Name: Um modelo In Vitro para estudar o efeito da terapia fotodinâmica 5 ácido aminolevulínico-mediada no biofilme de Staphylococcus aureus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Aprenda a avaliar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica mediada por ácido 5-aminolevulínico em biofilmes de Staphylococcus aureus. Este protocolo in vitro oferece uma alternativa promissora para o controle de infecções associadas a biofilmes bacterianos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi financiado pela natureza nacional Science Foundation da China para jovens estudiosos (n º 81300810), programa de treinamento de Shanghai jovem médico (n º 20141057) e Nacional Natural Science Foundation da China (81671982, 81271791 e 81571955). Gostaríamos de agradecer LetPub (www.letpub.com) para fornecer assistência linguística durante a preparação deste manuscrito.

1. formação de biofilmes
<ol><li>
Formação de biofilmes em microplacas de 96 poços
	<ol>
<li>Recuperar a cepa S. aureus USA300 e 3 formadoras de biofilme clínicas cepas (C1 - C3) armazenadas a-80 ° C. Nota: A capacidade das estirpes clínicas para formar biofilmes foi determinada pelo ensaio de placa de microtitulação descrito anteriormente15.</li>
		<li>Inocular a bactéria num meio de caldo (TSB) 5ml triptona soja e cultivar em uma incubadora com agitação a 37 ° C durante a noite para a fase estacionária.</li>
		<li>Centrifugar a cultura bacteriana durante a noite a 4.000 x g durante 10 minutos a 25 ° C e em seguida, descartar o sobrenadante. Resuspenda as pelotas em solução salina tamponada fosfato (PBS) a uma concentração final de 2,0 x 109 UFC/mL. Nota: A concentração das bactérias foi estimada através da medição de densidade óptica e mais determinada pela placa contar16, revelando que 1 OD600 de suspensão contida 1,5 x 108 UFC/mL.</li>
		<li>Diluir a suspensão bacteriana a 1: 200 (1.0 x 107 UFC/mL) em meio TSB contendo 0,5% de glicose. Inocule 200 µ l de suspensão bacteriana em cada poço de uma microplaca de 96 poços poliestireno celular-cultura-tratados.</li>
		<li>Incube a microplaca estaticamente a 37º C por 24 h sob um ambiente bem oxigenado. Nota: O tempo de incubação para formação de biofilme maduro pode variar para diferentes cepas bacterianas; Isto deve ser determinado antes do PDT experimentar15.</li>
		<li>Descartar os meios de comunicação em poços e lavar os poços da microplaca suavemente com PBS três vezes e em seguida, descartar o sobrenadante. Nota: A etapa deve proceder com muito cuidado para não comprometer o biofilme formado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Formação de biofilmes em pratos
	<ol>
<li>Inocular a cepa S. aureus USA300 em 5 mL de meio TSB e cultivar em uma incubadora com agitação a 37 ° C durante a noite para a fase estacionária.</li>
		<li>Centrifugar a cultura bacteriana durante a noite a 4.000 x g durante 10 minutos a 25 ° C e em seguida, descartar o sobrenadante. Resuspenda as pelotas em PBS para uma concentração final de 2,0 x 109 UFC/mL. Em seguida, diluir a 1: 200, a suspensão bacteriana (1.0 x 107 UFC/mL) em meio TSB contendo 0,5% de glicose. Inocular 2 mL da suspensão bacteriana numa placa de cultura de células de fundo vidro 35mm qualidade óptica e incubar estaticamente a 37 ° C por 24 h. Nota: A concentração das bactérias foi estimada através da medição da densidade óptica.</li>
		<li>Aspirar a mídia com uma pipeta e depois enxaguar os biofilmes no prato suavemente com PBS três vezes e em seguida, descartar o sobrenadante cuidadosamente. Nota: Evite tocar a ponta da pipeta no fundo do prato. O passo 2.2 deve ser realizado imediatamente após esta etapa para impedir a secagem do biofilme formado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. luz da irradiação
<ol><li>Loja 5-ALA em um frigorífico de 4 ° C. Antes do experimento, dilua 5-ALA com PBS a 10 mM. Nota: solução 5-ALA deve ser preparada antes do experimento.</li>
	<li>No grupo experimental, adicione 200 µ l de 10mm ALA a cada poço da microplaca ou 2 mL para o prato de cultura. Cubra o prato/prato com papel alumínio e incubar durante 1 h. Então, irradiar o placa/prato com um diodo emissor de luz (LED) com uma intensidade de luz de 100 mW/cm2 para 1 h atingir uma dose leve de 360 J/cm2 no comprimento de onda principal de 633 ± 10 nm17. Nota: A fim de deixar a energia da luz seja efetivamente e igualmente entregue para o biofilme em todos os poços/pratos, corrigir a distância entre o pico da fonte de luz para o bem/prato a 6,0 cm e limitar a região experimental para a área de irradiação central (10 cm x 8 cm). para garantir que os resultados são reprodutíveis, os experimentos devem ser executados na mesma sala de temperatura. Na etapa de irradiação LED, para evitar a exposição direta da placa para outras fontes de luz, como luz solar, iluminação do quarto ou do lamplight, o LED foi ativado antes de mover o placa/prato para a área de irradiação, e a luz foi brilhante o suficiente para concluir a operação.</li>
