Name: Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Aprenda a técnica de perfilamento de polissomos para analisar o engajamento de mRNAs com ribossomos em Leishmania, células humanas e tecido de rato. Este método permite estudar a regulação da síntese proteica.

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Os autores agradecer Ching Lee ajuda com gravação de áudio. A pesquisa foi apoiada pelos fundos de start-up da Texas Tech University Centro de Ciências da saúde e pelo centro de excelência de neurociência translacional e terapêutica (Miocardite) concede PN-Miocardite 2017-05 AKHRJDHW a A.L.K.; em parte, pela concessão de NIH R01AI099380 K.Z. James C. Huffman e Kristen R. Baca foram estudiosos CISER (centro para a integração da haste Educação & pesquisa) e foram apoiadas pelo programa.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Fracionamento de polysome por gradiente de sacarose combinado com RNA e proteína análise de frações é um poderoso método para analisar o status translacional de mRNAs individuais ou a translatome toda, bem como funções de fatores de proteína regulação traducional máquinas durante o estado fisiológico ou doença normal. Perfil polysomal é uma técnica especial apropriada para estudar Regulamento translacional em organismos como tripanossomatídeos incluindo Leishmania onde controle transcricional é em grande parte a...

Regulação da expressão gênica em células é controlada por mecanismos transcriptional, posttranscriptional e pós-traducional. Avanços no sequenciamento de RNA profundo permitam o estudo dos níveis de mRNA de estado estacionário no genoma escala em um nível sem precedentes. No entanto, descobertas recentes revelaram que nível de mRNA de estado estacionário não sempre se correlaciona com a produção de proteína1,2. O destino de uma transcrição individual é muito complexo e depende de muitos fatores, como estímulos internos/externos, stress, etc. Regulação da expressão gênica durante a síntese de proteína fornece outra camada de controle de expressão necessária para uma resposta rápida na mudança de condições. Polysome (ou "polyribosome") de criação de perfil, a separação e visualização de ativamente traduzir ribossomas, é um poderoso método para estudar a regulação da síntese de proteínas. Embora, suas primeiras aplicações experimentais apareceram na década de 19603, polysome perfil é atualmente uma das técnicas mais importantes na proteína tradução estudos4. MRNAs único pode ser traduzidos por mais de um ribossoma, levando à formação de um polysome. As transcrições podem ser paralisadas em ribossomas com cicloheximida5 e mRNAs contendo números diferentes de polissomos podem ser separados no processo de fracionamento de polysome por ultracentrifugação gradiente de sacarose6,7 , 8 , 9. análise de RNA de frações polysomal então permite a medição de mudanças nos Estados translacionais de mRNAs individuais no genoma-larga escala e durante diferentes condições fisiológicas4,7, 10. o método também tem sido usado para revelar os papéis de 5' UTR e 3' UTR sequências no controle do mRNA Traduzibilidade próprios11, examinar o papel dos miRNAs em repressão traducional12, descobrir defeitos na biogênese Ribossoma13 e compreender o papel das proteínas Ribossoma-associados com doenças humanas14,15. Durante a última década, um crescente papel para regulação da expressão gênica durante a tradução emergiu que ilustra a sua importância em doenças humanas. A evidência para controle de translação em câncer, metabólica e doenças neurodegenerativas é esmagadora15,16,17,18. Por exemplo, a desregulação do controle traducional eIF4E-dependente contribui para autismo relacionados com os défices15 e FMRP está envolvido em empatar de ribossomos na mRNAs ligados ao autismo14. Assim, polysomal de criação de perfil é uma ferramenta muito importante para estudar os defeitos no Regulamento translacional em várias doenças humanas.
Análise de proteínas de frações polysomal sob diferentes condições fisiológicas disseca a função dos fatores associados a ribossomas durante a tradução. A técnica de polysome de perfil tem sido usada em muitas espécies, incluindo leveduras, células de mamíferos, plantas e protozoários10,19,20,21. Protozoários parasitas como o Trypanosoma e Leishmania exibem limitado controle transcricional da expressão do gene. Seus genomas são organizadas em clusters de gene policistrônico que falta a transcrição regulada promotor22. Em vez disso, a expressão gênica no desenvolvimento é predominantemente controlada ao nível da tradução de proteínas e estabilidade do mRNA em Trypanosomatidae espécie23,24. Portanto, a compreensão do controle translacional na ausência de regulamento transcriptional é particularmente importante para estes organismos. Perfil polysomal é uma ferramenta poderosa para estudar posttranscriptional regulação da expressão gênica em Leishmania25,26,,27,28.
Os recentes progressos na detecção de níveis de mRNAs individuais pelo real tempo PCR quantitativo (RT-qPCR) e transcriptoma completa por sequenciamento de próxima geração, bem como tecnologias de proteômica, traz a resolução e as vantagens de polysomal perfil a um novo nível. A utilização desses métodos pode ser estendida ainda mais através da análise das frações de polysomal individuais por sequenciamento de RNA profundo combinado com análise proteômica para monitorar o status de translação de células na escala do genoma. Isto permite a identificação de novos jogadores moleculares regulamenta tradução sob diferentes condições fisiológicas e patológicas. Aqui, apresentamos um polysome universal de perfil protocolo usado em três modelos diferentes: o parasita Leishmania major, culturas de células humanas e tecidos animais. Apresentamos o Conselho sobre a preparação de lisados celulares de organismos diferentes, otimização das condições de gradiente, escolha de inibidores de RNase e aplicação de RT-qPCR, Western blot e eletroforese de RNA para analisar frações de polysome neste estudo.

