS no 4 oC por até uma semana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para a imagem latente de wholemount (recomendado se os anticorpos são adequada, alternativa de abordagem na seção 3.3. e microscopia em 3.4.), transferir de PBS em 50 µ l de soro de burro de 5% em PBS 1x com 0.1% de detergente não iônico (PBST) ao bloco. Rock a noite no 4 oC ou, alternativamente, por 4 horas à temperatura ambiente.<ol>
<li>Transferência de pancreatoids para um novo poço contendo anticorpos primários diluídos em 50 µ l de soro 5% burro em 1 x PBST. Idealmente, rocha por 24 h a 4 oC (pelo menos 12 h mas até 36 h). Nota: Anticorpos listados na Tabela de materiais contra Chga (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) e Pdx1 (1: 100) são adequados para a coloração de wholemount; outros anticorpos podem exigir a otimização.</li>
		<li>Transferência de pancreatoids para um poço contendo 100 µ l de PBST fresca para lavar e rock para 30 min à temperatura ambiente. Repita esta etapa para um total de três lavagens PBST frescos.</li>
		<li>Transferência de pancreatoids para um novo poço contendo anticorpos secundários diluídos em 50 µ l de soro 5% burro em 1 x PBST. Proteger a placa de luz e coloque em 4 oC, balançando para otimamente 24h (pelo menos 12 h mas até 36 h). Nota: Todos os anticorpos secundários constantes da Tabela de materiais e DAPI contrastante nuclear são adequados para a coloração de wholemount.</li>
		<li>Transferência de pancreatoids para um novo poço contendo 100 µ l de 1x PBST e rocha em temperatura ambiente por 30 min. repetir para um total de três lavagens em 1 x PBST. Na terceira e última lavagem, adicionar 300 nM DAPI.</li>
		<li>Finalmente, coloque 100 µ l de limpo PBS e loja em 4 oC, protegido da luz por até uma semana antes de imagens por microscopia confocal, embora os melhores resultados vêm de imagem imediatamente depois da coloração. Para evitar o movimento de pancreatoids durante a imagem latente, mas evitar a secar, coloque cada pancreatoid uma gota de 20 µ l de PBS. Se pancreatoids não permanecem ainda, reduza o volume de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para seções congeladas, transferir pancreatoids de PBS para a solução de sacarose 30% durante a noite em 4 óC.<ol>
<li>Adicione mídia incorporação numa bolha sob um microscópio de dissecação. Usando fórceps sob controle microscópico, embeba pancreatoids empurrando suavemente através da incorporação de mídia várias vezes para remover sacarose residual antes de transferir para um bloco de tecido com mídia de encastre congelado.</li>
		<li>Coloque o bloco de tecido em gelo seco até congelado e seção no criostato em 8 µm. Nota: As seções podem ser armazenadas no óC-80 ou immunostained imediatamente.</li>
		<li>Permitem que as seções de-80 oC para descongelar à temperatura ambiente por cerca de 5 min até secar. Desenhar uma barreira hidrofóbica usando a caneta de pap hidrofóbica ao redor do tecido e o bloco usando 5% de soro de burro diluído em 1 x PBST por 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Remova a mídia e substitua imediatamente com os anticorpos primários diluídos em soro de burro 5% diluído em 1 x PBST pernoite no 4 oC.</li>
		<li>Remover a solução primária e lavar tecidos três vezes com 1 x PBST por 10 min cada. Em seguida, adicionar solução de anticorpo secundário diluída em soro de burro 5% diluído em 1 x PBST por 1h à temperatura ambiente e proteger os slides da luz.</li>
		<li>Remover a solução secundária e lavar três vezes de slides em 1 x PBST por 10 min cada. Na lavagem final, adicionar 300 nM DAPI.</li>
		<li>Remova a mídia e adicionar mídia de montagem e uma lamela. Loja slides longe da luz em 4 oC até que esteja pronto para a imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. isolamento do RNA das Pancreatoids para análise de transcrição
<ol><li>Colete pancreatoids usando borosilicato capilar ligado a uma pipeta de boca com uma ponta de pipeta de µ l 1.000 filtrada para esterilidade e lugar em 500 µ l de solução de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidínio ácido em um tubo de 1,5 mL. Armazenar no-80 oC ou proceder de imediato ao isolamento de RNA.</li>
	<li>Para isolamento de RNA, descongelar as amostras no gelo se necessário e adicione 100 µ l de clorofórmio. Vórtice bem e lugar no 4 oC por 15 min. pré-cool uma centrífuga de 4 oC.<ol>
<li>Colocar os tubos em centrífuga e rotação por 20 min em 12.000 g em 4 oC.</li>
		<li>Retire cuidadosamente os tubos para não perturbar a separação das camadas. Usando uma pipeta de 200 µ l, recolher a solução aquosa clara e coloque em um novo tubo de 1,5 mL, deixando para trás uma pequena quantidade para buffer da camada branca da proteína e camada de DNA rosa. Não toque a ponta da pipeta para nada neste processo e não tocar as paredes do tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 500 µ l de isopropanol 100% para o novo tubo contendo a fase aquosa e o vórtice. Deixe descansar em temperatura ambiente por 20 min, mais tempo no gelo, ou para a precipitação máxima deixe durante a noite-20 oC.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 g durante 15 min à 4 óC a pelota do RNA. Remova o isopropanol sem perturbar o sedimento. Nota: Como pancreatoids são pequenas, é provável que o sedimento não será visível.</li>
		<li>Frio, adicionar etanol 75% e inverter o tubo várias vezes. Coloque na centrífuga e girar a 9.000 x g durante 10 minutos a 4 oC. Remove o etanol e rodada por 2 min a 9.000 x g.</li>