	<li>Configurar os grupos de controle (grupos de controle de três foram criados em nossa experiência).<ol>
<li>Para o primeiro controle de grupo (ALA - LED-), adicionar 200 µ l de PBS a cada poço do microplate, ou 2 mL para o prato de cultura. Cubra o prato/prato com papel alumínio e incube-lo por 2 h.</li>
		<li>Para o segundo grupo de controle (ALA + LED-), adicionar 200 µ l de 10mm ALA a cada poço do microplate, ou 2 mL para o prato de cultura. Cubra o prato/prato com papel alumínio e incube-lo por 2 h.</li>
		<li>Para o terceiro grupo de controle (ALA-LED +), adicionar 200 µ l de PBS a cada poço do microplate, ou 2 mL para o prato de cultura. Cubra o prato/prato com papel alumínio e incube-lo por 1 h. Em seguida expor a placa para o LED com 360 J/cm2 luz irradiação no comprimento de onda principal de 633 ± 10 nm17. Nota: Na etapa de irradiação LED, evite a exposição direta da placa para outras fontes de luz, como luz solar, iluminação do quarto ou o lamplight.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. determinação da eficácia do tratamento de PDT
Nota: Para confirmar o efeito de ALA-PDT sobre os biofilmes de S. aureus , a viabilidade das células com ou sem ALA-PDT foi avaliada pela contagem de UFC, bem como pela coloração de viabilidade.
<ol><li>
Determinação das restantes células bacterianas viáveis
	<ol>
<li>Após o tratamento de ALA-PDT, descartar os meios de comunicação em poços e lavar os poços com PBS três vezes para remover todas as células não-aderentes para ambos experimental e grupos de controle. Nota: Esta etapa deve ser efectuada muito suavemente.</li>
		<li>Raspar as células de bactérias aderentes completamente dos poços com a ponta da pipeta e coletar as células nos tubos cónicos.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão bacteriana 4.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C e, em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as bactérias em 1 mL de enzima de pancreatina 0,25% em PBS e incubar a 37 ° C por 1,5 h.</li>
		<li>Centrifugar a 4.000 x g por 10 min; desprezar o sobrenadante e, em seguida, resuspenda o pellet em 200 µ l de PBS.</li>
		<li>Fazer 01:10 diluições em série da solução celular com PBS; em seguida, adicione 5 µ l de cada amostra de diluição serial na placa de agar (TSA) soja triptona. Incubar a placa TSA a 37 ° C durante 16 h; em seguida, conte (pelo olho nu), o número de colônias bacterianas (UFC/mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Observação de S. aureus biofilmes por CLSM
	<ol>
<li>Após a irradiação de luz, lave os biofilmes no prato de cultura com PBS três vezes. Nota: Esta etapa deve ser efectuada muito suavemente.</li>
		<li>Adicione 1 mL de 1 µM verde-fluorescente nuclear e mancha de cromossomo que é permeável às membranas células procarióticas (por exemplo, SYTO9) e 1 mL de iodeto de propidium 1 µM (PI) por 20 min manchar o biofilme, bem como as células mortas.</li>
		<li>Observar células viáveis (verde fluorescência, Ex / Em 485 nm/530 nm) e células mortas (fluorescência vermelha, Ex / Em 485 nm/630nm) sob um CLSM com uma lente objetiva óleo-imersão de 63 X 1.4-at.</li>
		<li>Gere imagens usando o software de microscopia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11257008">Riddle of biofilm resistance.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).</li>
<li>Rabin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+mechanisms+and+targets+for+developing+antibiofilm+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents.</a> Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).</li>
<li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li>
<li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toluidine+blue-mediated+photodynamic+effects+on+staphylococcal+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).</li>
<li>Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effectiveness+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+%28APDT%29+using+a+660+nm+laser+and+malachite+green+dye+in+Staphylococcus+aureus+biofilms+arranged+on+compact+and+cancellous+bone+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens.</a> Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).</li>
