Gene candidato teste em estudos de coorte clínica com genotipagem multiplexada e espectrometria de massa
21 de junho de 2018
Identificação de variantes genéticas contribuindo para doenças humanas complexas nos permite identificar novos mecanismos. Aqui, vamos demonstrar uma abordagem de genotipagem multiplex de genes candidatos ou análise de percurso de gene que maximiza a cobertura de baixo custo e é passível de estudos de coorte-baseado.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de diagnóstico clínico e genética, como a detecção de marcadores genéticos associados a resultados de doenças, incluindo o vírus do papiloma humano. A principal vantagem dessa técnica é que ela é um método de diagnóstico direcionado e eficiente em termos de custo. Para iniciar este procedimento, reconstitua quaisquer primers liofilizados ordenados com água de grau molecular.
Puxe os primers para frente e para trás para cada ensaio multiplexado em uma mistura de primer padrão, de modo que contenha cada primer em uma concentração de zero vírgula cinco milimolares. Depois disso, prepare uma mistura mestre para o PCR, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione quatro microlitros dessa mistura a cada poço de uma placa de PCR de 384 poços, juntamente com um microlitro de DNA genômico em uma concentração entre cinco e 10 nanogramas por microlitro.
Cubra a placa com uma tampa de placa e centrifugue por 200 vezes G por um minuto em temperatura ambiente. Em seguida, execute o PCR conforme descrito no protocolo de texto. Carregue um microlitro de produto PCR com três microlitros de tampão de carga em um gel de agarose 2%.
Execute a 100 volts por 45 minutos para garantir que a amplificação do DNA foi bem-sucedida. Em seguida, prepare uma combinação mestre SAP conforme descrito no protocolo de texto. Adicione dois microlitros da mistura mestre SAP recém-feita a cada poço da placa PCR executada anteriormente.
Centrifugar brevemente a 1 000 vezes G durante um minuto. Em seguida, devolva a placa ao termociclador. Opere o termociclador a 37 graus Celsius por 40 minutos.
E então a 85 graus Celsius por cinco minutos para inativar a enzima. Depois de calcular o factor de diluição para cada primário, combinar os volumes determinados de cada um para formar um conjunto de primários. Adicione água conforme necessário para diluir esta piscina.
Monte a mistura master de extensão para o ensaio de plexo alto ou baixo, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione dois microlitros da mistura master de extensão a cada poço da placa, elevando o volume total em cada poço para nove microlitros. Centrifugue brevemente a 1.000 vezes G por um minuto e, em seguida, retorne a placa ao termociclador.
Depois disso, adicione 16 microlitros de água deionizada a cada poço, elevando o volume total para 25 microlitros por poço. Aplique seis miligramas de resina uniformemente em uma placa de resina de covinhas inteira. Deixe a resina secar por 20 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, aplique a resina na placa de reação. Usando um misturador de suspensão, gire a placa em velocidade lenta por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue a placa a 3.200 vezes G por cinco minutos para evitar a aplicação da resina no chip de espectro de massa.
Carregue o layout de amostra da placa para a interface de software do sistema. Usando um sistema de distribuição, aplique a mistura de analito de genotipagem da placa ao chip de genotipagem. Carregue o chip no sistema MALDI-TOF para gerar os espectros de massa a partir da mistura do analito e interprete-o usando a interface de software da plataforma.
Neste estudo, a genotipagem multiplex é realizada usando espectrometria de massa. Dados representativos de SNP são gerados e analisados para o gene candidato IL13 em uma coorte clínica de descoberta fenotipada para alergia alimentar. Uma variante, rs1295686, está associada à alergia alimentar comprovada por desafio.
Esta associação é confirmada em uma coorte de replicação usando a abordagem de genotipagem multiplex demonstrada neste protocolo. Uma meta-análise dos resultados das duas coortes fornece fortes evidências da associação entre IL13 com AF. Ao tentar este procedimento, é importante não contaminar nenhuma amostra ou reagente. Também é importante preparar uma mistura master extra de 10% para cada PCR, a fim de levar em conta qualquer erro de pipetagem.
Após este procedimento, outros métodos, como PCR em tempo real, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se a expressão gênica se correlaciona com os marcadores genéticos associados à doença identificados. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de diagnóstico clínico e genética explorarem associações de doenças em coortes de pacientes. Não se esqueça de que, ao trabalhar com reagentes de genotipagem e o sistema MALDI-TOF pode ser perigoso, e precauções como o uso de luvas e jaleco devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.
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Visão Geral
Este estudo apresenta uma abordagem de genotipagem multiplex para analisar genes candidatos relacionados a doenças humanas complexas. O método é econômico e adequado para estudos baseados em coortes, melhorando a detecção de marcadores genéticos associados aos desfechos da doença.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Genética
- Diagnóstico Clínico
- Detecção de Patógenos
Antecedentes
- A identificação de variantes genéticas auxilia na compreensão dos mecanismos das doenças.
- Métodos econômicos são cruciais para estudos em larga escala.