		<li>Use uma pipeta de 200 µ l para remover qualquer restante etanol no tubo, sem contato com a pelota reside na região. Deixe a tampa aberta do tubo para 5-10 min à temperatura ambiente para garantir a evaporação do etanol residual.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em vortexing em 20 µ l de água limpa e livre de nuclease. Opcional: Calor do RNA em 65 oC por 3 min e imediatamente voltar para o gelo. RNA pode ser armazenado no-80 oC ou usado imediatamente para a transcrição reversa e qPCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Akkerman, N., Defize, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dawn+of+the+organoid+era%3A+3D+tissue+and+organ+cultures+revolutionize+the+study+of+development%2C+disease%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration.</a> Bioessays. 39 (4), (2017).</li>
<li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li>
<li>Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001143(2011).</li>
<li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+kidney+organoids+by+differentiation+of+human+pluripotent+cells+to+ureteric+bud+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26444236">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23995685">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Loftus, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinar+cell+apoptosis+in+Serpini2-deficient+mice+models+pancreatic+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency.</a> PLoS Genetics. 1 (3), 38(2005).</li>
<li>Kleeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Chronic pancreatitis.</a> Nat Rev Dis Primers. 3, 17060(2017).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+signals%2C+and+lineages+in+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, signals, and lineages in pancreas development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
<li>Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pancreas+organogenesis+from+dispersed+mouse+embryonic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), 51725(2014).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).</li>
<li>Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic-stem-cell-derived+progenitors+by+organ-matched+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme.</a> Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).</li>
<li>Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+pancreatoids+with+native+mesenchyme+develop+Insulin+producing+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10810(2017).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+multiple+steps+of+pancreatic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).</li>
<li>Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factors+Nkx6.1+and+Nkx6.2+possess+equivalent+activities+in+promoting+beta-cell+fate+specification+in+Pdx1%2B+pancreatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells.</a> Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+is+required+for+maintenance+of+the+pancreatic+progenitor+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).</li>
<li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+transcriptional+regulator+Ptf1a+in+converting+intestinal+to+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors.</a> Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).</li>
<li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li>
<li>Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+binding+sites+for+Dolichos+biflorus+agglutinin+at+the+apical+aspect+of+collecting+duct+cells+in+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).</li>
<li>Reichert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+genetic+manipulation+of+mouse+pancreatic+ductal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).</li>
<li>Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromogranins+A+and+B%3A+the+first+25+years+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives.</a> Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).</li>
<li>Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+alpha-cell+dysfunction+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes.</a> Diabetes and Metabolism. 34, Suppl 2 49-55 (2008).</li>
<li>Del Prato, S., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-+and+alpha-cell+dysfunction+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hormone+and+Metabolic+Research%22%5BJournal%5D)">Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes.</a> Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).</li>
<li>Piciucchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocrine+pancreatic+insufficiency+in+diabetic+patients%3A+prevalence%2C+mechanisms%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment.</a> International Journal of Endocrinology. 2015, 595649(2015).</li>
<li>Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormalities+of+the+Exocrine+Pancreas+in+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes.</a> Current Diabetes Reports. 15 (10), 79(2015).</li>
<li>Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+insufficiency+in+type+1+and+type+2+diabetics+of+Indian+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin.</a> Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A progressão dos modelos de cultura de células é fundamental para corretamente o desenvolvimento de modelos, produzir tipos de células clinicamente relevantes, teste de eficácia de drogas ou até mesmo transplante para pacientes. No entanto, artificialmente recapitulando o desenvolvimento em um prato é um desafio que estamos ainda longe de compreender os mecanismos da organogênese e fisiologia in vivo. Assim, em vitro células são ineficientemente gerado, não totalmente funcional, incapaz de ser mantido p...