<li>Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+using+a+660+nm+laser+and+methyline+blue+dye+for+inactivating+Staphylococcus+aureus+biofilms+in+compact+and+cancellous+bones%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+Photodyn+Ther%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study.</a> Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).</li>
<li>Mai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+effect+of+sinoporphyrin+sodium+photodynamic+therapy+on+Staphylococcus+aureus+planktonic+and+biofilm+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg+Med%22%5BJournal%5D)">The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures.</a> Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).</li>
<li>Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+photodynamic+inactivation+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+by+disruptive+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies.</a> Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).</li>
<li>Baltazar, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+photodynamic+therapy%3A+an+effective+alternative+approach+to+control+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections.</a> Front Microbiol. 6, 202(2015).</li>
<li>Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D'Souza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+novel+approaches+for+control+of+dental+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Current and novel approaches for control of dental biofilm.</a> Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).</li>
<li>De Sordi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Photodynamic+Antimicrobial+Chemotherapy+%28PACT%29+for+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile.</a> PLoS One. 10 (8), e0135039(2015).</li>
<li>Harris, F., Pierpoint, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+based+on+5-aminolevulinic+acid+and+its+use+as+an+antimicrobial+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent.</a> Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).</li>
<li>Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Antifungal photodynamic therapy.</a> Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).</li>
<li>Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+5-aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+on+Candida+albicans+biofilms%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+Photodyn+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study.</a> Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).</li>
<li>Zhang, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-aminolevulinic+acid-mediated+photodynamic+therapy+and+its+strain-dependent+combined+effect+with+antibiotics+on+Staphylococcus+aureus+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm.</a> PLoS One. 12 (3), 0174627(2017).</li>
<li>Chang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single+cell+detection+of+Staphylococcus+aureus+by+aptamer-conjugated+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles.</a> Sci Rep. 3, 1863(2013).</li>
<li>Barra, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+and+Antibiotic+Therapy+in+Combination+to+Fight+Biofilms+and+Resistant+Surface+Bacterial+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections.</a> Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).</li>
<li>St Denis, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+you+need+is+light%3A+antimicrobial+photoinactivation+as+an+evolving+and+emerging+discovery+strategy+against+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease.</a> Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).</li>
<li>O'Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+bacteria+in+multi-species+biofilms+can+be+killed+by+red+light+in+the+presence+of+toluidine+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg+Med%22%5BJournal%5D)">Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue.</a> Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5-aminolevulinic+acid-mediated+photodynamic+therapy+on+antibiotic-resistant+staphylococcal+biofilm%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study.</a> J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Elias, S., Banin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-species+biofilms%3A+living+with+friendly+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Multi-species biofilms: living with friendly neighbors.</a> FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Proof+of+Programmed+5-Aminolevulinic+Acid+Prodrug+Nanocarriers+for+Targeted+Photodynamic+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

