Um modelo In Vitro para estudar o efeito da terapia fotodinâmica 5 ácido aminolevulínico-mediada no biofilme de Staphylococcus aureus
16 de abril de 2018
Este manuscrito descreve um protocolo para estudar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica 5-aminolevulínico mediada por ácido (ALA-PDT) sobre um biofilme de Staphylococcus aureus . Este protocolo pode ser usado para desenvolver um modelo in vitro para estudar o tratamento de biofilmes bacterianos com PDT no futuro.
O objetivo geral deste experimento é avaliar o efeito antimicrobiano do ácido cinco aminolevulínico ou da terapia fotodinâmica mediada por ALA em um biofilme de Staphylococcus aureus. Este método pode responder a perguntas-chave no campo do biofilme bacteriano de como o reparo celular fotodinâmico pode ser usado como um tratamento alternativo para controlar infecções por biofilme. Uma vantagem desse procedimento é que ele tem potencial para ser usado por outras bactérias com ajustes mínimos.
Para gerar um biofilme em uma placa de 96 poços, primeiro inocule um Staphylococcus aureus USA menos 80 graus Celsius ThOD EUA trezentos em três culturas de cepas clínicas formando biofilme em tubos individuais de fundo redondo de 14 mililitros contendo cinco mililitros de caldo de soja triptona, ou TSB, médio, em uma incubadora de 37 graus Celsius com agitação durante a noite. Quando as culturas atingirem a fase estacionária, centrifugue as células bacterianas e ressuspenda os pellets e PBS a duas vezes 10 elevado à nona unidade formadora de colônias por mililitro de concentração. Diluir essas suspensões bacterianas na proporção de um para 200 e meio TSB suplementado com zero vírgula cinco por cento de glicose e semear 200 microlitros de células bacterianas por poço em três poços por cepa por grupo experimental em uma microplaca de 96 poços tratada com cultura de células de poliestireno por uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius, com oxigênio, sem tremer.
No dia seguinte, lave suavemente os poços três vezes com PBS sem perturbar os biofilmes. Em seguida, adicione 200 microlitros de ALA recém-preparado aos poços experimentais apropriados e coloque a placa a 25 graus Celsius por uma hora protegida da luz. Em seguida, irradie a placa com um diodo emissor de luz a uma intensidade de luz de 100 miliwatts por centímetro quadrado por uma hora.
Para contar o número de bactérias viáveis por grupo no final do tratamento de fototerapia, lave suavemente cada poço três vezes com PBS para remover quaisquer células não aderentes. Em seguida, use uma ponta de pipeta para raspar as bactérias aderentes do fundo de cada poço. Puxe as células de cada grupo para um tubo eppendorf por condição experimental e peletize as células por centrifugação.
Ressuspenda os pellets em um mililitro de enzima pancreatina a 0,25% e PBS para uma incubação de 90 minutos a 37 graus Celsius, seguida de outra centrifugação. Ressuspenda os pellets em 200 microlitros de PBS e faça de uma a 10 diluições em série de cada grupo, adicionando cinco microlitros de amostra diluída em série em placas individuais de ágar triptona de soja. Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius por 16 horas e conte o número de colônias bacterianas por grupo.
Avaliar os biofilmes por microscopia confocal de varredura a laser gerar e irradiar os biofilmes conforme demonstrado. Lave os biofilmes irradiados com PBS e core as células vivas e mortas com um mililitro de um corante permeável à membrana celular nuclear fluorescente verde e cromossômica procariótica e um mililitro de um iodeto de propídio micromolar, respectivamente. Após 20 minutos, remova o excesso de mancha e obtenha imagens dos biofilmes por microscopia confocal de varredura a laser sob uma lente objetiva de imersão em óleo de 63 vezes 1,4 NA.
A viabilidade das bactérias do biofilme diminui após o duplo tratamento com fototerapia com ALA em comparação com a viabilidade bacteriana do biofilme controle único ou não tratado e todas as quatro cepas testadas. A visualização dos biofilmes por microscopia confocal de varredura a laser confirma esse achado, com a maioria das células positivas para iodeto de propídio observadas no grupo de duplo tratamento com fototerapia com ALA. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que toda a manipulação de bactérias tratadas com ALA deve ser realizada no escuro, e o biofilme do material deve ser manuseado com cuidado para evitar perturbar o biofilme formado.
Esta mensagem pode ser aplicada para explorar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica no biofilme bacteriano in vitro pelos pesquisadores no campo da infecção bacteriana.
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Visão Geral
Este manuscrito descreve um protocolo para estudar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica mediada por ácido 5-aminolevulínico (ALA-PDT) sobre um biofilme de Staphylococcus aureus. Este método pode responder perguntas fundamentais no campo dos biofilmes bacterianos sobre tratamentos alternativos para o controle de infecções por biofilmes.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Microbiologia
- Terapia Fotodinâmica
- Pesquisa em Biofilme
Contexto
- Staphylococcus aureus é um patógeno comum associado a infecções por biofilmes.
- A terapia fotodinâmica (PDT) é um tratamento que utiliza compostos ativados pela luz para matar bactérias.
- O ácido 5-aminolevulínico (ALA) é um precursor na síntese de fotossensibilizadores utilizados na PDT.
- Este estudo tem como objetivo desenvolver um modelo in vitro para testar a ALA-PDT em biofilmes bacterianos.
Objetivo do Estudo
- Avaliar o efeito antimicrobiano da PDT mediada por ALA sobre biofilmes de Staphylococcus aureus.