Delinear os mecanismos do desenvolvimento normal e a fisiologia é fundamental para compreender a etiologia da doença e, finalmente, cultivar métodos de tratamento. Enquanto cultivo e diferenciação de células-tronco permite uma análise rápida e de alta produtividade de desenvolvimento, é limitada pelo corpo de conhecimentos sobre os mecanismos que regulam o destino de célula existente e artificialmente recapitula o desenvolvimento em um relativamente Estado homogêneo, bidimensional1,2. Não só está na vivo desenvolvimento afetado por influências extrínsecas, com diferentes tipos de células no nicho e meio fornecendo sinais parácrina e apoio organizacional para guiar a organogênese, mas a função destas células também se baseia em sua ambiente para orientação3,4,5. Dada a importância desses sinais externos, as limitações de protocolos de diferenciação e a natureza laboriosa de modelos de rato na vivo , novos sistemas são necessários para investigar experimentalmente fisiologia e processos básicos do desenvolvimento.
O surgimento de protocolos para gerar tridimensionais, complexo organoids fornece um sistema conveniente e congruente para estudar organogênese, fisiologia, eficácia de drogas e até mesmo patogênese. Que estabelece organoids murino para diferentes sistemas tais como o estômago6 e intestino7 expandimos nossa compreensão da organogênese, fornecendo uma ferramenta para estudar as complexidades do desenvolvimento com menos restrições do que in vivo e modelos em vitro . Devido a estes avanços nos organoides murino-formação e o advento de pluripotentes humanas tronco células intestinais humanas8, retina9, renal10,11, e organoids cerebral12 foram produzidos e isto repertório é limitado pelo conhecimento existente sobre mecanismos de desenvolvimento.
De particular interesse é a geração de organoids do pâncreas, como pragas de uma miríade de doenças diferentes pancreático tipos de células, incluindo células acinares e dutos em insuficiência pancreática exócrina13, células acinares em pancreatite14, e células beta em diabetes15. Adquirir conhecimentos sobre o desenvolvimento destes tipos de células diferentes poderia auxiliar na compreensão de sua patologia e, também, agir como uma plataforma para triagem de drogas personalizadas ou transplante. Anteriormente, et al . Greggio desenvolveu um método para criar murino organoids pancreático que recapitular na vivo morfogênese e desenvolver estruturas organizadas, tridimensionais, complexas compostas por todas as grandes células epiteliais do pâncreas tipos de16,17. Este é um grande passo em frente no campo do pâncreas, especialmente como fazer células in vitro pode habilite investigação biológica do desenvolvimento de células beta. No entanto, uma escassez de células endócrinas formada neste protocolo, a menos que os organoids foram transplantadas no tecido, onde o nicho poderia interagir e fornecer pistas instrucional17. A mesênquima constitui a maior parte do nicho, envolvendo fortemente o epitélio em desenvolvimento desde as fases iniciais da organogênese para fases posteriores, incluindo delaminação endócrino e diferenciação3,4, 18. A interação entre a mesênquima o pâncreas em desenvolvimento é mais um exemplo de sinalização extrínseca e a importância da manutenção na vivo celular complexidade estudar organogênese.
Aqui, descrevemos como gerar tridimensional organoids do pâncreas, denominado pancreatoids, de e10.5 dissociada murino progenitoras pancreáticas. Estes pancreatoids reter mesênquima nativa, auto-montagem em condições de livre flutuação e gerar todos os tipos de grandes células pancreáticas, incluindo um número robusto de células endócrinas beta19. Esta abordagem é mais adequada para a análise do desenvolvimento do sistema endócrino, como protocolos anteriores faltam robusta diferenciação endócrina. No entanto, usando o protocolo para organoids do pâncreas como descrito por Greggio et al é mais adequado para análise de ramificação epiteliais do pâncreas e morfogênese, como ramificação é mais limitada em pancreatoids.