Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

O objetivo geral desta técnica é estudar o envolvimento de mRNAs individuais com polissomos durante a tradução. O perfil de polissomos é uma tecnologia poderosa para estudar o envolvimento do mRNA com ribossomos e polissomos. A técnica é importante para estudos de regulação da síntese de proteínas, ativação da tradução e repressão.

Aqui nossa equipe apresenta as técnicas de fracionamento polissômico e análise de frações no exemplo de três organismos. Parasita Leishmania major, células humanas cultivadas e um tecido animal. Essa abordagem consiste em quatro etapas principais: preparação de lisado, preparação e ultracentrifugação do gradiente de sacarose, fracionamento de polissomos e coleta de amostras.

Análise das frações. Células de diferentes fontes são coletadas, lavadas e lisadas em tampão de lise por passagem por uma agulha ou homogeneizador Dounce. A centrifugação é usada para remover os detritos celulares, clarificando o lisado.

Um gradiente contínuo de sacarose é formado pela mistura de soluções de sacarose de 10% e 50% em um gradiente. O lisado é carregado no topo do gradiente. A ultracentrifugação separa os mrNAs associados a diferentes números de ribossomos.

Que é monitorado por um Detector UV durante o fracionamento, formando espectros absorventes distintos. Preparação de lisado. Existem algumas diferenças na preparação do lisado dependendo da fonte.

Após a preparação do lisado, os procedimentos são idênticos, independentemente da origem da amostra. Preparação de lisado citoplasmático de Leishmania major. Coloque as células de Leishmania major em 30 mililitros de meio na densidade de 100.000 células por mililitro.

Esta etapa é realizada em um gabinete de biossegurança. Colocar o frasco com cultura de Leishmania na incubadora e cultivar células a 27 graus Celsius, até à fase logarítmica. Geralmente leva cerca de dois dias para crescer.

As células de Leishmania major são facilmente visíveis ao microscópio. Adicione cicloheximida à cultura de Leishmania cultivada até uma concentração final de 100 microgramas por mililitro, para deter ribossomos em mRNAs traduzidos. Coloque as células de volta na incubadora por dez minutos a 27 graus Celsius.

Após a conclusão do tratamento com cicloheximida, transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros e gire-o 1.800 g por 8 minutos. Descarte o sobrenadante. Lave as células com 30 mililitros de pbs e centrifugue.

Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células num mililitro de pbs. Pegue uma alíquota de células e misture-a com a solução de formaldeído. Em seguida, conte as células por hemocitômetro.

Transfira o número desejado de células para o tubo de microcentrífuga. Gire as células a 1.800 g por 8 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de lise contendo inibidores de protease e RNAsin. Passe as células por uma agulha de calibre 23 três vezes. Depois de passar pela agulha, o lisado torna-se transparente.

Centrifugar a 11, 200 g durante dez minutos a quatro graus Celsius para clarificar o lisado. Transferir o lisado clarificado para um novo tubo de microcentrífugas e mantê-lo no gelo até à ultracentrifugação do gradiente de sacarose. Preparação de lisado citoplasmático a partir de células humanas cultivadas.

Cultive células HeLa em uma placa grande na incubadora a 37 graus Celsius, com 5% de CO2. Adicione cicloheximida às células HeLa cultivadas até a concentração final de 100 microgramas por mililitro para deter os ribossomos nos mRNAs traduzidos. Incube as células por dez minutos a 37 graus Celsius com 5% de CO2.

Aspire o meio e lave a placa no gelo duas vezes com pbs frio. Adicione 500 microlitros de tampão de lise à placa e raspe as células. Transfira as células lisadas para o tubo de microcentrífugas.

Passe as células por uma agulha de calibre 23 três vezes. Centrifugar a 11, 200 g durante oito minutos para clarificar o lisado. Após a centrifugação, mova os tubos no gelo e transfira o sobrenadante para o novo tubo.