<table><tbody><tr><td>Instruments:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gradient master</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>108</td><td></td></tr><tr><td>Fracionador de Gradiente de Pistão</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>Colecionador de frações</td><td>Gilson, Inc.</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>Nikon microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2-FL / Ts2</td><td></td></tr><tr><td>2720 Termociclador</td><td>Applied Biosystems da Life Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de CO2</td><td>Panasonic Healthcare Co.</td><td>MCO-170A1CUV</td><td></td></tr><tr><td>HERATHERM Incubadora</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028063</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de Segurança Biológica, classe II, tipo A2</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-543-400</td><td></td></tr><tr><td>Freezer</td><td>Revco Technologies Revco Technologies</td><td>ULT1386-5-D35</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L8-M Ultracentifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>L8M-70</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de Ultracentrífuga SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de caçamba oscilante</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ângulo fixo</td><td>Eppendorf</td><td>F-45-30-11</td><td></td></tr><tr><td>Quant Studio 12K Flex Máquina de PCR em tempo real 285880228</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4470661</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td><forte>Software&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Triax&nbsp;</td><td>Biocomp Instrumentos Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Materiais:</forte></td>Lâminas de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>contagem, câmara dupla para contador de células</td> Tubo de microcentrífuga <td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Tubos de centrífuga policlear</td> abertos <td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>, (14 mm x 89 mm)</td>Seringa <td>Seton Scientific</td><td>7030</td><td></td></tr><tr><td>, 5 mL</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa 309646 BD 3 mL23 Gauge 1 polegada Agulha</td><td>BD</td><td>10020439</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Placa de superfície, 14 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Placa de superfície, 9 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene unidade de filtro de fluxo rápido de 90 mm, 500 mL, 0,2 aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 75 cm3</ frascos sup></td><td>Thermo Scientific</td><td>130193</td><td></td></tr><tr><td>Nunc tubos de centrífuga cônicos de 50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Ambion da Life Technologies</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1378-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Médio-alto glicose (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F0926-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (P/S)</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfato tampolado salino ( DPBS)</td> <td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2x6H2O)</td> <td>Acros Organics</td><td>AC413415000</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td> <td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 (NP-40)</td> <td>Fluka (Sigma-Aldrich)</td> <td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de ribonuclease Rnasin recombinante</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sal de sódio</td><td>Sigma</td><td>H3993-1MU</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini inibidores de protease livre de EDTA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>Água</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma</td><td>C7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific</td><td>194002</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de Etídio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético dissódico desidratado (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S316-212</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Life Technologies</td><td>22600050</td><td></td></tr><tr><td>Dicloridrato de puromicina</td><td>Sigma</td><td>P8833-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3KG</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hgh Capacidade cDNA Kit de transcriptase reversa</td><td>Applied Biosystems por tecnologias de vida</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems por tecnologias de vida</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Potássio (KOH)</td><td>Sigma</td><td>221473-500G</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-RPL11</td><td>Abcam</td><td>ab79352</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo da proteína ribossômica S6 (C-8)</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-74459</td><td></td></tr><tr><td>1xM199</td><td>Sigma</td><td>M0393-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de lítio</td><td>Sigma</td><td>L-9650</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Buffer II</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM8546G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético (TCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A322-100</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS substrato quimioluminescente</td><td>Thermo Scientific</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L5750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato de sal dissódico hidrato (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A1852-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Citosina 5'-trifosfato de sal dissódico hidrato (CTP)</td><td>Sigma</td><td>C1506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Uridina 5'-trifosfato de sal trissódico hidrato (UTP)</td><td>Sigma</td><td>U6625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Guanosina 5'-trifosfato de hidrato de sal de sódio (GTP)</td> <td>Sigma</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polimerase</td><td>NEB</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfatase</td><td>Sigma</td><td>I1643-500UN</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