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de Tubos Aspiradores para Pipetas Microcapilares Calibradas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>BarnStead NanoPure Água livre de nuclease</td><td>ThermoFisher</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Capilares de Borosilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>GB1007515</td><td>O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm de comprimento</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca Repelente de Células de 96 Poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td> Centrífuga <td>de fundo em U</td></tr><tr><td>5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233306</td><td></td></tr><tr><td>Cromogranina-A anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab15160</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo Compacto e Modular M60</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess Contador de Células Automatizado</td><td>Invitrogen</td><td>C10310</td><td></td></tr><tr><td>Contadores de Células Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>ThermoFisher</td><td>957000L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidina-2'-fenilindol-dicloridrato)</td><td>Roche</td><td>10 236 276 001</td><td>Laboratório</td></tr><tr><td>de vetor</td> de<td>anticorpo DBA</td> em pó <td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, Pó</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11251-10</td><td>0,05 x 0,02 mm; Titânio; Dica de biologia</td></tr><tr><td>EGF (fator de crescimento epidérmico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 Provas</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Incubadoras de CO2 Forma Steri Cycle</td><td>ThermoFisher</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>OB10001</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sal de sódio da mucosa intestinal suína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>INSM1 Anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-271408</td><td>Camundongo Policlonal IgG</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>a4164</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia Isoflurano, USP</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo</td><td>de Insulina Dako</td><td>A056401</td><td>Cobaia Policlonal</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>KaryoMax</td><td>10575090</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Substituição de soro</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SPE Confocal espectral de alta resolução</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442615</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo C-Peptídeo ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-CPTMS-E01</td><td></td></tr><tr><td>Mouse ultrassensível Lâminas</td> de micrótomo de <td>insulina ELISA ALPCO</td><td>80-INSMSU-E01</td><td></td></tr><tr><td>MX35</td><td>ThermoFisher</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pdx1 anticorpo</td><td>DSHB</td><td>F6A11</td><td>Monoclonal Mouse MIgG1</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Descartável Moldes de Incorporação</td><td>VWR</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Penicilina-Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-Miristato 13- Acetato)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>1.5mL Capacidade</td></tr><tr><td>Recombinante Humano FGF-10 Proteína</td><td>R & D Systems</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Humano Recombinante FGF-Ácido</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>Proteína R-Espondina I Humana Recombinante R</td><td>& D Systems</td><td>4546-RS</td><td></td></tr><tr><td>BenchRocker 2D</td><td>Benchmark</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose 500g</td><td>Lâminas de microscópio Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-401</td><td></td></tr><tr><td>Tecido Tek O.C.T. Composto</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604039</td><td>(1x), sem Fenol</td></tr><tr><td>Vermelho Trypan Blue Stain</td><td>Invitrogen</td><td>15250061</td><td>Para lâminas de contagem de células</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05% )</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Vermelho Fenol</td></tr><tr><td>Fixação Ultra-Baixa Placa de 24 Poços</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Placa Esferóide de Fixação Ultra-Baixa 96 Poços</td><td>Corning</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Vimentina</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5733</td> Gênio de Vórtice <td></td></tr><tr><td></td><td>IgY de Frango PoliclonalBioExpres</td><td>S-7350-1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dicloridrato</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td>Também conhecido como inibidor de ROCK</td></tr><tr><td>Zeiss 710 Microscópio Confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando pancreatoids do mouse progenitoras pancreáticas em vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

