Um modelo In Vitro para estudar o efeito da terapia fotodinâmica 5 ácido aminolevulínico-mediada no biofilme de Staphylococcus aureus

O objetivo geral deste experimento é avaliar o efeito antimicrobiano do ácido cinco aminolevulínico ou da terapia fotodinâmica mediada por ALA em um biofilme de Staphylococcus aureus. Este método pode responder a perguntas-chave no campo do biofilme bacteriano de como o reparo celular fotodinâmico pode ser usado como um tratamento alternativo para controlar infecções por biofilme. Uma vantagem desse procedimento é que ele tem potencial para ser usado por outras bactérias com ajustes mínimos.

Para gerar um biofilme em uma placa de 96 poços, primeiro inocule um Staphylococcus aureus USA menos 80 graus Celsius ThOD EUA trezentos em três culturas de cepas clínicas formando biofilme em tubos individuais de fundo redondo de 14 mililitros contendo cinco mililitros de caldo de soja triptona, ou TSB, médio, em uma incubadora de 37 graus Celsius com agitação durante a noite. Quando as culturas atingirem a fase estacionária, centrifugue as células bacterianas e ressuspenda os pellets e PBS a duas vezes 10 elevado à nona unidade formadora de colônias por mililitro de concentração. Diluir essas suspensões bacterianas na proporção de um para 200 e meio TSB suplementado com zero vírgula cinco por cento de glicose e semear 200 microlitros de células bacterianas por poço em três poços por cepa por grupo experimental em uma microplaca de 96 poços tratada com cultura de células de poliestireno por uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius, com oxigênio, sem tremer.

No dia seguinte, lave suavemente os poços três vezes com PBS sem perturbar os biofilmes. Em seguida, adicione 200 microlitros de ALA recém-preparado aos poços experimentais apropriados e coloque a placa a 25 graus Celsius por uma hora protegida da luz. Em seguida, irradie a placa com um diodo emissor de luz a uma intensidade de luz de 100 miliwatts por centímetro quadrado por uma hora.

Para contar o número de bactérias viáveis por grupo no final do tratamento de fototerapia, lave suavemente cada poço três vezes com PBS para remover quaisquer células não aderentes. Em seguida, use uma ponta de pipeta para raspar as bactérias aderentes do fundo de cada poço. Puxe as células de cada grupo para um tubo eppendorf por condição experimental e peletize as células por centrifugação.

Ressuspenda os pellets em um mililitro de enzima pancreatina a 0,25% e PBS para uma incubação de 90 minutos a 37 graus Celsius, seguida de outra centrifugação. Ressuspenda os pellets em 200 microlitros de PBS e faça de uma a 10 diluições em série de cada grupo, adicionando cinco microlitros de amostra diluída em série em placas individuais de ágar triptona de soja. Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius por 16 horas e conte o número de colônias bacterianas por grupo.

Avaliar os biofilmes por microscopia confocal de varredura a laser gerar e irradiar os biofilmes conforme demonstrado. Lave os biofilmes irradiados com PBS e core as células vivas e mortas com um mililitro de um corante permeável à membrana celular nuclear fluorescente verde e cromossômica procariótica e um mililitro de um iodeto de propídio micromolar, respectivamente. Após 20 minutos, remova o excesso de mancha e obtenha imagens dos biofilmes por microscopia confocal de varredura a laser sob uma lente objetiva de imersão em óleo de 63 vezes 1,4 NA.

A viabilidade das bactérias do biofilme diminui após o duplo tratamento com fototerapia com ALA em comparação com a viabilidade bacteriana do biofilme controle único ou não tratado e todas as quatro cepas testadas. A visualização dos biofilmes por microscopia confocal de varredura a laser confirma esse achado, com a maioria das células positivas para iodeto de propídio observadas no grupo de duplo tratamento com fototerapia com ALA. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que toda a manipulação de bactérias tratadas com ALA deve ser realizada no escuro, e o biofilme do material deve ser manuseado com cuidado para evitar perturbar o biofilme formado.

Esta mensagem pode ser aplicada para explorar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica no biofilme bacteriano in vitro pelos pesquisadores no campo da infecção bacteriana.