polysome de criação de perfil em leishmania, células humanas e testículo de rato

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Expressão de proteínas adequada na hora certa e na quantidade certa é a base da função celular normal e sobrevivência em um ambiente de rápida mudança. Por um longo tempo, os estudos de expressão do gene foram dominados pela pesquisa sobre o nível transcricional. No entanto, os níveis de estado estacionário de mRNAs não se correlacionam bem com a produção de proteína, e a Traduzibilidade dos mRNAs próprios varia muito dependendo das condições. Em alguns organismos, como o parasita Leishmania, a expressão da proteína é regulada principalmente no nível de translação. Estudos recentes demonstraram que essa proteína tradução hipotalâmica é associada com câncer, metabólica, neurodegenerativas e outras doenças humanas. Polysome de criação de perfil é um poderoso método para estudar o Regulamento de tradução da proteína. Permite medir o status translacional de mRNAs individuais ou examinar tradução na escala do genoma. A base desta técnica é a separação de polissomos, ribossomos, suas subunidades e mRNAs gratuito durante a centrifugação de uma citoplasmática lisados através de um gradiente de sacarose. Aqui, apresentamos um polysome universal de perfil protocolo usado em três modelos diferentes - parasita Leishmania major, culturas de células humanas e tecidos animais. Células de Leishmania crescem livremente em suspensão e culturas de células humanas crescem em monocamada aderente, enquanto o testículo de rato representa uma amostra de tecido animal. Assim, a técnica é adaptada a todas estas fontes. O protocolo para a análise das frações polysomal inclui detecção de níveis de mRNA individuais por RT-qPCR, proteínas por Western blot e análise de RNAs ribossomal por eletroforese. O método pode ser novamente prorrogado por exame de mRNAs associação com o ribossoma num nível transcriptoma por RNA-seq profunda e análise de proteínas associadas Ribossoma por espectroscopia de massa das frações. O método pode ser facilmente ajustado para outros modelos biológicos.

Neste estudo, descrevemos a aplicação da técnica de criação de perfil polysomal de três fontes diferentes: o parasita Leishmania major, culturas de células humanas e testículo de rato. Células de Leishmania crescem livremente nos meios líquidos em suspensão, culturas de células humanas crescem em monocamada a aderente em placas, e o testículo de rato representa uma amostra de tecido. O método pode ser facilmente ajustado para outros tipos de células cultivadas livremente...

O objectivo geral da técnica de criação de perfil de polysome é análise da actividade translacional de mRNAs individuais ou mRNAs transcriptome durante a síntese de proteína. O método é importante para estudos de regulamento de síntese de proteínas, ativação de tradução e repressão em saúde e várias doenças humanas.

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

O objetivo geral desta técnica é estudar o envolvimento de mRNAs individuais com polissomos durante a tradução. O perfil de polissomos é uma tecnologia poderosa para estudar o envolvimento do mRNA com ribossomos e polissomos. A técnica é importante para estudos de regulação da síntese de proteínas, ativação da tradução e repressão.Aqui nossa equipe apresenta as técnicas de fracionamento polissômico e análise de frações no exemplo de três organismos. Parasita Leishmania major, células humanas cultivadas e um tecido animal. Essa abordagem consiste em quatro etapas principais: preparação de lisado, preparação e ultracentrifugação do gradiente de sacarose, fracionamento de polissomos e coleta de amostras.Análise das frações. Células de diferentes fontes são coletadas, lavadas e lisadas em tampão de lise por passagem por uma agulha ou homogeneizador Dounce. A centrifugação é usada para remover os detritos celulares, clarificando o lisado.Um gradiente contínuo de sacarose é formado pela mistura de soluções de sacarose de 10% e 50% em um gradiente. O lisado é carregado no topo do gradiente. A ultracentrifugação separa os mrNAs associados a diferentes números de ribossomos.Que é monitorado

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um ensaio de parasita resgate e transformação com células infectadas...