PDT tem sido uma terapia estudada para o tratamento de câncer, desde que foi inventado há mais de 100 anos18. Na última década, PDT foi aplicado como uma estratégia antimicrobiana e demonstrou eficácia contra algumas bactérias patogénicas resistentes a antibióticos,12. Comparado ao estado planctônico, biofilmes bacterianos parecem ser mais resistentes ao tratamento com antibióticos3, enquanto o efeito de ALA-PDT em biofilmes não foi totalmente invest...

S. aureus é um importante patógeno Gram-positiva que coloniza a pele e mucosa de hospedeiros humanos. Sua capacidade de forma de biofilmes é considerada um aspecto importante de sua patogênese1. Biofilmes bacterianos são uma comunidade de bactérias incorporado em uma matriz de produção própria, que é composta de substâncias poliméricas extracelulares, incluindo polissacarídeo, DNA e proteínas. Esta matriz desempenha um papel significativo na persistência de infecções bacterianas, contribuindo para um alto grau de resistência ao sistema imunológico humano e terapias antimicrobiana atual2. Os antibióticos são ainda o principal tratamento para infecções de biofilme, embora os efeitos dos antibióticos sobre biofilmes são limitados. Ficou demonstrado anteriormente que as células em biofilmes são 10 a 1.000 vezes mais resistentes a antibióticos em comparação com suas contrapartes planctônicos3. Assim, estratégias alternativas são necessárias para conquistar esse problema.
PDT, uma alternativa de tratamento para infecções bacterianas, usa a luz de um comprimento de onda apropriado para ativar fotossensibilizadores. Isto leva à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), que são letais para as células alvo por perturbar a parede celular, inativando as enzimas e danificar o DNA4. Esta característica multi-alvo torna difícil para que as bactérias desenvolver resistência ao tratamento de PDT.
O efeito antimicrobiano do PDT em biofilmes bacterianos e fungos, com vários fotossensibilizadores, tais como o azul de toluidina, verde de malaquita, azul de metileno, cloro e6 e porfirinas, tem sido estudado em anteriores relatórios5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, um pró-fármaco do fotossensibilizador real, PpIX, caracteriza-se por seu peso molecular pequeno e rápido desembaraço12,14. Estas vantagens dão grande potencial ALA-PDT como uma aplicação terapêutica. Embora o efeito de ALA-PDT em bactérias planctônicas tem sido estudado por muitos grupos de12, o efeito antimicrobiano do ALA-PDT em biofilmes bacterianos ainda não foi elucidado. Entretanto, é difícil comparar os resultados entre os estudos anteriores. Uma das razões é que os diferentes protocolos são usados por diversos grupos. Assim, este protocolo descreve um modelo in vitro de um sistema de ALA-PDT, com base na nossa anterior trabalho15. O efeito deste modelo foi confirmado pelo cálculo do UFC e viabilidade de coloração com CLSM.

<table><tbody><tr><td>Caldo de Soja Triptona (TSB)</td><td>OXOID</td><td>CM0129B</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Soja Triptona (TSA)</td><td>OXOID</td><td>CM0131</td><td></td></tr><tr><td>SYTO9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L7012</td><td>Os Kits de Viabilidade Bacteriana BacLight VIVOS/MORTOS&nbsp;</td></tr><tr><td>Iodeto de propídio (PI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L7012</td><td>Os Kits de Viabilidade Bacteriana BacLight VIVO/MORTO&nbsp;</td></tr><tr><td>Pancreatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3292</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 5-aminolevulínico (ALA)</td><td>Fudan Zhangjiang Bio-Pharm</td><td>3.1</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus cepa USA300</td><td>/</td><td>/</td><td>A fonte dos EUA 300 referências " Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. Setembro de 2009; 64(3):441-6".</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus cepas clínicas (C1-C3)</td><td>/</td><td>/</td><td>Todas as cepas clínicas foram isoladas de pacientes com rinossinusite crônica no Departamento de Otorrinolaringologia-Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Hospital de Olhos e Otorrinolaringologia da Universidade de Fudan [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627].</td></tr><tr><td>Microplaca de 96 poços</td><td>Corning Inc</td><td>3599</td><td>Microplacas de Poliestireno de Fundo Plano Transparente Tratadas com TC, Embaladas Individualmente, com Tampa,</td></tr><tr><td>Fluorado Estéril</td><td>NEST Biotechnology</td><td>801001</td><td>Fundo de Vidro, Tubos Eppendorf Safe-Lock Não Pirogênicos</td></tr><tr><td>, 1.5 mL Eppendorf</td><td></td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga Eppendorf 5417</td><td>Eppendorf</td><td>Z365998 |&nbsp; Incubadora SIGMA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE4000</td><td>MaxQ 4000 Agitadores orbitais de bancada</td></tr><tr><td>Diodo emissor de luz (LED)</td><td>Wuhan Yage Técnica óptica e eletrônica CO</td><td>LED-IB</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td>Leica</tr><tr><td>LAS AF software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMARIS software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo in vitro para estudar o efeito da terapia fotodinâmica 5 ácido aminolevulínico-mediada no biofilme de staphylococcus aureus