Pegue uma alíquota, dilua-a e meça a absorbância a 260 nanômetros usando uma nano gota. Se houver várias amostras, ajustar os lisados à mesma densidade óptica e mantê-los congelados até à ultracentrifugação do gradiente de sacarose. Preparação de lisado citoplasmático de testículo de camundongo.

Disseque o testículo do camundongo. Faça uma pequena incisão na túnica albugenia e colete os túbulos seminíforos do testículo e transfira-os no tubo cônico contendo cinco mililitros de pbs. Misture o tecido vigorosamente.

E deixe o tecido assentar no gelo por cinco minutos. Remova o tampão e lave-o com pbs mais duas vezes. Transferir os túbulos seminíferos para um tubo de dois mililitros e centrifugá-los a 500 g durante um minuto.

Remova o sobrenadante. Adicione tampão de lise de 500 microlitros aos túbulos e use uma pipeta para romper o tecido. Transfira a suspensão para um homogeneizador de pequeno volume.

Rompa o tecido com sete a oito golpes do pilão de vidro. Transferir o lisado para um tubo de microcentrífuga. Centrifugar a amostra a 12 000 g a quatro graus Celsius durante oito minutos para limpar o lisado.

Transfira o sobrenadante para um novo tubo e mantenha-o no gelo. Em seguida, prossiga com a preparação do gradiente de sacarose. Preparação do gradiente de sacarose.

Coloque um tubo de ultracentrífuga no microbloco e desenhe a linha ao longo do nível superior do bloco. Em seguida, transfira o tubo para um rack estável. Pegue uma seringa de dez mililitros, com o dispositivo de estratificação acoplado e encha a seringa com solução de sacarose a 10%.

Solte-o suavemente no fundo do tubo de ultracentrífuga até que a solução de sacarose atinja a marca. Encha outra seringa com solução de sacarose a 50% e insira cuidadosamente seu dispositivo de estratificação através da camada de sacarose a 10% até o fundo do tubo. Solte suavemente a solução de sacarose, começando do fundo até atingir a marca no tubo.

Em seguida, sele o tubo com a tampa fornecida. Para preparar o gradiente de sacarose, ligue o dispositivo de criação de gradiente. Em seguida, nivele a placa usando os botões para cima ou para baixo e pressione concluído.

Depois de nivelar a chapa, pressione grad. Vá para a lista de menu de gradiente e selecione o rotor SW41. Em seguida, escolha o gradiente de sacarose desejado.

Pressione usar. Coloque o suporte do tubo da base magnética no gradiente. Em seguida, transfira o tubo para o suporte.

Até seis gradientes podem ser preparados ao mesmo tempo. Pressione executar. O criador de gradiente gira os tubos na velocidade e nos ângulos do programa, formando um gradiente linear.

Levará apenas alguns minutos para preparar o gradiente. Quando o processo estiver concluído, coloque o tubo em um rack. Remover o volume, igual ao volume da amostra, da parte superior dos tubos de ultracentrifugação com gradientes de sacarose.

Carregue cuidadosamente 500 microlitros do lisado por cima. Coloque os tubos em baldes de rotor e equilibre-os. Centrifugar a 260 000 g durante duas horas a quatro graus Celsius.

Fracionamento de polissomos e coleta de amostras. Após a ultracentrifugação, coloque os tubos nos baldes do rotor sobre o gelo. Ligue o coletor de frações e o fracionador.

Clique em digitalizar no menu do fracionador. Coloque um rack com tubos de coleta no coletor de frações. Encha um reservatório de enxágue, na lateral do fracionador, com água deionizada.

Pressione a tecla de enxágue por dez segundos para enxaguar a bomba. Conecte um adaptador de enxágue com a seringa cheia de água ao pistão para a calibração. Abra o software fracionador no computador.

Pressione calibrar. Use a configuração padrão e pressione Ok.Be pronto para injetar água da seringa. Pressione Ok para fazer a calibração.