Um parasita Ensaio de Resgate e Transformação de Triagem leishmanicida contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotas em THP1 linha celular humana aguda Monocytic Leucemia

Aqui, descrevemos um método para analisar mudanças na iniciação da tradução do mRNA de células eucarióticas em resposta a condições de estresse. Este método baseia-se na separação de velocidade em gradientes de sacarose de traduzindo ribossomas de ribossomas não traduzindo.

Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

A capacidade das células de se adaptarem ao estresse é crucial para sua sobrevivência. A regulação da tradução do mRNA é uma dessas estratégias de adaptação, proporcionando uma regulação rápida do proteoma. Aqui, fornecemos um protocolo padronizado de perfil de polissoma para identificar mRNAs específicos que são traduzidos seletivamente sob condições de estresse.

Avaliação da Seletiva mRNA Tradução em células de mamíferos por polissoma Profiling

Este protocolo descreve um método fácil de extrair e fracionar transcritos de tecidos vegetais com base no número de ribossomos ligados. Permite uma estimativa global da atividade de tradução e a determinação do status translacional de mRNAs específicos.

Um método fácil para a planta polysome Profiling

Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar polysome de criação de perfil em coração isolado de rato perfundido. Nós descrevemos os métodos para análise das frações no que diz respeito a mRNAs, miRNAs e o proteome polysome polysome, polysome de criação de perfil e perfusão do coração.

Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão

Aqui, nós apresentamos um protocolo de eCLIP para determinar alvos principais do RNA de candidatos do RBP no testis.

Método avançado da imunoprecipitação da reticulação (eCLIP) para a identificação eficiente do RNA proteína-ligado no testis do rato

Aqui apresentamos um método multiplexado de sequenciamento de mRNA de célula única para perfilar a expressão gênica em tecidos embrionários de camundongos. O método de sequenciamento de mRNA de célula única baseada em gotículas (scRNA-Seq) em combinação com estratégias multiplexing pode perfilar células únicas a partir de várias amostras simultaneamente, o que reduz significativamente os custos de reagente e minimiza os efeitos experimentais do lote.

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

O desenvolvimento do cérebro mamífero requer o controle adequado da expressão genética no nível da tradução. Aqui, descrevemos um sistema de perfil polisso com uma plataforma de gradiente e fracionamento de sacarose fácil de montar para avaliar o status translacional de mRNAs no cérebro em desenvolvimento.

Análise da tradução no cérebro do rato em desenvolvimento usando perfil polino

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

Aqui, descrevemos a metodologia usada para gerar cepas de L. panamensis e L . donovani expressando o gene para eGFP como um transgene integrado estável usando o sistema pLEXSY. Os parasitas transfectados foram clonados por diluição limitante, e os clones com maior intensidade de fluorescência em ambas as espécies foram selecionados para uso posterior em ensaios de triagem de drogas.

Desenvolvimento de Cepas de Espécies de Leishmania com Expressão Constitutiva de eGFP

Aqui apresentamos uma avaliação longitudinal de hamsters dourados infectados intraperitonealmente (IP) ou via intragengival (IG) com L. infantum-Luc por imagem bioluminescente e por PCR. Os hamsters foram avaliados 1 dia após a infecção (1 dpi), 1 semana após a infecção (8 dpi) e 3 semanas após a infecção (22 dpi) e eutanasiados aos 50dpi e 8 meses após a infecção.

In vivo Imagem de hamsters infectados por Leishmania infantum por inoculação gengival de amastigotas axênicas expressando luciferase

Aprenda a técnica de perfilamento de polissomos para analisar o engajamento de mRNAs com ribossomos em Leishmania, células humanas e tecido de rato. Este método permite estudar a regulação da síntese proteica.

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

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