O pâncreas é que um órgão complexo composto de muitos tipos de células diferentes que trabalham juntos para regular a digestão e homeostase de glicose do sangue. Estes tipos de células incluem células acinares secretoras de enzima, um sistema ductal arborized responsável para o transporte de enzimas para as intestino e produção de hormônio de células endócrinas.
Beta-células endócrinas são o tipo de célula única no organismo que produzem a insulina para baixar os níveis de glicose do sangue. Diabetes, uma doença caracterizada por uma perda ou a disfunção das células beta, está alcançando proporções epidêmicas. Assim, é essencial estabelecer protocolos para investigar o desenvolvimento de células beta que pode ser usado para fins de triagem para derivar a droga e a terapêutica baseada em célula. Enquanto a investigação experimental do desenvolvimento do mouse é essencial, na vivo estudos são trabalhosas e demoradas. Células cultivadas fornecem uma plataforma mais conveniente para a seleção; no entanto, eles são incapazes de manter a diversidade celular, organização arquitetônica e interacções celulares encontradas in vivo. Assim, é essencial para desenvolver novas ferramentas para investigar fisiologia e organogênese no pâncreas.
Células epiteliais pancreáticas desenvolveram em estreita associação com mesênquima desde o início da organogênese como células organizam e diferenciarem-se em órgão complexo, fisiologicamente competente adulto. A mesênquima pancreática fornece sinais importantes para o desenvolvimento do sistema endócrino, muitos dos quais não são bem compreendidos ainda, assim, difícil recapitular durante o cultivo em vitro . Aqui, descrevemos um protocolo para organoids de rato complexas tridimensionais, celular de cultura que retêm mesênquima, denominada pancreatoids. O broto pancreático murino de e10.5 é dissecado, dissociado e cultivado em um ambiente livre de andaime. Estas células de flutuação auto-montagem com mesênquima que envolvia o desenvolvimento pancreatoid e um número robusto de beta-células endócrinas, desenvolvendo juntamente com o acinares e as células do duto. Este sistema pode ser usado para estudar as interações de célula célula célula destino determinação, organização estrutural e morfogênese, durante a organogênese, ou para a droga, pequena molécula ou rastreio genético.