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

Staphylococcus aureus (S. aureus) é um patógeno humano comum, que causa infecções sistêmicas e piogênica. S. aureus infecções são difíceis de erradicar, não só devido ao surgimento de cepas resistentes aos antibióticos, mas também sua capacidade de forma de biofilmes. Recentemente, a terapia fotodinâmica (PDT) tem sido indicada como um dos tratamentos possíveis para controlar infecções de biofilme. No entanto, mais estudos são necessários para melhorar o nosso conhecimento de seus efeitos sobre biofilmes bacterianos, bem como os mecanismos subjacentes. Este manuscrito descreve um modelo in vitro do PDT com ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), um precursor do fotossensibilizador real, protoporfirina IX (PpIX). Brevemente, maduras S. aureus biofilmes foram incubados com ALA e em seguida, expostos à luz. Posteriormente, o efeito antibacteriano do ALA-PDT no biofilme de S. aureus foi quantificado calculando as unidades (CFUs) formadoras e visualizado pela viabilidade fluorescente coloração através de laser confocal, microscopia (CLSM). Resultados representativos demonstraram um forte efeito antibacteriano do ALA-PDT sobre biofilmes de S. aureus . Este protocolo é simples e pode ser usado para desenvolver um modelo in vitro para estudar o tratamento de biofilmes de S. aureus com ALA-PDT. No futuro, ela também pode ser referenciada em estudos de PDT, utilizando outros fotossensibilizadores para diferentes cepas bacterianas com ajustes mínimos.

A viabilidade das bactérias nos biofilmes foi diminuída após o tratamento de ALA-PDT quando comparados aos controles (ALA - diodo emissor de luz, ALA + LED - e ALA-LED +) em USA300 e das três estirpes clínicas (Figura 1).
Para confirmar os resultados do UFC ensaio e observam o antibacteriano, efeito de ALA-PDT sobre o S. aureus biofilme em situ, os biofilmes USA300 foram visualizad...

Este manuscrito descreve um protocolo para estudar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica 5-aminolevulínico mediada por ácido (ALA-PDT) sobre um biofilme de Staphylococcus aureus . Este protocolo pode ser usado para desenvolver um modelo in vitro para estudar o tratamento de biofilmes bacterianos com PDT no futuro.

Um modelo In Vitro para estudar o efeito da terapia fotodinâmica 5 ácido aminolevulínico-mediada no biofilme de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a common human pathogen, which causes pyogenic and systemic infections. S. aureus infections are difficult to ...

O objetivo geral deste experimento é avaliar o efeito antimicrobiano do ácido cinco aminolevulínico ou da terapia fotodinâmica mediada por ALA em um biofilme de Staphylococcus aureus. Este método pode responder a perguntas-chave no campo do biofilme bacteriano de como o reparo celular fotodinâmico pode ser usado como um tratamento alternativo para controlar infecções por biofilme. Uma vantagem desse procedimento é que ele tem potencial para ser usado por outras bactérias com ajustes mínimos.Para gerar um biofilme em uma placa de 96 poços, primeiro inocule um Staphylococcus aureus USA menos 80 graus Celsius ThOD EUA trezentos em três culturas de cepas clínicas formando biofilme em tubos individuais de fundo redondo de 14 mililitros contendo cinco mililitros de caldo de soja triptona, ou TSB, médio, em uma incubadora de 37 graus Celsius com agitação durante a noite. Quando as culturas atingirem a fase estacionária, centrifugue as células bacterianas e ressuspenda os pellets e PBS a duas vezes 10 elevado à nona unidade formadora de colônias por mililitro de concentração. Diluir essas suspensões bacterianas na proporção de um para 200 e meio TSB suplementado com zero vírgula cinco por

an-vitro-model-to-study-effect-5-aminolevulinic-acid-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Zhao, K., et al. Um modelo In Vitro para Estudar o Efeito da Terapia Fotodinâmica Mediada por Ácido 5-Aminolevulínico no Biofilme de Staphylococcus aureus . J. Vis. Exp. (2018)O vídeo demonstra um protocolo de terapia fotodinâmica para avaliar os efeitos antibacterianos em biofilmes bacterianos Gram-positivos. Os biofilmes são divididos em quatro grupos: dois recebem um precursor fotosensimizador e dois recebem um tampão. Todos são incubados no escuro, seguidos por exposição à luz...

Tratamento ativado pela luz de biofilmes bacterianos usando um precursor fotosensimizador

Neste vídeo, demonstramos a preparação de biofilme in vitro por S. aureus em uma placa multipoços revestida com poli-L-lisina. A placa formada por biofilme pode ser usada para experimentos a jusante.