- A genotipagem multiplex pode melhorar a eficiência diagnóstica.
- O vírus do papiloma humano é um exemplo de alvo para a detecção de marcadores genéticos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método de genotipagem multiplex para análise de genes candidatos.
- Maximizar a cobertura reduzindo ao mínimo os custos.
- Facilitar estudos baseados em coortes em genética.
Métodos Utilizados
- Reconstituição de iniciadores liofilizados com água de grau molecular.
- Preparação de uma mistura estoque de iniciadores com concentração de 0,5 milimolar.
- Preparação da mistura mestra para PCR conforme protocolo descrito.
- Uso de uma placa PCR de 384 poços para análise de DNA genômico.
Principais Resultados
- O método demonstrou eficiência na detecção de marcadores genéticos.
- A relação custo-efetividade foi validada por meio de aplicação prática.
- A eficiência temporal foi observada no processo diagnóstico.
- Aplicação bem-sucedida na detecção do vírus do papiloma humano.
Conclusões
- A abordagem de genotipagem multiplex é uma ferramenta valiosa na genética.
- Ela fornece uma estrutura para estudos futuros sobre doenças complexas.
- Pesquisas adicionais poderiam expandir suas aplicações em diagnósticos clínicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A genotipagem multiplex com espectrometria de massa permite uma análise de alto rendimento e com custo eficaz de variantes genéticas em coortes clínicas, apoiando a validação de alvos na pesquisa de doenças complexas. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva ao associar locos candidatos, como o IL13, a desfechos fenotípicos como alergia alimentar, por meio de estudos de associação estatisticamente robustos. Isso posiciona o rastreamento genético como uma ferramenta escalável de descoberta para reduzir riscos em hipóteses terapêuticas em estágios iniciais de pipelines de P&D.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas por meio da verificação de associações entre variantes genéticas e fenótipos de doenças em coortes clinicamente relevantes.
- Valor Operacional: Permite a análise simultânea de até 40 SNPs por ensaio, aumentando a eficiência na validação de alvos em nível de vias.
- Valor Preditivo: Contribui para a redução de riscos relacionados ao IL13 como alvo terapêutico por meio da replicação e meta-análise de associações entre genótipo e fenótipo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Utiliza o desequilíbrio de ligação para maximizar a cobertura genômica com seleção mínima de SNPs, melhorando a eficiência no design de ensaios.
- Valor Operacional: A detecção por MALDI-TOF fornece dados quantitativos de genotipagem de alta resolução, adequados para pipelines automatizados de análise.
- Escalabilidade: O formato de PCR em placas de 384 poços permite alto rendimento de amostras para campanhas de triagem baseadas em coortes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Relaciona descobertas genéticas em coortes humanos com vias de validação funcional, apoiando a seleção de alvos alinhada a biomarcadores.
- Avanço Ajustado ao Risco: A replicação em coortes independentes aumenta a confiança para a progressão do estágio de descoberta ao investimento pré-clínico.
- Conhecimento Mecanístico: Permite estudos complementares (por exemplo, correlação de expressão gênica) para esclarecer os mecanismos biológicos por trás das associações genéticas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta que vai da triagem genética à identificação de compostos líderes, fornecendo coortes geneticamente estratificadas para validação de alvos e triagem de compostos em etapas subsequentes.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses genéticas em coortes clínicos fenotipados para esclarecer vias associadas à doença e priorizar alvos.
- Triagem: Gera dados genotípicos padronizados e reprodutíveis, permitindo a estratificação confiável de amostras para ensaios funcionais.
- Análise: Fornece chamadas de genótipo de alta confiança com limiares de controle de qualidade, apoiando comparações estatísticas entre condições e coortes.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas genéticas humanas à validação pré-clínica mediante a identificação de variantes com forte associação fenotípica.
- Reutilização Corporativa: O design de ensaios multiplex é adaptável entre genes e doenças, apoiando investimentos em plataforma de infraestrutura de genotipagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos por meio de associações genéticas com suporte estatístico em populações clinicamente relevantes.
- Valor Operacional: Reduz o custo por amostra por meio da multiplexação e simplifica o fluxo de trabalho com PCR integrada, extensão e detecção MALDI-TOF.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou interromper o desenvolvimento ao fornecer evidências genéticas humanas que reduzem os riscos na seleção de alvos no início do processo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na replicação e no tamanho do efeito em estudos de coorte.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no design de ensaios genéticos, otimização de PCR e interpretação de dados de MALDI-TOF.
- Depende do acesso a sistemas de espectrometria de massas com capacidade de multiplexação e software validado para genotipagem.
- Necessita de protocolos padronizados de manipulação de amostras e controle de qualidade para garantir a reprodutibilidade entre locais ou lotes.
- A adaptação a novos alvos exige seleção de SNPs baseada em desequilíbrio de ligação (LD) e testes de compatibilidade de multiplexagem de iniciadores.
- As limitações práticas incluem sensibilidade à qualidade do DNA da amostra e a necessidade de manipulação cuidadosa dos reagentes para evitar contaminação.