Dissecção cuidadosa de embriões do rato em e10.5 do corno uterino deve produzir embriões não danificados em PBS para mais dissecação (Figura 1A). O trato gastrointestinal pode ser eficientemente removido do embrião (Figura 1B), permitindo que o discernimento do bud pancreatic dorsal na junção do intestino e estômago (Figura 1C-F). O broto pancreático...

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar insulina expressando 3D pancreatoids murino de progenitores pancreático flutuantes e10.5 dissociada e a mesênquima associada.

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo pancreático usando esses pancreatóides para entender como as células endócrinas se formam em um ambiente arquitetonicamente e celularmente complexo. A principal vantagem desta técnica é que os pancreatóides desenvolvem células endócrinas devido à inclusão do mesênquima circundante. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o pâncreas é muito pequeno em e10.5.E a dissecção é crucial para a formação de pancreatóides para obter tecido não contaminante suficiente. Para preparar a dissecação, encha um balde de gelo e coloque um recipiente com solução salina tamponada com fosfato no gelo. Limpe duas pinças de ponta fina e tesouras de dissecção com etanol a 70%.Perto da área de dissecação, coloque um recipiente com pelo menos três tubos capilares de borossilicato, um isqueiro e pontas de pipeta filtradas de 1000 microlitros. Em seguida, pipete pelo menos um mililitro de 1,25 miligrama por mililitro de dispase fria diluída em água esterilizada no segundo poço de uma placa de 12 poços no gelo. Pipet PBS no primeiro, terceiro e quarto poços da placa de 12 poços.Além disso, pipete um mililitro de 0,05% de tripsina em um tubo de 1,5 mililitro no gelo. Após a eutanásia de camundongos prenhes temporizados e10.5 de acordo com as diretrizes da IACUC, borrife o abdômen com etanol 70% para limpar a região. Em seguida, faça uma incisão em forma de V na área genital do mouse usando uma tesoura e uma pinça e continue a incisão até o diafragma.Extirpar cuidadosamente o útero fazendo uma incisão nas porções laterais superiores do útero, puxando o órgão para cima, afastando-se do camundongo e seguindo essa incisão até a região genital antes de repetir no lado oposto. Coloque o útero excisado em uma placa de Petri de 10 centímetros com o PBS frio. Sob um microscópio de dissecção de luz, coloque a placa de Petri e abra cuidadosamente o tecido uterino, colocando duas pinças entre cada embrião e retirando o tecido do saco vitelino.Transfira os embriões segurando suavemente o saco vitelino com uma pinça e colocando-os em uma placa de Petri de 10 centímetros com PBS fresco e frio. Coloque a placa de Petri no gelo. Em seguida, coloque várias gotas de PBS na tampa da placa de Petri de 10 centímetros.Use essas gotículas para transferir o embrião durante a dissecção, pois os tecidos extraembrionários são removidos para garantir a visibilidade. Transfira um embrião para uma gota de PBS e remova-o suavemente do saco vitelino usando uma pinça enquanto os embriões restantes permanecem no PBS no gelo. Remova a cabeça antes de mover o embrião para uma nova gota de PBS usando uma pinça para colher levemente o embrião sem danificar o tecido.Em uma nova queda de PBS, remova os quatro botões dos membros usando uma pinça. Coloque a pinça na abertura onde o broto do membro estava presente e rasgue suavemente apenas o tecido mais externo anteriormente. Gire o embrião e repita na direção posterior, parando no botão do membro posterior.Neste ponto, o trato gastrointestinal deve estar visível. A região posterior do trato gastrointestinal tem uma ligeira curvatura; Insira uma pinça atrás dessa curva na abertura entre o trato gastrointestinal e a região da coluna vertebral na parede do corpo. Descole o trato gastrointestinal, trabalhando lentamente para cima até atingir a região mais anterior, onde a região cardíaca se conecta.Nas etapas seguintes, é fundamental evitar o tecido circundante na cultura, para não contaminar o pâncreas com tecido não pancreático. No entanto, se você não pegar todo o broto pancreático, o número e o tamanho dos pancreatóides serão prejudicados. Transfira o trato gastrointestinal para a gotícula fresca de PBS.Continue a remover o tecido externo ao redor do trato gastrointestinal. Uma vez que esse tecido externo é removido, o broto pancreático pode ser visualizado posteriormente aos brotos hepáticos, entre o estômago e o intestino. Em