Comece imediatamente a injetar água pelos próximos cinco segundos. O sinal Calibração zero concluída aparecerá. Remova um adaptador de enxágue com a seringa e prenda uma ponta ao pistão do fracionador.

Abra a válvula de ar de latão e pressione a tecla de ar por dez segundos para secar a tubulação de ar e a célula de fluxo. Feche a válvula de ar. Pegue o tubo gradiente da caçamba do rotor e coloque-o no rack.

Aplique a tampa do suporte do tubo na parte superior do tubo e mova cuidadosamente o tubo para dentro do suporte do tubo e trave-o. Coloque o suporte sob o pistão. Freqüentemente, bandas polissomais podem ser vistas a olho nu.

Introduza as configurações desejadas para números de fração e volume. Nomeie o arquivo e pressione Ok, depois vá para o botão do gráfico. Na próxima janela, pressione iniciar digitalização.

As configurações aparecerão e pressione Ok.O coletor se moverá da calha para a primeira fração e o pistão se moverá para dentro do tubo. Quando o pistão atingir o topo do gradiente, ele diminuirá para a velocidade selecionada e as frações serão coletadas. Normalmente, coletamos 24 frações a 500 microlitros cada.

Quando concluído, o pistão se moverá para fora do tubo de gradiente. Abra a válvula de ar de latão. Pressione a tecla air no fracionador para recuperar a última fração.

No final da corrida, você verá o perfil de absorbância do gradiente. Análise das frações. As frações obtidas podem ser usadas para análise de RNA e proteína.

O RNA pode ser analisado por eletroforese seguida de Northern Blot ou usado para produção de cDNA, seguido de reação RT-qPCR para analisar a associação de mRNAs individuais com polissomos. O sequenciamento de próxima geração pode ser usado para analisar o status translacional de mRNAs em uma escala de transcriptoma. Para análise de proteínas de frações polissomais, as proteínas são precipitadas com ácido tricluricedico para concentrá-las.

Em seguida, as proteínas são analisadas por Western Blotting ou por Mass Spec no nível do proteoma. Resultados. Aqui apresentamos os resultados do fracionamento de polissomos e análise dos exemplos de três organismos. Leishmania, células humanas cultivadas e tecido de camundongo.

fracionamento de polissomos foi usado para estudar a associação de mRNA de Sherp e Tubulina com ribossomos durante a tradução e Leishmania major. O gráfico de absorbância para o fracionamento tem uma forma distinta com picos típicos para as subunidades de ribossomos 40S e 60S, monossomas 80S e polissomos. Alíquotas das frações foram combinadas em três grupos.

Pré-polissomos, polissomos leves e polissomos pesados. Os níveis relativos de mRNA foram estudados por PCR quantitativo em tempo real. Os dados sugerem que o mRNA da tubulina é traduzido ativamente.

Como foi principalmente associado a polissomos pesados e leves. Enquanto a tradução do mRNA Sherp é menos ativa. Foi encontrado principalmente em associação com pré-polissomos e polissomos leves.

Assim, este experimento demonstra claramente a capacidade da técnica de estudar um envolvimento individual de mRNA na tradução. Esta figura apresenta um gráfico de absorbância típico do fracionamento do polissoma das células HeLa. As proteínas foram concentradas por precipitação com ácido tricloroacético a 10%.

A pequena subunidade de proteína ribossômica RPS6 e a grande subunidade de proteína ribossômica RPL11 foram detectadas por Western Blot. Sua distribuição correlacionou-se bem com os picos distintos, no espectro de absorbância. Nesta figura, apresentamos um exemplo da detecção de RNAs ribossômicos por eletroforese em polissomos fracionados do testículo de camundongo. Conclusões.

O perfil polissômico é uma técnica versátil que pode ser usada para analisar o estado translacional de mRNAs individuais, examinar proteínas associadas ao ribossomo e estudar a regulação translacional em diferentes organismos modelo sob diferentes condições.