- Explorar o potencial da PDT como tratamento alternativo para infecções por biofilmes.
- Estabelecer um protocolo que possa ser adaptado para outras cepas bacterianas.
Métodos Utilizados
- Inoculação de Staphylococcus aureus em caldo triptona soja (TSB) para formação de biofilmes.
- Incubação das culturas a 37 graus Celsius para atingir a fase estacionária.
- Centrifugação e ressuspendão das células bacterianas em PBS.
- Seeding das células bacterianas em uma microplaca de 96 poços para tratamento com PDT.
Resultados Principais
- O protocolo gera com sucesso biofilmes adequados para testar a PDT-ALA.
- A PDT-ALA demonstrou efeitos antimicrobianos potenciais contra biofilmes de Staphylococcus aureus.
- O método pode ser adaptado para outras cepas bacterianas com ajustes mínimos.
- São necessários estudos adicionais para otimizar as condições de tratamento.
Conclusões
- A PDT com ALA é uma abordagem promissora para o tratamento de biofilmes bacterianos.
- Este estudo fornece uma base para pesquisas futuras em terapia fotodinâmica.
- Compreender os mecanismos da PDT pode levar a estratégias de tratamento aprimoradas para infecções relacionadas a biofilmes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo in vitro permite a avaliação mecanicista da terapia fotodinâmica (PDT) para infecções associadas a biofilmes, um desafio crescente no desenvolvimento de agentes antimicrobianos. Ao quantificar unidades formadoras de colônias e visualizar a viabilidade por meio de microscopia confocal, o ensaio fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para reduzir os riscos de candidatos à PDT já nos estágios iniciais da descoberta. A plataforma apoia a validação de alvos e a identificação de compostos promissores para estratégias anti-biofilme, particularmente relevantes para Staphylococcus aureus e outros patógenos formadores de biofilme.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia a hipótese terapêutica da eficácia da PDT com ALA contra biofilmes de S. aureus por meio da redução de UFC e coloração de viabilidade.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional do alvo ao associar a ativação do fotossensibilizador aos mecanismos de eliminação bacteriana em um modelo de biofilme controlado.
- Valor Preditivo: Apoia decisões pré-clínicas de prosseguir ou não ao demonstrar efeitos antimicrobianos dependentes de dose e tempo sob condições padronizadas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera biofilmes maduros e reprodutíveis de S. aureus em formato de placa de 96 poços, adequados para triagem em alto rendimento de compostos em PDT.
- Saída Quantitativa: Fornece contagens de UFC e dados de microscopia confocal como leituras complementares para avaliação da potência do composto e da penetração no biofilme.
- Reutilização da Plataforma: Adaptável a outras cepas bacterianas e fotossensibilizadores com mínimas alterações no protocolo, permitindo ampla aplicação em triagens anti-infecciosas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela infecções clínicas relevantes por biofilmes de S. aureus, conectando achados in vitro à validação pré-clínica de agentes anti-infecciosos baseados em PDT.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece o mecanismo da PDT por meio de coloração de células vivas/mortas, reduzindo ambiguidades nas vias de erradicação de biofilmes.
- Continuidade Tradutiva: Apoia decisões de avanço ao fornecer dados reprodutíveis de inibição de biofilmes em múltiplas cepas e repetições experimentais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta de antibacterianos, desde a validação do alvo até a otimização do composto líder e os testes de eficácia pré-clínica, especialmente para modalidades direcionadas a biofilmes.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses mecanicistas de desagregação de biofilme induzida por PDT e perda de viabilidade bacteriana em um modelo fisiologicamente relevante.
- Triagem: Permite a avaliação padronizada de fotossensibilizadores e parâmetros de dose de luz para atividade anti-biofilme.
- Análises: Fornece métricas de redução de UFC e de viabilidade baseadas em fluorescência para comparar condições de tratamento e orientar relações estrutura-atividade.
- Pesquisa Translacional: Conecta a inibição de biofilme in vitro a modelos de eficácia pré-clínica por meio de desfechos quantificáveis e reprodutíveis.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma modular de PDT para biofilme aplicável a múltiplos alvos patogênicos e quimiotipos de fotossensibilizadores.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista nas interações entre PDT e biofilmes por meio da visualização direta e quantificação da eliminação bacteriana.
- Valor Operacional: Oferece um fluxo de trabalho padronizado e protegido da luz, com etapas definidas de incubação, irradiação e leitura, garantindo reprodutibilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhora a confiança na decisão de avançar ou interromper o desenvolvimento de candidatos à PDT, fornecendo dados precoces de eficácia em um modelo de biofilme clinicamente relevante.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de programas de PDT ao identificar compostos com comprovada penetração em biofilmes e atividade antimicrobiana.
Considerações de Implementação
- Exige expertise em técnicas microbiológicas, cultivo de biofilmes e protocolos de segurança fotobiológica.
- Depende de equipamentos com exposição controlada à luz (por exemplo, medidor de irradiância LED) e microscopia de fluorescência ou leitora de placas para leituras de UFC e imagens.
- Requer padronização da preparação de ALA, do tempo de incubação e da administração de luz entre os grupos experimentais para garantir reprodutibilidade.
- A adaptação a outras cepas bacterianas pode exigir otimização das condições de formação de biofilme e da eficiência de captação do fotossensibilizador.
- Limitação prática: a suscetibilidade do biofilme pode variar conforme a fase de crescimento e a composição da matriz, exigindo controles rigorosos em estudos comparativos.