seguida, pegue uma pinça e aperte suavemente o tecido sob o botão saliente no intestino e levante levemente o botão pancreático.Depois de beliscar a região onde o broto se conecta ao intestino, o broto é separado. Lave uma vez em uma nova bolha PBS antes de transferir o broto para o primeiro poço da placa de 12 poços e fria o PBS no gelo. Repita até que todos os botões sejam coletados dos embriões e colocados no primeiro poço da placa de 12 poços.Em seguida, coloque o prato de 12 poços sob o microscópio de dissecção por luz. Conte o número de gemas pancreáticas dissecadas com sucesso para depois calcular a taxa de divisão. Coloque uma ponta de pipeta filtrada de 1000 microlitros na pipeta com o tubo capilar conectado.Esterilize o tubo capilar com chama e crie uma dobra no tubo para facilitar o uso. Use o capilar para transferir os brotos para o segundo poço contendo solução de dispase fria por dois minutos antes de transferir para o terceiro poço contendo PBS limpo. Pipet os botões para cima e para baixo e transfira-os para o quarto poço contendo PBS limpo.Por fim, usando o dispositivo capilar, transfira os brotos para o tubo de 1,5 mililitro com 0,05% de tripsina. Coloque o tubo no agitador pré-aquecido a 37 graus Celsius e agite a 1.500 RPM por quatro a cinco minutos. Após o vórtice por aproximadamente 10 segundos, coloque imediatamente o tubo na centrífuga e gire por cinco minutos a 200g.Remova cuidadosamente tudo, exceto aproximadamente 50 microlitros de solução para não perturbar as células centrifugadas. Para cada gema coletada a 400 microlitros de meio de organogênese para as células centrifugadas, pulse o vórtice três vezes e coloque 100 microlitros por poço de uma placa de 96 poços de baixa fixação, dividindo as gemas na proporção de um para quatro. Verifique ao microscópio para visualizar células dissociadas flutuando livremente.Em seguida, coloque a placa de cultura em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em uma cadeira de balanço em velocidade média. A dissecção cuidadosa de embriões de camundongos em e10.5 do corno uterino deve produzir embriões intactos em PBS para posterior dissecção. O trato gastrointestinal pode ser removido com eficiência do embrião, permitindo o discernimento do broto pancreático dorsal na junção do intestino e do estômago.Em meios de organogênese, essas células livres de andaimes flutuantes se automontam e se organizam em pancreatóides tridimensionais que crescem e persistem por pelo menos 10 dias em cultura. A aplicação de um ativador da proteína quinase C em altas concentrações altera a morfologia dos pancreatoides em desenvolvimento, levando a células epiteliais fracamente associadas e aumento da ramificação. Além disso, o uso de animais transgênicos permite a visualização das células à medida que se diferenciam em tempo real.Para avaliar a associação do tecido mesenquimal pancreático com células epiteliais pancreáticas, a imunomarcação pode ser realizada para marcadores de cada tecido. A imunocoloração de um marcador ductal com um marcador endócrino e núcleos revela a formação de múltiplas linhagens em pancreatoides. Um marcador de mesênquima co-corado com um marcador progenitor pancreático mostra que o mesênquima envolve o pancreatoide.O desenvolvimento de células beta é revelado pela coloração do marcador epitelial e do marcador de células beta. Usando análise quantitativa de PCR, transcritos de progenitores e células diferenciadoras podem ser avaliados, como genes progenitores e marcadores diferenciados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente uma hora, incluindo o tempo de preparação, se for executada corretamente.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a dissecção para obter tecido pancreático de 10,5 camundongos para gerar pancreatóides. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de remover cuidadosamente o trato gastrointestinal dos embriões, caso contrário, será muito difícil encontrar o broto pancreático. Após este procedimento, outros métodos como GSIS e ELISA podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quanta insulina ou peptídeo C é produzida após a estimulação da glicose.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para explorarmos as consequências morfológicas da ativação da PKC usando pequenas moléculas. Uma forma de implementar ainda mais este sistema para estudar o efeito do fator de expressão de transcrição e até mesmo para realizar importantes experimentos de epistasia.