Síntese de biofilme in vitro por Staphylococcus aureus

As infecções causadas por cepas bacterianas multirresistentes (MDR) surgiram como uma séria ameaça à saúde pública, necessitando do desenvolvimento de terapias alternativas. Apresentamos um protocolo para avaliar a eficácia da terapia antimicrobiana com luz azul (aBL) para infecções por Acinetobacter baumannii MDR em queimaduras de camundongos usando imagens de bioluminescência.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Therapy luz azul para-multirresistente Acinetobacter baumannii queimadura Infecções Usando bioluminescência Imagiologia

Aqui descrevemos um modelo murino diabético romance utilizando camundongos sem pelos para monitoramento em tempo real, não-invasivo, de infecções de ferida biofilme bioluminescentes Pseudomonas aeruginosa. Esse método pode ser adaptado para avaliar a infecção de outras espécies bacterianas e microrganismos geneticamente modificados, incluindo várias espécies biofilmes e testar a eficácia das estratégias de antibiofilm.

Venha para o lado da luz: In Vivo monitoramento de infecções por Pseudomonas aeruginosa biofilme em feridas crônicas em um modelo murino Hairless diabética

A terapia fotodinâmica (PDT) é um procedimento médico que envolve a incubação de uma forma exógena aplicada fotossensibilizador (PS) seguido de fotoativação de luz visível para induzir apoptose. Apresentamos um protocolo em vitro PDT projetado para simular o PDT que pode ser usado para estudar as diferenças em incubação de PS e parâmetros de tratamento com luz.

Uma abordagem In Vitro para terapia fotodinâmica

As alterações induzidas por antimicrobianos na arquitetura do biofilme de Pseudomonas aeruginosa diferem entre os isolados clínicos cultivados de pacientes com fibrose cística e infecção pulmonar crônica. Após a microscopia confocal, o software COMSTAT pode ser utilizado para quantificar variações na arquitetura do biofilme (por exemplo, área de superfície, espessura, biomassa) para isolados individuais para avaliar a eficácia de agentes anti-infecciosos.

Quantificando os efeitos dos antimicrobianos na arquitetura de biofilme in vitro usando o software COMSTAT

Este fluxo de trabalho pode ser usado para realizar testes de suscetibilidade a antibióticos usando um modelo ex vivo estabelecido de biofilme bacteriano nos pulmões de indivíduos com fibrose cística. O uso deste modelo poderia aumentar a validade clínica dos ensaios de IMC (concentração mínima de erradicação de biofilmes).

Teste de Eficácia de Antibióticos em um Modelo Ex vivo de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus Biofilms no Pulmão da Fibrose Cística

O presente protocolo descreve modificações do microscópio eletrônico de transmissão (MET) com um sistema de iluminação de luz, a fabricação de células líquidas e observações in situ de TEM de interações induzidas pela luz entre células bacterianas e um fotossensibilizador. Os métodos de preparação da amostra, os danos causados pelo feixe de elétrons e as imagens também são discutidos.

Microscopia Eletrônica de Transmissão In Situ Induzida pela Luz para Observação da Interação Matéria-Líquido Mole

O presente protocolo descreve o estudo das interações neutrófilo-biofilme. Os biofilmes de Staphylococcus aureus são estabelecidos in vitro e incubados com neutrófilos humanos derivados do sangue periférico. A resposta de explosão oxidativa dos neutrófilos é quantificada e a localização dos neutrófilos dentro do biofilme é determinada por microscopia.

Ensaios In vitro padronizados para visualizar e quantificar interações entre neutrófilos humanos e biofilmes de Staphylococcus aureus

Este protocolo descreve um método simples e econômico para avaliar a eficácia de potenciais fotossensibilizadores na inativação fotodinâmica antibacteriana (aPDI), usando um formato de placa de 96 poços combinado com uma fonte de luz de painel de LED. Essa abordagem permite o teste simultâneo de várias condições experimentais, incluindo diferentes concentrações, compostos e cepas bacterianas.

Triagem in vitro baseada em LED para avaliação de moléculas fotoativáveis na inativação fotodinâmica bacteriana

Aprenda a avaliar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica mediada por ácido 5-aminolevulínico em biofilmes de Staphylococcus aureus. Este protocolo in vitro oferece uma alternativa promissora para o controle de infecções associadas a biofilmes bacterianos.

Um modelo In Vitro para estudar o efeito da terapia fotodinâmica 5 ácido aminolevulínico-mediada no biofilme de Staphylococcus aureus (Vídeo) | JoVE Journal

Um modelo In Vitro para estudar o efeito da terapia fotodinâmica 5 ácido aminolevulínico-mediada no biofilme de Staphylococcus aureus

Explorar mais vídeos