generation-scaffold-free-three-dimensional-insulin-expressing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

A tridimensionais ensaio clonogênica que permite pancreático-como progenitores de se diferenciar em insulina expressar colônias é descrito. Este método tira vantagem de semi-sólido mídia contendo fatores Matrigel metilcelulose, e crescimento, no qual progenitores única proliferam e se...

Uma análise quantitativa para expressar Insulin-formadoras de colônias Progenitores

Aqui, nós descrevemos um método para a cultura de isolamento e manipulação de pâncreas de rato embrionário. Isto representa uma...

Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

O método de cultura tridimensional descrito neste protocolo recapitula o desenvolvimento do pâncreas dispersos progenitores rato pâncreas embrionárias, incluindo a sua expansão substancial, a diferenciação ea morfogênese em um órgão ramificada. Este método é passível de imagiologia, interferência funcional e a manipulação do nicho.

In Vitro Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores

Em ensaios de colónias in vitro para a detecção de auto-renovação e diferenciação de células progenitoras isoladas a partir de pâncreas de murino adulto são concebidos. Nestes ensaios, progenitores pancreáticas dar origem a colónias de células no espaço 3-dimensional em meio semi-sólido contendo metilcelulose. Protocolos para a manipulação de células individuais e caracterização de colónias individuais são descritos.

In Vitro Colony Os ensaios para a caracterização de células progenitoras Tri-potentes Isolado das adultas murino Pâncreas

Este protocolo demonstra isolamento de manchas murinas e semeadura em um andaime decelularizado. As ilhotas suportadas em andaimes foram transplantadas para a almofada de gordura epididimática de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ). As ilhotas sobreviveram no local do transplante e revertearam a condição hiperglicêmica.

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em proteína de pâncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células para a geração de linhagens pancreáticas baseiam no crescimento não-colônia tipo monocamada de dissociou células únicas. Este método é adequado para produzir células hPSC-derivado homogêneas, a manipulação genética e rastreio.

Eficiente geração de pâncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ Posterior Foregut/pancreático progenitores de hPSCs em culturas de adesão

O presente protocolo descreve um método aprimorado para aumentar a co-expressão dos fatores de transcrição PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em monocamadas planares. Isto é conseguido reabastecendo a matriz fresca, manipulando a densidade celular e dissociando as células endodérmicas.

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em precursores de células beta pancreáticas em um sistema de cultura 2D

A diferenciação de células-tronco em ilhotas fornece uma solução alternativa ao tratamento convencional do diabetes e à modelagem da doença. Descrevemos um protocolo detalhado de cultura de células-tronco que combina um kit de diferenciação comercial com um método previamente validado para auxiliar na produção de ilhotas derivadas de células-tronco secretoras de insulina em um prato.

Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Humanas em Aglomerados de Ilhotas Produtoras de Insulina

Este artigo apresenta um protocolo para diferenciação dirigida e análise funcional de células semelhantes a células β. Descrevemos as condições e passagens ideais de cultura para células-tronco pluripotentes humanas antes de gerar células pancreáticas produtoras de insulina. A diferenciação em seis estágios progride desde a formação definitiva da endoderme até células funcionais semelhantes às células β que secretam insulina em resposta à glicose.

Protocolo Otimizado para Geração de Células Funcionais Secretoras de Insulina Pancreáticas a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.

Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos

Aprenda a gerar pancreatoides 3D de progenitores pancreáticos de mouse e10.5 expressando insulina sem andaime. Este método utiliza mesênquima para estudar a formação de células endócrinas em ambiente complexo.

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

Explorar mais vídeos